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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(6): 685-695. |
| Downregulation of Protein Kinase C Isozymes on Cholesteatoma. |
| Nam Pyo Hong, Chang Sik Park, Young Ho Song, Jae Yong Byun, Hwoe Young Ahn, Chang Il Cha |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul, Korea. |
| 중이진주종에서 Protein Kinase C Isozyme의 억제 |
| 홍남표 · 박창식 · 송영호 · 변재용 · 안회영 · 차창일 |
| 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
중이진주종ㆍ신호전달기전ㆍPKC 동위효소ㆍ하향조절ㆍ후전사단계. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The exact pathogenesis of cholesteatoma remains unknown in spite of several theories that have been formulated. The most characteristic histologic finding of cholesteatoma is the proliferation of the squamous cell lining of the lesion. Protein Kinase C (PKC) is a family of phospholipid-dependent serine/threonin protein kinase that sends extracellular signals across the cell surface in order to regulate epithelial cell groweth and differentiation. This study attempted to provide the evidence for the role of PKC in cholesteatoma.
MATERIALS AND METHODS:
Twenty-five cholesteatoma specimens were obtained from patients for western blotting, immunohistochemical study, RT-PCR, and densitometry.
RESULTS:
The results of western blotting revealed that considerably lower levels of PKCalpha, PKCbeta, and PKCepsilon protein were detected in cholesteatoma than in the posterior auricular skin. In the immunohistochemical study, PKCalpha, PKCbeta, and PKCepsilon were detected both in the basal and suprabasal layer of posterior auricular skin, but they were not detectable in cholesteatoma. The results of PCR for PKCalpha, PKCbeta, and PKCepsilon showed that there were no differences between cholesteatoma and posterior auricular skin regarding the mRNA expression.
CONCLUSION:
Downregulation of PKCalpha, PKCbeta, and PKCepsilon in cholesteatoma suggests that abnormal epithelial growth is a possible mechanism of cholesteatoma.
The results suggest the following there is an abnormal signal transduction through the PKC pathway in cholesteatoma: downregulation of PKC takes place in the post-transcription phase, and downregulation of PKC is associated with prolonged chronic inflammation of cholesteatoma. |
| Keywords:
Signal transductionㆍCholesteatomaㆍDownregulationㆍProtein kinase C(PKC) isoenzymeㆍPost-trans-cription |
서론
진주종성 중이염은 만성적인 염증과 재발을 특징으로 하며 주위 골조직을 파괴하여 심한 난청과 치명적인 두개내 합병증을 초래하는 질환으로 그 발생기전 및 병태생리학적 현상에 대하여 그동안 많은 관심과 연구대상이 되어왔다.1-6) 그러나 진주종의 발생기전과 병리생리에 관한 명확한 기전은 아직 확실하게 밝혀지지 않은 상태이며 특히 중이진주종에서의 신호전달체계에 대한 연구는 거의 전무한 실정이다. 세포의 성장과 분화 그리고 변성 등은 한 세포에서 다른 세포로 소위 신호전달체계(signal transduction system)라는 과정을 통해 일어난다.7) 신호전달과정은 외부의 신호가 일차전달물질(first messenger)인 각종 성장인자, 신경전달물질 및 호르몬 등에 의해 세포막에 있는 각각의 독특한 수용체와 결합하고 또한 이러한 결합에 의하여 세포내로 정보가 전달되며 수용체분자의 입체구조에 변화가 초래되어 intracellular domain의 tyrosine kinase가 활성화된다. 이외에도 세포내의 inositol triphosphate, c-AMP, diacylglcerol(이하 DAG로 약함), Ca2+ 등의 이차전달물질(second messenger)을 만들고 이에 따라 protein kinase C(이하 PKC로 약함), phospholipase C(이하 PLC로 약함), G 결합단백질, adenyl cyclase 등의 활성으로 이온교환세포골격의 재배열, 지질막의 변화 및 단백합성 등의 일련의 생화학적 반응이 일어나 결국 세포의 변화, 세포의 과증식, 종양화 변환, 세포이주개시 및 조직호르몬의 분비를 유발하는 과정으로 알려져있다. 7-10) 이 때문에 어떤 질환에서 더욱 특이적인 신호전달기전의 경로를 파악하는 것은 매우 중요하다. 이런 신호전달기전의 하나로 PKC가 작용하게 되는데 PKC의 활성화는 transforming growth factor-α(이하 TGF-α로 약함), epithelial growth factor receptor(이하 EGFR로 약함)의 활성으로 수용체의 intrinsic tyrosine kinase활성을 증가시켜 inositol phospholipid(이하 IP로 약함)형성과 칼슘의 유입, Na ＋/H ＋의 교환, c-fos와 c-myc의 발현 등으로 DNA증가와 세포의 분화 및 세포의 종양화변환을 유발하는 것으로 알려져 있다.7-9)11-15) 그리고 과각화증을 유발하는 경우에도 외부의 자극을 세포내로 전달하는 신호전달체계에 PKC가 관여한다고 알려져 있으며11)12)14) PKC의 동위효소들은 서로 다른 방식의 활성을 가지고 있으며 또한 발현되는 조직의 분포도 서로 다르다.8)11)13)16) 그리고 여러동위효소중에서도 특히 PKCα와 PKCβ 등에 관한 연구는 많다.8)12)13)15)16) 중이진주종은 비정상적으로 과각화증을 중이점막내에서 일으키며 중이진주종상피의 형성과정에 세포의 성장과 분화를 조절하는 유전인자의 이상과 연관될 수 있다는 가설의 보고가 있었다.4) 따라서 본 저자들은 중이진주종상피에서 일어나고 있는 과증식의 성향을 이해하기 위하여 단세포항체를 이용한 면역조직화학염색과 western blot분석을 통하여 PKC 단백질의 변화를 관찰함은 물론 역전사효소중합반응과 발현된 PKC RNA product의 밀도측정을 시행하여 중이진주종에서의 PKC 동위효소의 분포와 PKC 동위효소의 발현을 관찰함으로써 중이진주종에서의 PKC의 역할을 알고저 본 연구를 실시하였다.
대상 및 방법
조직표본
실험에 사용한 조직은 1996년 9월부터 1997년 6월까지 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실에서 진주종성 중이염으로 수술적 치료를 받은 20세 이상의 성인 25명의 환자로부터 수술시 채취한 중이진주종조직을 사용하였다. 음성 대조군으로는 일반 만성 중이염으로 진단받은 10명의 환자에서 수술시 이개후부에서 채취한 피부편을, 양성 대조군으로는 10명의 건선환자의 건선부에서 펀치생검한 조직 10편을 사용하였다. 채취한 조직들은 즉시 isopentane 용액에 액침한 후 -70℃에서 보관하여 사용하였다.
Western blotting
25례의 중이진주종상피와 대조군인 10례의 이개후부의 피부 및 10례의 건선조직 상피를 각각 EBC완충용액(40 μM Tris/HCl, pH 8.0, 120 μM NaCl, 0.5% NP-40, 2 μg/ml aprotinine, 2 μg/ml pepstatin, 2 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml phenylmethysul-fonyl fluoride)을 가한 후 표피파쇄기(Fisher Scientific, Pittsburgh, Philadelphia, U.S.A.)로 분쇄하였다.
분쇄된 조직을 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)용액에 반응시킨 후 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 취하였고 순도를 높이기 위해 다시 15,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상층액을 취하였다. 소의 혈청알부민(Sigma, St. Louis, Missouri, U.S.A.)을 표준액으로 하여 각각의 단백질양을 측정 후 1 mg/ml의 단백질이 되게 SDS sample 완충액(100 nM Tris/HCl, pH 6.8, 200 nM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)을 가하여 100℃에서 5분간 가열하여 시료로 사용하였다. 젤은 5% SDS-polyacrylamide(SDS-PAGE)를 사용하였고, SDS-PAGE를 시행한 후 젤을 30분간 transfer용액으로 평형시키고 nitrocellulose membrane을 완충용액에 30분간 평형시켰다. 이후 western blot용 cassette를 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질은 nitrocellulose membrane으로 전기적인 방법으로 옮긴 후 nitrocellulose membrane을 건조된 여과지에 옮겨놓고 상온에서 건조시켰다. 그 후 nitrocellulose membrane에 단백질이 결합되지 않는 부분을 blocking하기 위해 1% 소의 혈청알부민이 포함된 TBST(Tris buffered saline-Triton X-100) 용액 20 ml에 1시간동안 처리하였으며 완충용액을 제거 후 TBST용액으로 nitrocellulose membrane을 3회 세척하였다. 1：1,000으로 희석한 PKCα 단세포항체(Mouse anti-human PKCα, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.), PKCβ 단세포항체(Mouse anti-human PKCβ, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.), PKCζ 단세포항체(Mouse anti-human PKCζ, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.)의 일차항체용액을 각각 4℃에서 90분간 nitrocellulose membrane에 반응시켰고 항혈청희석용액을 제거 후 TBST용액으로 3회 세척하였다. Goat anti-mouse IgG-alkaline phosphatase를 30분간 실온에서 반응시켰고 10분씩 TBST용액으로 세척한 후 alkaline phosphatase 기질용액을 첨가하여 단백질밴드가 나타날 때까지 진탕하며 반응시켰다.
면역조직화학적염색
-70℃에서 보관된 조직은 Cryocut(Leica, Nussloch, Germany)을 이용하여 6 μm두께의 연속절편으로 제작한 후 double gelatine-coated slide에 부착하였다. 연속절편을 실온에서 30분간 건조 후 cold acetone(-20℃)으로 15분간 고정하였고 다시 실온에서 15분간 건조 후 0.05M PBS에 조직이 부착된 slide를 2분간 반응시켰다. 그 후 조직내의 내성 peroxidase를 제거하기 위하여 0.05M PBS 50ml와 30% H 2O 22 ml에서 slide를 15분간 처리한 다음 0.05M PBS에 10분간 3번 세척하고 일차항체가 들어있는 용액 100∼150 μl(5 mg/ml bovine serum albumin, 1.5% normal horse serum, 0.3% Triton X-100)을 점적하여 wet chamber에서 4℃로 overnight로 반응시켰다. 일차항체용액에서의 반응이 끝나면 조직을 PBS로 10분씩 3번 수세한 후, 2차 항체용액(PBS 18 ml 과 0.3% Tritone X-100 2 ml로 Vectastain kit의 biotinylated anti-mouse IgG를 1：200으로 희석)에서 1시간동안 실온의 wet chamber에서 반응시켰다. 이차항체용액과 반응 후에 PBS로 10분씩 3차례 수세한 후 avidin-biotin-peroxidase complex용액(ABC용액, Vectastain kit의 A 용액 1：100, B용액 1：100, 0.3% Triton X-100＋)으로 1시간동안 실온의 wet chamber에서 반응시켰다. 발색제로는 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, St. Louis, Missouri, U.S.A.)을 사용하였다. 상온에서 3∼4분간 발색반응을 시킨 후 조직을 PBS로 10분씩 3회 수세하여 Hematoxylin으로 대조염색하고 알콜로 탈수하였으며 Xylene으로 투명화한 후 polymount(Polyscience, Warrington, U.S.A.)로 cover하여 광학현미경으로 검사하였다.
일차항체로는 PKCα에 대해서는 PKCα단세포항체(Mouse anti-human PKCα, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.)를, PKCβ에 대해서는 PKCβ 단세포항체(Mouse anti-human PKCβ, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.)를, PKCζ에 대해서는 PKCζ 단세포항체(Mouse anti-human PKCζ, Transduction Laboratories, Lexinton, Kenturky, U.S.A.)를 각각 사용하였다. 각각의 PKC 동위효소의 단세포항체는 1：100으로 희석하여 사용하였다.
비특이성 peroxidase의 반응에 의한 위양성반응을 확인하기 위해 각각 일차항체, 이차항체를 생략하고 염색을 시도하여 양성반응은 모두 특이반응임을 확인하였다.
결과판정은 세포의 세포질이나 핵이 갈색으로 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 염색정도에 따라 갈색이나 진한갈색으로 염색되었으면(＋＋), 연갈색으로 염색되었으면(＋), 염색되지 않았으면(-)로 판정하였다.
관찰방법은 중이진주종상피에서 상피층(epithelial layer)의 가장 아래층을 형성하는 기저세포층, 그 상부의 세포핵을 가진 유극층과 과립층, 각질이 있는 경우는 최상부의 각질층으로 구분하였고 기저세포층 아래부위는 상피하층으로 구분하였다.
RT-PCR(역전사중합효소반응)
RNA 추출
각 조직의 상피층에서의 PKC 동위효소의 검출을 위해 -70℃에서 보관된 조직을 Cryocut(Leica, Nussloch, Germany)로 20 μm두께의 연속절편으로 만들어 slide에 부착하였다. 상피하층을 제거할 목적으로 현미경을 이용하여 상피하층을 제거한 후 상피층만을 취하였다. 상피층을 GSS 용액(guanidine isothiocyanate 250g, 3차 증류수 293ml, 0.75M sodium citrate 17.6ml, 10% sarcosinate 26.4ml)에 2-mercaptoethanol 0.1M을 혼합한 solution D 500 μl와 sodium acetate 50 μl(2 M, pH4.0)를 혼합 후 water-saturated phenol 500 μl, chloroform과 isoamyl alcohol을 24：1로 혼합한 용액 100 μl를 넣어 10초간 진탕 후 15분간 얼음에 방치하였다. 혼합용액을 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액의 4/5를 회수하여 동량의 cold isopropanol 1,000 μl를 넣어 -70℃에서 24시간 침전시켰다. 그 후 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 용액을 제거한 후 RNA pellete를 100% ethanol과 70% ethanol로 세척한 후 30 μl의 RNasefree water에 녹여 260nm에서 densitometer(Pharmacia Biotech, San Francisco, California, U.S.A.)를 이용하여 흡광도를 측정하여 농도를 측정하였다.
c DNA 합성
RNA가 꼬이지 않도록 65℃에서 10분간 보관하였고 미세원침관에 reverse transcriptase 완충액 2 μl, random hexamer(10 pM) 1 μl, AMV-RT 1 μl(10 U/μl), dNTP 1 μl(10 pM), RNase inhibitor 0.5 μl, RNA 1 μg 및 증류수를 첨가하여 42℃에 15분간 반응시켜 역전사하여 cDNA를 형성한 후 densitometer(Pharmacia Biotech, San Francisco, California, U.S.A.)를 이용하여 500ng의 DNA를 얻었다.
Polymerase chain reaction
Primer 제작
House keeping gene은 glyceraldehyde-3-p-dehydrogenase(이하 GAPDH로 약함)를 사용하였고 PKCα, PKCβ, PKCζ의 특이한 증폭에 사용되는 oligonucleotide primer는 각 PKC의 특이한 부위에 따라 DNA synthesizer(Bioneer, Chungwon-koon, Korea)를 이용하였으며 Bioneer(Chungwon-koon, Korea)회사에 의뢰하여 제작하였다. DNA primer의 염기서열은 다음과 같다.
PKC α：sense；5’ GTCGGCAACAAAGTCATCAGTCCCTCTGAAGACAGGAAACAA 3’
antisense；5’ TTTTAACGACTGAAACCCTACACGTTCCTT 3’(524 bp)
PKC β：sense；5’ TTCCTTACACATGCCAAAATCGGCAATCTT 3’
antisense；5’ CAACCAGCAGAAAAGAAGGCCCTGGAACCAAGG 3’(521 bp)
PKC ζ：sense；5’ CTAATGTTTGAGATGATGGCTGGG 3’
antisense；5’ GTATCTGACCCTGAACGACCTCTT 3’(267 bp)
PCR 조건
10x amplification 완충액 10 μl, dNTP혼합용액 5 μl(10 pM), 2 μl의 GAPDH primer 1(10 pM), 2 μl의 GAPDH primer 2(10 pM), template c-DNA 4 μl, H 2O 77 μl 등의 반응 혼합물과 각 c-DNA를 혼합 후 GAPDH primer를 이용하여 한 주기마다 94℃에서 1분간 denaturation과 59℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 polymerization을 시행하여 이런 과정을 30회 반복하였고 마지막 주기는 72℃에서 10분간 polymerization을 시행하여 DNA를 증폭하였다. 최종 추출물 10 μl를 2% agarose gel에 100volt로 10분동안 전기영동을 시행하고 densitometer(Pharmacia Biotech, San Francisco, California, U.S.A.)를 이용하여 각 밴드의 밝기를 정량화하였다. 1차 PCR반응의 결과를 토대로 RNA의 양을 증감하여 모든 GAPDH PCR 산물의 양을 ±10%내로 정량화하였고 target 유전자에 대한 PCR 반응을 시행하여 상대적인 정량화를 시행하였다. 처음 주기는 94℃에서 5분간 denaturation과 59℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 1분간 polymerization을 시행하였다. 다음 주기부터는 94℃에서 45초간 denaturation과 59℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 1분간 polymerization을 시행하고 이런 과정을 25회 반복하였고 마지막 주기는 94℃에서 45초간 denaturation과 59℃에서 45초간 annealing, 72℃에서 10분간 polymerization을 시행하여 DNA를 증폭하였다. 최종 추출물 10 μl를 2% agarose gel에 100volt로 10분동안 전기영동을 시행한 후 densitometer를 이용하여 각 밴드의 밝기를 측정비교하였다.
결과
PKC 동위효소의 western blot분석
중이진주종상피에서의 PKC 동위효소의 발현여부를 위해 실시한 western blot분석에서 후이개피부는 단백질의 농도를 40 μg, 60 μg protein/lane으로 증가시킴에 따라 PKCα, PKCβ, PKCζ에 대해 증가되는 양성발현을 보였다. 그러나 중이진주종상피는 40 μg protein/lane에서는 발현되지 않았고 60 μg protein/lane에서 PKCα만이 미약한 양성발현을 보였다. 건선에서는 PKC 동위효소의 양성발현은 후이개피부보다 감소되어 나타났다(Fig. 1).
PKC 동위효소의 면역조직화학염색
Western blot분석에 의하여 확인된 중이진주종상피에서의 PKC의 감소된 발현양상이 조직 내에서 어떤 분포인지 알아보기 위해 면역조직화학적염색을 실시하였다. 면역조직화학적염색을 시행하기 전에 hematoxylin-eosin염색을 시행하여 조직학적으로 확인하였다.
중이진주종상피에서 각질층과 과립층에서 핵이 존재하여 과증식을 시사하였고, 후이개피부상피에서 보이는 표피능(rete ridge)은 중이진주종상피에서는 관찰할 수 없었다(Fig. 2). 그리고 중이진주종상피의 상피하층에서 많은 염증세포를 확인할 수 있었다(Fig. 2C).
PKCα의 면역조직화학염색에서 후이개피부는 전례(10례)에서 기저세포층에 양성(4례) 및 강양성 면역염색성(6례)을, 유극층은 8례에서, 과립층은 5례에서 면역염색성이 있었고, 전례에서 각질층과 상피하층은 면역염색성이 없었다(Fig. 3A). 건선조직은 10례중 3례는 기저세포층에, 이중 1례는 유극층에, 9례는 과립층에서 면역염색성이 있었고 1례만이 상피하층에 면역염색성이 있었다(Fig. 3B). 중이진주종상피는 전례(25례)에서 상피층에 면역염색성이 없었으나 상피하층은 21례에서면역염색성을 보였다(Fig. 3C). 그리고 건선과 중이진주종상피의 염색강도는 저하되어 있었다(Fig. 3)(Table 1).
PKCβ의 면역조직화학염색에서 후이개피부는 9례에서 기저세포층은 양성(2례) 및 강양성 면역염색성(7례)이 있었고 유극층은 6례에, 과립층은 2례에 면역염색성이 있었으나 전례에서 각질층과 상피하층은 면역염색성이 없었다(Fig. 4A). 건선은 9례가 상피층에서 면역염색성이 없었고, 1례만 기저세포층과 유극층에서 면역염색성이 있었으며 전례에서 상피하층은 면역염색성이 없었다(Fig. 4B). 중이진주종상피는 25례중 22례에서 상피층에 면역염색성이 없었으나 나머지 3례는 기저세포층에, 이중 1례는 유극층에도 면역염색성이 있었고 상피하층은 전례에서 면역염색성이 있었다(Fig. 4C). 그리고 건선조직과 중이진주종상피의 염색강도는 저하되어 있었다(Fig. 4)(Table 2).
PKCζ의 면역조직화학염색에서 후이개피부는 전례에서 기저세포층은 양성(7례) 및 강양성 면역염색성(3례)이 있었고 유극층은 5례에서 면역염색성이 있었지만 전례에서 과립층과 각질층과 상피하층은 면역염색성이 없었다(Fig. 5A). 건선은 9례가 상피층에서 면역염색성이 없었고, 1례만 기저세포층과 유극층에서, 또 다른 1례는 과립층에서, 8례는 각질층에서 면역염색성이 있었고 전례에서 상피하층은 면역염색성이 없었다(Fig. 5B). 중이진주종상피는 25례중 24례에서 상피층에 면역염색성이 없었고 1례는 기저세포층과 유극층에 면역염색성이 있었으며 상피하층은 21례에서 면역염색성이 있었다(Fig. 5C). 그리고 건선조직과 중이진주종상피에서의 염색강도는 저하되어 있었다(Fig. 5)(Table 3).
PKC 동위효소의 역전사중합효소반응
Western blot분석과 면역조직화학적염색에 의하여 확인된 중이진주종에서 PKCα, PKCβ, PKCζ의 감소현상을 검정하고 감소가 발생하는 단계를 알아보기 위하여 역전사중합효소반응을 시행하였다. 후이개피부와 중이진주종상피에서 PKCα, PKCβ, PKCζ의 RNA의 발현을 확인할 수 있었으나(Fig. 6), 후이개피부와 중이진주종상피에서 RNA의 밀도측정은 유의한 차이가 없었다(Table 4).
고찰
중이에 존재하지 않던 각질형성 세포의 증식은 진주종의 발생기원에 관하여 여러 가지 설을 가능하게 하며, 조직학적으로는 피부조직과 유사하지만 생물학적인 특성은 보통의 피부와 같지 않은 양상을 보인다. 1-6)
진주종상피의 가장 특징적인 조직학적 소견은 각질형성세포의 증식이다.5)6) 본 실험결과에서와 같이 중이진주종상피의 전례에서 각질화된 중층편평상피와 상피하층을 관찰할 수 있었고 기질은 아래쪽부터 기저세포층, 유극층, 과립층과 각질층으로 구성되어 있어 Kim6)과 Min5) 등의 보고와 같이 피부조직과 유사함을 알 수 있었다(Fig. 2). 또한 상피하층에서 섬유세포가 관찰되었고 세포의 분포도 후이개상피의 상피하층에 비해 보다 성긴 분포였으며 주위에 대개 만성육아조직으로 이루어져 있음은 물론 육아조직내 많은 수의 다양한 염증세포가 관찰되었다(Fig 2C). 이와 같은 실험결과는 육아조직에 대식세포, 거대세포, 림파구 및 형질세포 등의 다양한 정도의 염증세포들이 있고 이들은 주로 림파구로 구성되어 있으며 단핵구, 거대세포, 호중구 및 호산구 등과 정상 중이점막에서는 관찰되지 않은 염증반응에 의해 발생한 화생성 선상피로 된 선조직과 비만세포, 파골세포 및 화골세포 등이 존재한다는 Kim6) 및 Sade1)의 보고와 일치하였다. 진주종은 상피세포가 과증식된 상태로 각질형성세포에서 형성된 각질이 화학적 이물질로 작용하는 것이 중이진주종이 발생되는 중요한 기전 중 하나이다.2)3) 그러나 진주종의 발생기전과 병태생리에 관한 명확한 기전은 아직 확실하게 밝혀지지 않은 상태이며 특히 중이진주종에서 신호전달체계에 대한 연구는 거의 전무한 실정이지만 어떠한 신호전달체계가 주요 병인으로 작용할 것으로 몇몇 연구자들에 의해 보고되고 있다. 3)4)
생물체가 주위 환경의 자극에 반응하고 생명현상을 유지하기 위해서는 세포사이의 대화가 필요하며 연결물질(ligand)이 세포 표면에 있는 수용체에 결합함으로써 외부의 정보가 세포내로 전달되어진다. 이런 과정이 신호전달(signal transduction)이다.7) 이는 각 조직에서 서로 다른 형태로 일어나며 또한 조직마다 다양성이 있다. 최근에 각질세포의 증식, 분화 및 종양화에 대한 신호 전달기전에 관한 연구가 집중적으로 이루어지고 있다.7) 지금까지 알려진 진주종에서의 신호전달로는 상피성장인자, 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 TGF-α 등의 여러 cytokine이 고막이나 외이도 상피의 기저세포의 수용기에 coupling되어 유발되는 것으로 알려지고 있다. 이러한 외부의 자극은 기저세포내에서 tyrosine kinase를 활성화시키고, 다시 특정한 신호전달경로를 통해 핵내에서 c-jun이나 c-fos 등의 transcription factor의 발현을 통해 DNA의 변화를 초래하는 것으로 보고되고 있으며 4) 이로 인해 세포주기의 변화가 유도되어 세포의 증식도 변하게 되며 이 결과 상피세포는 과증식 성향을 띄게 되어 진주종의 특성을 갖는 것으로 보고되고 있다. 2) 그러나 이것은 아직 일부에서는 가설로만 주장되고 있을 뿐 현재까지 이의 입증을 위한 연구가 계속되고 있다. 특히 중이진주종에서 PKC에 대한 연구가 보고된 바가 없어 본 저자들은 중이진주종 형성에서 PKC의 역할을 알아보고자 하였다.
PKC는 phospholipid-dependent protein kinase의 일종으로 세포외부 신호를 세포막안으로 전달시키는 이차전달물질의 하나로서 8) 세포내의 대사작용에 영향을 미쳐14)17) 세포항상성 유지의 조절에 매우 복잡한 양상으로 관여하고 그 작용이 조직에 따라 서로 다르며 또한 한 조직내에서도 그 효과가 서로 다르게 나타난다.8)17) PKC가 관여하는 여러 기전중 첫번째로 칼슘을 동원하는 수용체들이 PLC를 매개로 하여 IP의 수용체를 매개로 하는 가수분해(receptor-mediated hydrolysis)에 의해 활성화된 세포막의 phosphatidylinositol diphosphate(이하 PIP 2로 약함)를 PIP 3과 DAG로 분해한다. 그리고 PIP 3는 세포내 Ca2+의 동원에 관여하여 세포내 Ca2+을 증가시키는데 관여하며8)13)17) DAG는 직접 PKC를 활성화 시킨다.8)12)15) 이러한 Ca2+과 DAG를 통한 신호전달은 일시적이지만8) 이 2가지를 통한 신호전달체계는 다음의 연속되는 신호전달에 필수적이고 synergic effect를 보인다.8) 그리하여 PKC활성과 Ca2+동원은 유전자발현, 종양화 변환, 세포의 증식 및 분화에 관여하고8) T 세포와 B 세포의 생성,8) Langerhans cell과 이의 항원발현에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.4)15) 두번째 기전은 동원된 Ca2＋을 방출하고 세포막안의 H＋와 세포막외부의 Na＋를 교환하여 세포질의 pH를 증가시켜 정지세포(resting cell)를 유사분열환(mitotic cycle)으로 유도한다.9) 세번째 기전은 phospholipase A 2(이하 PLA 2로 약함)를 억제하는 lipocortin을 PKC가 인산화하여 lipocortin은 억제되며 PLA 2는 증가되어 염증반응을 유발하여 비정상적인 각화증을 나타낸다.7) 또한 PKC의 중요한 특징으로 2가지의 상이한 작용을 가지는데 초기의 단시간내에 DAG에 의한 활성으로 양성상(positive foreward)작용과 이에 뒤따르는 후기의 음성 되먹이기(negative feedback)작용을 가진다.8)11)13)14)16)17) PKC의 강력한 활성형인 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate(TPA)를 투여하면 초기에는 PKC의 활성이 증가되나 계속 투여하면 초기의 작용과는 반대로 PKC는 감소되어 결국 소멸되는 하향조절(downregulation)현상이 있다.18) PKC에 대한 지속적인 자극은 PKC 작용의 지나침(overshoot)을 방지하기 위해 음성상(negative long term)반응을 보이며 PKC의 분해를 유발하여 결국 세포에서 소실된다.12)18) PKC의 하향조절은 신호전달체계의 여러 과정에서 일어나며17) 단기반응으로는 IP의 수용체에 작용하여 수용체를 매개로 하는 가수분해(receprot-mediated hydrolysis)를 억제하고 Ca2+-ATPase와 Na＋-Ca2+교환 단백질을 인산화로 활성화시켜서 정상적인 신호전달동안 증가된 세포질내 Ca2+을 감소시킨다.8)11) 장기반응은 다른 신호전달의 수용체에 작용을 하며8) 특히 EGFR에 PKC로 인산화를 시키면 epithelial growth factor(이하 EGF로 약함)와 EGFR의 친화력은 감소되어 EGF의 기능이 억제되나 PKC의 하향조절에 의한 PKC의 감소로 EGF의 증가를 유발하게된다. 이런 방식으로 자체의 음성되먹이기작용으로 세포에서 PKC의 소실은 결국 부적절한 신호를 전달하여 세포의 증식, 성장 및 분화에 이상을 유발한다.17) 이런 현상은 건선에서 PLC활성도의 증가,10) DAG의 증가, PLA 2 및 EGFR의 증가 등이 관찰되는데 이는 PKC자체의 음성되먹이기작용으로 인한 세포에서 PKC의 소실로 결국 부적절한 신호를 전달하여 세포의 증식, 성장 및 분화에 이상이 초래되어지는 과정이 건선의 병태생리 중 한 기전으로 알려져 있다.7)12-17) PKC 동위효소는 크게 칼슘의존성인 Group A(α, βI, βII, γ), 칼슘 비의존성인 Group C(ζ, ι) 및 Group B(δ, ε, η, θ)로 구분된다. 7)13) 이들은 각기 다른 소학적 성질을 갖고 있어13) 분포는 세포와 조직에 따라 다양하고8)17) 각기 다른 생리적 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.16) 이에 본 저자들은 피부에서 발현되는 PKC 동위효소중 가장 대표적인 PKCα, PKCβ 및 PKCζ를 연구하였다.
본 연구에서는 western blot분석과 면역화학조직검사에서 중이진주종은 PKC 단백질이 미 약하거나 감소되어 있었지만 역전사중합효소반응을 통해 PKC의 유전자발현을 알 수 있어 PKCα, PKCβ 및 PKCζ가 중이진주종과 후이개피부에서 존재함을 알 수 있었다. 그리고 후 이개피부의 상피층은 거의 전례에서 PKCα, PKCβ 및 PKCζ에 대한 면역염색성을 보였지만
중이진주종상피의 상피층은 면역염색성의 저하가 있었다(Figs. 3, 4 and 5) 면역염색성의 전반적인 감소는 western blot에서 PKCα만이 미약한 발현을 보였고(Fig. 1) PKC 동위효소 들의 감소가 있는 것으로 알려진 건선조직 12-17)보다 감소된 소견이었다(Figs. 1, 3, 4 and 5) 그리고 역전사중합효소반응검사에서 중이진주종상피는 PKC 동위효소의 유전자발현이 있음을 확인하였고 RNA의 밀도측정과 정량적 PCR에서는 유전자발현의 변화를 관찰할 수 없었다(Fig. 6)(Table 4). 이와 같은 본 실험결과의 직접적인 원인은 아마도 만성적인 자 극이 중이내에 있어서 자극인자와 세포표면의 수용체와 결합하여 신호전달의 과정이 시작되고 만성적인 자극으로 인하여 PKC 동위효소의 지나침을 막기 위해 PKC 동위효소 자체의 음성되먹이기로 하향조절을 유발하여 PKC 동위효소의 하향조절이 있었던 것으로 생각된다. 또한 이러한 하향조절현상은 단백질의 발현은 감소하고 RNA 발현의 변화가 없는 것으로 보아 후전사단계에서 PKC 동위효소의 감소가 있음을 알 수 있어 중이진주종상피에서 비정상 적인 PKC의 신호전달체계는 과각화증을 유발하는 한 기전이라고 생각된다. 중이진주종에서 지금까지 연구된 결과와 본 연구의 결과를 종합하면 건선에서 일어나는 신호전달체계와 유사한 신호전달체계가 중이진주종에 작용함을 생각해볼 수 있다. 중이진주종에서는 EGFR의 증가, PLC-γ1과 PLC-β1의 증가19)20) 및 PKC의 감소현상이 있는 것을 알 수 있었다. PKC의 전단계의 신호전달과정인 PLC의 과발현 후 PKC의 감소현상은 정량적 PCR을 통하여 PKC의 RNA의 발현을 확인함으로 중이진주종에서 PKC가 발현하지 않는다는 가설은 배제할 수 있었다. 그리고 본 연구의 대조군인 건선조직은 정상피부에 비하여 PKCα, PKCβ 및 PKCζ는 상피층에서 면역염색성이 감소되었을 뿐만 아니라 western blot분석에서 PKCα와 PKCβ단백질이 감소하였고 PKCζ는 이에 비해서 감소된 경향이 적은 것을 보아 PKCα와 PKCβ가 감소하였다는 이전 연구결과와 유사한 소견을 보여12-17) 이번 연구결과의 신빙성을 확인할 수 있었다. 또한 후이개피부의 상피하층은 PKCα, PKCβ와 PKCζ는 면역염색성이 없었으나 중이진주종상피의 상피하층에서 PKCα와 PKCβ의 면역염색성이 증가한 것은 중이진주종의 상피하층에 PKCα와 PKCβ를 통한 신호전달이 있고 이러한 신호전달은 후이개피부의 상피하층보다 증가되어 있어 중이진주종상피의 상피층과도 다른 신호전달기전이 작용할 것으로 생각된다. 이전의 중이진주종에서의 연구를 보면 상피하층에서 정상피부와는 다른 육아 조직과 염증세포 및 선세포가 발견되었는데 피부병변의 상피하층에서 염증세포로 인한 PKC 동위효소의 면역염색성이 증가되었다는 보고14)16)로 보아 중이진주종의 상피하층에서의 PKCα와 PKCβ에 대한 면역염색성의 증가는 이러한 염증세포때문이라 생각된다. 중이진주종과 후이개피부의 상피층에서 신호전달과정의 차이는 후이개피부에서는 각질이 체외로 배출되지만 중이진주종상피에서는 각질이 체외로 배출이 되지않고 중이강내에 존재하면서 축적되어 김 등 6)의 의견과 같이 지속적인 자극을 제공하여 정상과는 다른 신호전달과정을 경유할 것으로 생각된다.
본 연구로 western blot분석, 면역조직화학검사와 역전사중합효소반응을 통하여 중이진주종에서 PKC 동위효소중 PKCα, PKCβ와 PKCζ가 확인되었다. 또한 만성적인 자극에 의한 신호전달 결과 PKC의 하향조절로 생각되며 이러한 하향조절은 후전사단계에서 일어남을 알 수 있었다. 그리고 중이진주종의 상피하층에서는 염증반응의 증가로 PKC의 면역염색성이 증가되어 있었으며 특히 PKCα와 PKCβ가 PKCζ보다 상피하층의 염증반응에 더욱 관여함을 알 수 있었다. 이로써 중이진주종상피의 상피층과 상피하층에서 PKC의 발현에 상이한 차이가 관찰되어 상피층과 상피하층은 PKC와 칼슘을 통한 신호전달기전에 다른 점이 있을 것으로 생각된다.
요약
저자들은 중이진주종에서 종양화변환, 세포의 성장과 분화 및 세포내 다양한 조절기능을 가
진 PKC의 역할을 면역화학조직검사, western blot분석, 역전사효소중합반응 및 densitometry를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
중이진주종상피층에서 PKC 동위효소 단백질은 감소된 상태였고 PKC 동위효소 RNA는 변화가 없었으며 상피하층에서는 PKC 동위효소 단백질은 증가됨을 알 수 있었다.
이상의 결과로 중이진주종상피층에는 후전사단계에서 하향조절이 일어나는 PKC 동위효소를 통한 신호전달체계가 존재함을 알 수 있었다. 그리고 중이진주종의 상피층에서 PKC의 하향조절현상으로 PKC 단백질이 소실되어 PKC 고유의 다양한 조절기능을 상실함으로써 과증식증이 유발되어지는 것으로 생각된다. 그리고 중이진주종의 상피하층에서는 상피층과는 다른 신호전달체계가 존재하고 이는 염증세포의 침윤과 관련되는 것으로 사려된다.
본 연구를 토대로 이차전달물질인 PKC이후의 과정과 핵내에서 어떠한 변화가 유발되는지, 또는 유전자 이상과의 연관여부를 알아보는 것이 중이진주종상피에서의 신호전달기전과 발생기전을 규명하는데 필요할 것으로 생각된다. 저자는 본 연구의 실험결과가 현재까지 중이진주종에서 연구된 여러 성장인자들과 앞으로 연구되어질 핵내의 신호전달기전과 유전자이상 등의 관련여부를 이해하는데 있어서 귀중한 자료를 제공할 것으로 생각되며 중이진주종상피에서의 과증식과정을 이해하는데 도움이 될 것으로 생각된다.
REFERENCES
1) Sade J. Cholesteatoma and mastoid surgery proceedings of the second lnternational conference. Amsterdam Kugler Publications 1982.
2) Chao WY, Huang CC. An immunohistochemical study of cytokeratin expression in human middle ear cholesteatoma. Arch Otorhinolaryngol 1989;246:37-42.
3) Bujia J, Holly A, Schilling V, Negri B, Pitzke P, Schulz P. Aberrant expression of epidermal growth factor receptor in aural cholesteatoma. Laryngoscope 1993;103:326-9.
4) Shideo H, Huang CC. Expression of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma: Relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope 1993;105:1232-7.
5) Min WS, Jung HS, Park JY, Jun BH. Immunohistochemical study on the expression of proliferative markers of the squqamous epithelium of the cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1995;38:1884-900.
6) Kim SG, Paik SC, Kim TH, Park JY, Jun BH, Song GY. Histopathological and immunohistochemical study on cytokeratin expression of squamous epithelium of the cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1995;38:1654-69.
7) Choi JH. Signal transduction in keratinocyte. Korean Journal of Investigative Dermatology 1996;3:99-110.
8) Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase C. Science Wash, DC 1986;233:305-12.
9) Swann K, Whitaker M. Stimulation of the NALH exchanger of sea urchin eggs by phorbol ester. Nature 1985;314:274-7.
10) Bartel RA, Marcelo CL, Voorhees JJ. Partial charaterization of phospholipase C activity in normal, psoriatic uninvolved and lesional epidermis. J Invest Dermatol 1987;88:447-51.
11) Hug H, Sarre TF. Protein kinase C isoenzymes: Divergence in signal transduction? Biochem J 1993;291:329-43.
12) Horn F, Marks F, Fisher GJ, Marcelo CL, Voorhees JJ. Decreased protein kinase C activity in Psoriatic versus normal epidermis. J Invest Dermatol 1987;88:220-2.
13) Nishizuka Y. Intracellular signalling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science 1992;258:607-14.
14) Fisher GJ, Tavakkol A, Lach K, Burns D, Basta P, Loomis C et al. Differential expression of protein kinase C isoenzymes in normal and psoriatic skin: Reduced expression of protein kinase C-beta in psoriasic. J Invest Dermatol 1993;101:553-9.
15) Goodell AL, Oh HS, Meyer SA, Smart RC. Epidermal protein kinase C-β2 is highly sensitive to downregulation and is exclusively expressed in Langerhans cells: Downregulation is associated with attenuated contact hypersensitivity. J Invest Dermatol 1996;107:354-9.
16) Reynolds NJ, YI JY, Fisher GJ, Cooper KD, Voorhees JJ, Griffiths CEM. Down-regulation of Langerhans cell protein kinase C-β isoenzyme expression in inflammatory and hyperplastic dermatoses. British Journal of Dermatology 1995;133:157-67.
17) Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature 1988;334:661-5.
18) Marks F. Prostaglandins, cyclic nucleotides and the effect of phorbol ester tumor promoters on mouse skin in vivo. Carcinogenesis 1983;4:1465-70.
19) Chun YM, Park KY, Lee DH, Hwang SC. Expressioin of PLC-γ1 in human middle ear cholesteatoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:984-9.
20) Song YH, Hong NP, Lee DY, Kim YD, Ahn HW, Cha CI. Expression of phospholipase C-β1 and phospholipase C-γ1 on cholesteatoma. in press
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