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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(12): 1715-1721. |
| Light and Scaning Electromicroscopic Study on the Experimental on the Experimental Endolymphatic Hydrops in Guinea Pigs. |
| Seung Ha Oh, Ha Won Jung, Beom Seung Kang, Tack Kyun Kwon, Chong Sun Kim |
| Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 기니픽에서 유발된 내림프수종에서의 광학현미경 및 주사현미경관찰 |
| 오승하 · 정하원 · 강범승 · 권택균 · 김종선 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Despite numerous investigations, the pathogenesis of Meniere's disease is uncertain.
Endolymphatic hydrops (ELH) has been the main histologic finding of Meniere's disease. Experimentally induced ELH in animal model has been developed in order to understand better the consequences of this morphopathology on inner ear structure and function.
OBJECTIVES:
The aim of this study is to develope the animal model of ELH.
MATERIAL AND METHODS: We made an animal endolymphatic hydrops model on giunea pigs by mechanically obliterating the right endolympatic sac and duct. The left ears were used as a controls.
RESULTS:
After twelve weeks, the temporal bones were prepared for light and electron microscopic examination. The light microscopic study showed the distension and folding of Reissner's membrane, however other pathologic changes were uncertain in hydropic aminal. Under scanning electron microscopic examination, the cellular population of Reissner membrane remained normal but the microvilli of Reissner membrane were significantly decreased in hydrops group. The damage pattern of stereocilia were most severe in the apical turns, followed by the middle and the basal turns, in the order of severeity. The outer hair cell third row was most severely damaged in the entire cochlea, whereas the outer hair cell first row was relatively spared. On the single hair cell examination, abnormal distensions of the tip of stereocilia started from longer stereocilia. The number of microvilli on marginal cell was reduced in stria vascularis, but atrophic change was not observed. |
| Keywords:
Endolymphatic hydropsㆍScanning electron microscope |
서론
Prosper Meniere가 1861년 Medical Journal of Paris에 발표한 일련의 논문에서 청각역치의 불규칙적인 변화, 돌발적 현훈, 이명 및 귀안의 충만감을 특징적 증상으로 나타내는 질환군을 뇌울혈 또는 뇌질환이 아닌 내이의 미로성 질환이라고 처음 보고한 이래 이러한 증상의 복합군을 메니엘병으로 명명하였다. 이후 이 분야에 대한 연구가 진행되어 1927년 Guild는 동물실험을 통하여 내이의 내림프가 어떤 일정한 흐름이 있음을 처음 관찰하여 내림프낭과 도수관이 내림프의 흐름에 관여함을 보고하였으며, 1938년 Hallpike와 Cairns 및 Yamakawa가 사람의 측두골 연구를 통하여 메니엘병의 기본되는 내이의 조직병리는 내림프수종(endolymphatic hydrops, ELH)이라고 발표하였다. 이후 메니엘병의 병인에 대하여 많은 연구가 진행되어 왔으나 그 병인은 아직 분명히 밝혀지지 않은 실정이다.
저자는 메니엘병의 연구를 위해 안정된 내림프수종의 모델을 기니픽에서 유도한 후 주사현미경과 광학현미경으로 내림프수종을 확인하며 그로 인한 내이 구조의 변화를 관찰하고자 하였다.
연구재료 및 방법
1. 실험동물의 선정과 실험의 설계
실험동물은 이개반사(Preyer reflex) 양성을 보이며 수술현미경하에서 양측 고막이 정상소견을 보이는 체중 300∼400gm의 백색 기니픽 24마리를 대상으로 하였다.
먼저 우측 귀에 내림프낭과 도수관의 폐색을 행하여 내림프수종을 유발시켰으며 좌측 귀는 대조군으로 하였다. 형태학적인 검사를 위해 각각 12마리를 광학 및 전자현미경으로 관찰하였다.
2. 내림프수종의 유발
내림프도수관 폐쇄방법은 Kimura 및 Schuknecht의 술법에 따라 시행하였다.1) 체중 Kg당 30 mg의 pentobarbital을 복강내 주사하여 마취후 후두부 두개골을 노출시켰다. 후두골의 제거는 정중부에서 우측으로 수술용 천공기를 이용하여 뇌경막이 보이도록 얇게한 다음 microelevator로 뇌경막으로부터 후두골을 박리한 후 감자(forceps)로 후두골을 제거하였다. 수술현미경하에서 뇌경막을 절개한 다음 cotton pledget과 흡입제의 일종인 merocel조각을 이용하여 소뇌를 내함(retraction)되게 하여 소뇌교각(cerebellopontine angle)의 후면으로 접근하였다. 편엽(flocculus), 세반고리관(semicircular canal)과 해면동(cavernous sinus)의 주행을 확인한 후 편엽의 외측하방의 S상정맥동에 인접한 곳에 위치한 판개(operculum)를 확인하였다. 내림프낭과 내림프도수관의 주행을 확인한 다음 5/0 microdrill을 이용하여 내림프낭을 제거하면서 내림프도수관을 골파편으로 막았으며 다시 내림프도수관은 bone wax로 입구를 막아서 내림프의 유통을 폐쇄하였다. 링거 식염수를 이용하여 수술부의 세척을 행한 다음 gelfoam을 두개골 결손부위에 투입한 후 층별로 봉합하였다.
3. 형태학적 검사
광학현미경 표본의 제작은 2.5% Heidenheim Susa 용액으로 cardiac perfusion하여 측두골을 생체 상태에서 고정시켰다. 조직고정을 위하여 생체 상태에서 고정하는 동안 등골판을 제거한 후 고정액을 정원창내로 서서히 주입시켰다. 고정 후 즉시 측두골을 제거하여 4℃의 고정액내에서 24시간 동안 고정시켰다. 약2주간 4.5% EDTA(ethylene diamine tetracetic acid)와 2.5% glutaraldehyde 혼합용액으로 탈칼슘화시킨 후 celloidin에 포매하여 10∼20μm의 두께로 serial section한 후의 와우 전체에 오는 변화 특히 유모세포의 손상과 Reissner막의 팽창여부를 Olympus AH2 광학현미경으로 관찰하였다.
주사현미경 표본의 제작은 두경부에서 측두골을 제거한 후 측두골포를 파괴하여 중이강을 노출시켜서 등골을 제거하고 정원창과 난원창, 와우첨단부를 개방한 후 이를 통해 2.5% glutaraldehyde 고정액을 내이로 서서히 유입시켜서 4℃에서 24시간 고정액내에서 고정하였다. 2.5% glutaraldehyde 고정액내에서 와우의 고실계(scala tympani)를 덮고 있는 부분을 제외한 와우의 골부분을 제거한 후 각 회전의 혈관조를 분리하였고 Reissner막과 개막(tectorial membrane)은 micropipet을 이용하여 와우축 쪽으로 젖혀 Corti기관을 노출시켰다. 이를 2% arginine HCl에 16시간 봉매하고 다시 pH 4인 2% tannic acid로 24시간 처리한 후 1% osmium tetroxide로 6시간 고정하였다. 탈수후 일본 Hitachi 회사의 HCP-2 임계점 건조기를 이용하여 건조시킨 후 Eiko IB-3형 이온 도금기로 금 도금시켜 Jeol JSM-T 3000형 주사전자현미경으로 관찰하였다.
주사현미경의 표본에서 유모세포의 관찰은 와우의 세 회전부의 전장에서 각각 회전부 또는 각 회전부내에서의 외유모세포 세 열과 이에 대칭되는 내유모세포를 관찰하였다. 유모의 손상은 Hultcrantz의 보고를 응용하여 관찰하였으며 와우도를 이용하여 기록하였다.2)3) 또한 주사현미경을 통하여 Reissner막, 혈관조 및 나선인대의 변화를 관찰하였다.
결과
1. 내림프수종의 유발
기니픽에서의 내림프 도수관의 폐쇄부터 12주 경과까지 기니픽의 생존율은 80% 이상이었으며 특히 술후 2일이 경과된 경우 95%에서 12주간 생존하였다. 생존한 기니픽 모두에서 형태학적인 검사상 내림프수종을 보였다. 대조군과 내림프수종군은 함께 정상 고막소견을 보였으며 측두골포의 제거시 관찰한 중이강의 소견은 모두에서 저류액의 관찰이나 중이점막 비후 등의 이상소견이 없었다.
2. 형태학적인 변화
광학현미경 관찰에서 내림프낭과 도수관을 파괴시킨 우측 24귀 모두에서 Reissner막과 기저막이 이루는 각도가 90˚ 이상으로 Reissner 막이 팽창되어 있었고 와우 전정계(scala vestibuli)의 골벽유착이 있는 중등도 내지 고도로 Reissner막의 팽창을 관찰할 수 있었으며 대조군인 좌측 귀는 정상 소견을 보였다. 그러나 Corti기관의 변성은 뚜렸하지 않았으며 혈관조나 나선인대의 변화도 관찰할 수 없었다(Fig. 1).
내림프수종군에서 팽창된 Reissner막을 주사현미경으로 관찰한 결과 Reissner막의 세포수에는 변화가 없었으나 내림프와 접하는 막 표면의 미세융모의 감소가 두드러졌다. 주사현미경 상 나선인대의 특별한 변화는 관찰할 수 없었다.
주사현미경 관찰에서 정상군의 변연세포(marginal cell)는 대부분 6각형이고 표면에는 많은 미세융모가 있었으나 내림프수종군에서는 변연세포 표면에 있는 미세융모의 수가 감소한 세포가 많았고 혈관조의 위축은 관찰되지 않았다(Fig. 2).
내림프수종군의 유모세포의 변화는 와우의 각 회전부위에 따라 확실한 차이를 보여서 첨단회전부가 가장 심한 손상을 보였다. 내림프수종군에서 유모세포의 섬모의 소실을 와우의 전 회전에 걸쳐 분석한 결과 첨단회전과 중간회전의 변화가 기저회전의 변화보다 심하여 첨단회전의 변화가 기저회전으로 하행하는 양상을 보였으며 각 회전부내의 변화는 기저회전에서는 제 3 열 외유모세포와 내유모세포가, 첨단회전에서는 제 2, 3 열 외유모세포가 심한 손상을 받았으며 상대적으로 와우 전체 회전에서 제 1 열 외유모세포의 손상이 가장 적었다(Fig, 3, 4).
내림프수종군에서 유모세포의 변화는 섬모수의 감소, 섬모의 경직성 소실, 섬모간의 수평간격의 증가, 섬모들의 융합, 거대섬모의 출현 그리고 각질판(cuticular plate)의 돌출 등이 관찰되었다.
고찰
내림프수종을 유발시키는 방법으로 내림프낭의 파괴와 내림프도수관을 폐쇄하는 방법을 이용하였는데 Kimura의 술식을 응용한 저자의 내림프낭과 도수관을 뇌경막내 경로로 접근하여 기계적으로 폐쇄하는 방법이 뇌경막외 내림프낭의 전기소작법에 비해 내림프의 순환과 관련한 출구의 봉쇄로 가장 안정성이 있는 방법으로 인정된다. 실험적 내림프수종의 대상동물은 여러 동물에서 시험되었으며 동물간에 발생률에 차이가 있다고 보고되고 있다.4)1) 그 이유는 확실히 밝혀지지 않았으나 동물간에 내림프낭의 내림프액의 흡수능력이 다르며 수술적 폐쇄가 불완전하였거나 내림프계의 상피가 적응하여 보상하는 동안 내림프의 유출이 계속되며 내, 외림프계간에 누공이 존재할 수 있다는 것으로 설명하고 있다.5) Kimura 및 Schuknecht는 기니픽에서, Beal은 토끼에서 내림프수종을 유발시켜 각각 100%의 발생률을 발표한 이래 현재 기계적인 내림프 도수관의 폐쇄방법이 널리 사용되고 있다.4)1)
내림프 도수관 폐쇄에 의한 내림프수종 발생의 이론적 근거는 내림프는 종적순환(longitudinal flow)을 하며, 내림프 도수관과 내림프낭은 내림프에 대한 흡수작용 및 식작용이 있어서 내이의 수액양 및 전해질 조절작용을 하며,6) 또한, 내림프 도수관과 내림프낭은 면역방어(immunodefence)작용이 있는데,7) 이러한 내림프낭과 도수관의 기계적인 파괴와 폐색은 내림프의 순환과 흡수 조절작용의 부전으로 내림프수종이 발생한다.
메니엘병에서 관찰되는 조직병리는 여러 학자들에 의하여 보고되었으며, 주된 소견은 미로막(membranous labyrinth) 특히 Reissner막과 구형낭 막의 팽창과 파열, 혈관조의 위축, Corti기관과 나선 신경절세포(spiral ganglion cell)의 퇴화, 내림프 도수관과 내림프낭의 주위조직 및 전정기관의 외림프계 섬유조직의 증식, 내림프 도수관과 내림프낭 표피의 퇴화 및 수포형성이며 이 중 미로막의 팽창은 이 병의 기본적 조직병리 소견이나 와우의 첨단회전에서 관찰되는 경도의 팽창은 정상 귀 또는 다른 귀질환의 측두골에서도 16%에서 발견된다.8)
Kimura 및 Schuknecht는 기니픽의 내림프수종을 광학 및 전자현미경 관찰을 통해 기니픽이 다른 동물에 비하여 내림프낭이 내림프의 흡수에 더 많이 관여한다고 보고하였으며 와우의 전 회전에서 초기에는 기저회전부의 수종으로 시작되나 시간의 경과에 따라 전장에서 수종이 형성되며 오히려 첨단 회전에서 더욱 심한 수종이 관찰되였다고 한다.1) 또한 Kimura는 기니픽에서 시간의 경과에 따른 유모세포, 나선신경절 및 혈관조의 변화를 광학현미경을 통해 분석하여 시간이 경과하여 1년이 지나면 유모세포, 나선 신경절 및 혈관조 모두가 심한 위축성 변화가 일어남을 관찰하였으며 이러한 위축의 방향은 첨단회전에서 시작하며 외유모세포가 가장 빠르게 파괴됨을 관찰하였다.9) 외유모세포의 완전파괴에도 기저회전의 내유모세포, 나선신경절과 혈관조의 변화는 미미하다고 하였다.
Reissner막의 변화에 대한 연구는 활발하여 병리상 막성 팽창 이외에 막의 굴절(foldings), 와우 전정계의 골벽에 유착, 중피세포의 결핍, 외피세포층의 미세 함몰 또는 누공(epithelial micropits or microfishtula)의 형성10) 및 표피세포의 미세융모의 수적감소와 파열11) 등으로 보고되나, Reissner막 자체의 병변으로 인한 내림프수종의 발생여부는 Sakagami등의 실험으로 12주일 경과된 기니픽 내림프수종에서 팽창된 Reissner막의 외림프편으로 horseradish perosidase(HRP)를 주입하여 전달 능력의 생리 실험을 통하여 Reissner막 자체의 기능 이상은 없다고 밝혔다.12) 한편 메니엘병에서 임상증상의 기전으로 흔히 언급되는 미로막의 파열과 치유에 대해서도 메니엘병 환자의 측두골 조직검사상 40%에서만 발견되므로 현훈 등의 임상증상의 기전을 미로막 파열로만 설명할 수 없으며, 본 연구의 광학현미경적인 관찰소견에서는 Reissner막의 파열은 관찰되지 않아서 메니엘병의 임상양상은 그 외 수종에 의한 내림프압 증가에 따른 기계적 영향도 관여한다고 생각된다.13)
혈관조는 형태나 기능상으로 와우의 내림프계(scala media)와 나선인대(spiral ligament)로부터 junctional complex에 의해 고립되어 있고14) 와우의 내림프전위(endolymphatic potenital, EP)를 발생시키는 곳으로 알려져 있다. 실험적으로 유도한 내림프 수종에서 와우 내림프전위의 변화에 대하여 Morgenstern등은 초기에는 변화가 없고 술 후 1년이 지나면 내림프전위의 감소가 관찰된다고 하였으며, Konish등과 Kusakari등은 술후 3∼4주에 내림프전위의 감소가 관찰된다고 하여 내림프전위가 감소 되는 시기에는 보고자에 따라 차이가 있다.15)16)17) 내림프수종에서의 혈관조의 변화는 다른 원인 즉, 이독성(ototoxicity) 물질과 외상에 의한 변화와 유사하게 나타나 초기에는 부종이 나타나며 진행되면 위축이 온다고 하였다.18) 본 연구에서 관찰의 대상이 된 기니픽은 모두 내림프 도수관폐쇄 후 약 3개월이 경과된 것으로 Kimura & Schuknecht의 보고와 같이 100%의 고도 또는 중등도의 내림프수종을 보였으나 혈관조의 위축은 없었는데 이는 Kimura의 보고에도 내림프수종의 유발 후 1년이 지나서야 혈관조의 심한 위축성 변화가 일어남을 관찰하였으며 특히 기저회전의 혈관조의 변화는 미미하다고 하였다.9)1)
내림프수종에서 관찰되는 유모세포의 변화에 대하여 이미 여러학자들이 발표하였으며, 유모세포의 변화는 내림프수종 초기에는 관찰되지 않고 술 후 1개월째부터 첨단회전의 제 3 열 외유모세포의 변화가 처음 나타나면서 시간이 경과함에 따라 기저회전 쪽으로 손상이 파급되고 4개월이 경과 되어야 내유모세포의 변화가 관찰된다고 하였다.18)19) 이 때 관찰되는 변화는 이독성(ototoxicity) 물질이나 소음노출 때 관찰되는 변화와 유사하나 호발 부위가 틀리다. 한편 Horner등은 내림프 수종에 의한 특징적인 유모의 변화로서 동일 유모세포에서도 유모의 길이가 짧을 수록 손상이 잘 초래된다고 하였으나 본 연구에서는 정상으로 보이는 유모의 고배율 관찰에서 유모의 길이가 긴 바깥 줄의 유모에서 유모첨부의 이상팽윤을 관찰할 수 있어서 길이가 긴 유모에서의 손상이 먼저 시작하여 앞으로 더 연구가 필요할 것으로 생각되었다.20)
결론적으로 내림프수종의 광학현미경 검색에서는 Reissner막의 팽창만을 관찰할 수 있었으며 주사현미경의 관찰로 Reissner막의 세포 수의 변화는 없으나 표면 미세융모의 감소와 위축을 관찰할 수 있었다. 주사현미경상 유모세포의 손상은 첨단회전부에서 가장 심하였으며 중간회전, 기저회전의 순서로 심하였다. 회전부내의 변화는 기저회전부에서는 내유모세포가, 중간 및 첨단 회전부에서는 제 3 열 외유모세포(OHC3)의 손상이 가장 심하였으며 상대적으로 제 1 열 외유모세포(OHC1)의 손상이 가장 적었다. 한편 유모세포내의 섬모의 손상은 가장 긴 섬모부터 손상이 시작되었다.
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