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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(11): 1517-1523. |
| Morphologic Changes of the Nasal Mucosa in Experimental Maxillary Sinusitis of Rabbits. |
| Yeon Kuk Choi, Byung Gwan Jung, Gyu Cheol Han, Won Sang Lee, Duk Hee Chung |
| Department of Otolaryngology, National Medical Center, Seoul, Korea. |
| 실험적 부비동염으로 유발된 가토 비점막의 형태학적 변화 |
| 최연국 · 정병관 · 한규철 · 이원상 · 정덕희 |
| 국립의료원 이비인후과 |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
The nasal mucosa is degenerated by inflammations, physical stimulations such as cessation of air flow, and other chemical stimulations. And it is regenerated regularly by newly differentiated cells.
OBJECTIVES:
In order to investigate the morphologic changes of the nasal mucosa and regenerating activities in sinusitis.
MATERIALS AND METHODS:
The authors made animal models of acute maxillary sinusitis by obstructing the natural ostium of maxillary sinus of rabbit and inoculating Staphylococcus aureus colonies. Each contralateral side was used as control. The rabbits were sacrificed after 1, 2, and 3 weeks. Morphologic changes of the nasal mucosa and regenerating activities of the olfactory mucosa were observed with Hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry using BrdU.
RESULTS:
Purulent sinusitis was developed in all rabbits.
Light microscopy showed that nasal mucosa revealed inflammatory changes such as edema, inflammatory cell infiltration, goblet cell metaplasia, polypoid change, epithelial ulceration, and submucosal connective tissue proliferation. BrdU-labelled cells were observed mainly in the basal cell layer of the olfactory mucosa, and their numbers in the control sides were significantly higher than in the experimental sides.
CONCLUSION:
These results indicate that acute infection of the maxillary sinus induces inflammatory changes of both respiratory and olfactory mucosa of the nose and decreases the regenerating activity of olfactory mucosa. |
| Keywords:
Experimental maxillary sinusitisㆍNasal mucosaㆍOlfactory mucosaㆍBrdUㆍHistology |
서론
부비동은 각기 고유의 자연공을 갖고 부비동점막에서 생성된 분비물은 자연공을 향해 지속적으로 운동하는 점액섬모의 역할에 의해 배출되며 각각의 자연공을 통한 가스교환에 의해 부비동 점막의 산소 교환이 이루어지고 비강을 통한 가스 교환의 속도와 효율성은 자연공의 개방과 비호흡에 의해 좌우되며 부비동내 산소 분압이 저하시 이로 인해 특정한 세균이 증식하게 된다.8)
저자들은 가토의 일측 상악동에 자연공을 폐쇄한 후 포도상구균을 주입하여 급성 상악동염의 실험적 모델을 만든 후 1주, 2주, 3주 째에 5마리씩을 희생시켜 비점막의 형태학적 변화를 hematoxylin-eosin(H & E) 염색후 광학 현미경으로 관찰하고 5-Bromo-r-deoxyuridine(BrdU)을 이용하여 후상피의 증식능을 비교하였으며 대조군은 균을 주입하지 않은 반대측을 이용하였다. 본 실험은 부비동이 잘 발달된 가토를 이용하여 부비동의 자연공 폐쇄와 포도상구균 주입으로 인한 비점막의 염증 및 폴립의 발생 기전과 이러한 비점막의 염증이 후상피의 재생에 미치는 영향을 관찰하고자 시행하였다.
재료 및 방법
1. 실험동물
체중 1.8∼2.2kg의 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 가토 15마리를 술전과 술후에 일정한 환경에서 사육하여 실험에 사용하였다.
2. 실험 방법
가토의 대퇴부에 체중 kg당 50mg의 케타민(ketamine HCl)을 근주하여 전신마취한 후 콧등의 털을 깍고 베타딘(povidone iodine)으로 소독한 후 피부로부터 골막까지 약 3cm 정도를 절개하여 상악동의 전골벽을 노출 시켰다. 수술 현미경하에서 전기드릴을 이용하여 5mm×10mm 크기로 상악동의 전골벽을 제거하고 적당한 크기로 잘라낸 실리콘으로 자연공을 폐쇄한 후 37℃ nutrient agar에서 배양한 표준균주인 포도상구균(Staphylococcus aureus)을 생리식염수에 희석하여 생균수가 1ml당 106개가 되도록 만들어 개방된 전골벽을 통해 1ml씩 주입하였다. 절개 부위의 골막은 4.0 catgut, 피하조직 및 피부는 4.0 nylon을 이용하여 봉합하였다. 자연공 폐쇄와 포도상구균 주입 후 1주, 2주, 3주 째 각 5마리씩 희생시켰고 희생 24시간 전에 Sigma사의 BrdU(1mg/kg)를 가토의 이개 정맥내로 한 시간 간격으로 3회 주사하였다. 케타민 마취후 생리 식염수(300ml/kg)로 심장을 경유하여 대동맥을 통해 관류시킨 후 4% paraformaldehyde(300ml/kg)로 관류 고정시켜 비강을 포함한 두부를 채취하였다. 채취한 두부를 24시간 동안 4% paraformaldehyde용액에 침투고정 시킨 후 24시간에서 48시간동안 Plank-Rychlo’s용액에서 탈회시켰으며 탈회한 후 토끼의 양측 비강에서 각각 maxilloturbinate, ethmoturbinate, 비중격 전반부, 비중격 후반부를 절제하여 24시간 동안 30% sucrose용액에 고정하고 5mm 간격으로 연속 절편을 만들어 영하 70℃에서 동결시켰다. 동결절편을 4∼7μm의 두께로 잘라 각각 5매씩의 슬라이드 절편을 얻었다. 이렇게 만들어진 슬라이드는 2시간이상 상온에서 건조시킨 후 냉동보관 해 둔 cold acetone에 10분간 담가서 고정하여 냉동고에 보관하였다. 제작된 슬라이드표본은 hematoxylin-eosin 염색을 하여 형태학적 변화를 관찰한 후, ethmoturbinate를 절제하여 제작한 슬라이드중 원주세포가 특히 길며, Bowman선이 존재하는 후상피 영역을 찾아내어, 후상피의 재생능 측정을 위해 anti-BrdU antibody를 이용한 labelled streptavidin-biotin 법으로 면역조직화학 염색을 시행하였다.
면역조직화학염색은 DAKO사의 LSAB Kit을 사용하였다. 동결 조직을 gelatin coated slide에 부착시켜 phosphate buffered saline(이하 PBS)으로 5분간 세수하였으며 0.1% pepsin에 3분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세수하고 1N HCl로 상온에서 20분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세수하였다. H2O2를 적당량 도포한 후 5분간 실온에서 반응시키고 증류수로 충분히 세척후 다시 PBS에서 5분간 세수하였다. Blocking reagent를 도포한 후 5분간 실온에서 반응시키고 1：20 anti-BrdU antibody에 24시간동안 반응시킨 후 PBS로 5 분간 세수하였다. Link solution을 도포하여 20분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세수하고 Streptavidin reagent에 20분간 반응시킨 후 PBS로 5분간 세수하였다. Substrate-chromogen용액을 도포하여 10분간 반응시킨 후 증류수로 세수하고 Mayer’s hematoxylin용액에 2분간 담가 대조염색을 시행한 후 증류수로 충분히 세수하고 10분간 암모니아수에 담근 후 2분간 증류수에서 세수하고 mounting하였다. BrdU는 DNA와 결합하여 세포분열 S phase를 나타내는 thymidine의 pyrimidine analogue로서 세포분열이 되고 있는 후상피에 항 BrdU항체를 이용한 면역조직화학 염색을 함으로써 세포 분열 능력을 비교 관찰하였고 현미경 1000배 시야에서 대조군으로 사용한 정상측과 염증이 발생된 실험측의 BrdU 표식세포수를 계산하여 각 군의 mitotic activity로 정하였다. 양군 사이의 통계학적 검증은 student t test로 하였다.
결과
1. 육안 관찰 소견
실험 3주까지 15마리중 사망례는 없었고 자연공을 폐쇄시키고 포도상구균을 주입한 실험측 비강에서 대개 2∼4일부터 편측성 점액농성 비루가 육안으로 관찰되었다. 희생 후 해부시에도 점액농성 분비물이 균을 주입한 측 비강과 부비동에서 관찰되었고 부비동 점막은 부종, 발적, 종창되어 있었으며 상악동 자연공은 실리콘으로 폐쇄된 채로 관찰되었다.
2. 광학현미경 관찰 소견
대조군으로 사용한 균을 주입하지 않은 측의 후상피는 수용세포(receptor cell), 지지세포(supporting cell)와 기저세포(basal cell)가 규칙적으로 배열되어 있었다(Fig. 1). 자연공을 폐쇄하고 균을 주입하여 염증이 발생된 측의 비점막은 비갑개 점막의 비후, 종창, 배세포의 증식과 화생화 변화, 상피세포의 궤양 및 염증세포의 침윤 등을 관찰할 수 있었다. 균주입 1주 경과 후 비점막상피는 배세포(goblet cell)가 화생되고(Fig. 2) 비점막이 폴립양 변화를 일으켰으며(Fig. 3), 2주 경과 후에는 maxilloturbinate의 상피세포층의 궤양, 점막하 조직의 섬유아세포의 증식을 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 염증발생 3주 경과 후 점막 결손 부위를 통한 결체조직의 탈출(herniation)은 관찰 할 수 있었으나 재상피화를 통한 폴립형성은 관찰할 수 없었으며 비점막상피는 광범위한 변성과 결체조직의 탈출과 종창 및 섬유아세포 증식, 염증세포의 침윤을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
3. 면역조직화학적 관찰소견
면역조직화학염색으로 관찰한 후상피의 재생능은 대조군으로 사용한 정상측 후상피에서 BrdU 표식세포들이 주로 기저세포에서 관찰되었으며(Fig. 6) 곳에 따라 표식되지 않은 기저세포들도 많이 관찰되었으나 염증이 발생된 측(Fig. 7)은 BrdU 표식세포가 거의 관찰되지 않았다. 정상측에서는 1000배 시야에서 BrdU 표식세포수가 평균 4.17±0.97% 였고, 염증유발 1주 후에 희생시킨 군에서는 1.27±0.55% 였으며, 2주 후에 희생시킨 군에서는 0.71±0.42%, 3주후에 희생시킨 군에서는 0.94±0.46%로 정상측에서 표식세포를 더 많이 관찰할 수 있었고 이는 통계적으로 유의하였으나(p<0.05) 염증반응 1주, 2주, 3주 각각에서는 유의한 차이를 관찰할 수 없었다(p>0.05)(Fig. 8).
고찰
사람의 정상 호흡점막은 위중층섬모원주상피세포로 되어 있고, 그 상피는 섬모원주세포, 무섬모원주세포, 배세포 및 기저세포로 이루어져 있어 호흡시 각종 불순물을 점액막(mucous blanket)과 섬모운동에 의해 배출시키며, 흡기시 비강내 공기의 온도와 습도를 조절한다3). 비점막에 존재하는 후상피는 외상에 의한 염증 등의 화학적 자극이나 비강기류 차단 등의 물리적 자극에 의해 변성 후 탈락되었다가 재생되며 정상에서도 다른 신경세포와 달리 일정한 속도로 세포교체를 하며 기저세포로부터 분화된 새로운 세포에 의해 대체된다는 것은 많은 형태학적 연구로 증명되어 왔다.6) 부비동의 점막도 위중층원주상피세포로 이루어져 있으나 그 섬모의 모양은 원주세포보다는 입방세포에 더 가깝고, 자연공을 통하여 공기가 비강과 순환하고 있으며, 모든 섬모들이 물결모양으로 자연공을 향해 운동하여 부비동을 거의 무균상태로 유지시키고 있다.3)
저자들이 실험에서 사용한 가토는 크고 잘 발달된 상악동을 가지고 있고 비강과 잘 경계되어지는 자연공을 가지고 있으며 성격이 온순하여 다루기 쉬워 부비동 연구에 흔히 쓰이는 동물이다.5) 가토의 상악동은 정점이 전방을 향하고 밑면이 후벽에 위치하며 전후길이가 긴 피라미드 모양이다. 자연공은 내벽의 후단부 중간에 위치하며 초생달 모양을 하고 있고 상악동의 용적은 2∼3ml로써 자연공은 길이가 4mm(2.5∼6mm), 폭이 0.5 mm(0.3∼0.8mm)정도로 구성되어 있다. 가토의 상악동은 내측벽, 외측벽, 후벽 및 전상방을 향한 전벽으로 이루어져 있다5). 부비동염은 부비동 점막의 염증과정으로써 부비동 자연공의 기능 이상과 병원균이 부비동염의 발생에 중요한 요인으로 알려져 왔다.17) 급성 부비동염을 일으키는 중요한 원인균으로는 Streptococcus pneumonia, Hemophilus influenzae, Staphylococcus aureus 등의 호기성균이 대부분이며 혐기성균은 10% 이내에서 발견되지만 만성부비동염에서는 중요한 원인균으로 알려져 있고 그 원인은 부비동내의 산소량이 적어지기 때문인 것으로 생각되어지고 있다.12) 만성부비동염에서 가장 흔히 발견되는 혐기균으로는 Bacteroides species가 가장 많으며, Propionibacterium acnes, Peptostreptococcus species, Veillonella species 등이 있다.11) 저자들은 가토 상악동의 자연공을 실리콘으로 폐쇄한 후 포도상구균을 주입하여 급성 상악동염을 유발시킴으로써 비강 밖으로 흐르는 편측성 점액농성비루를 육안으로 관찰 할 수 있었다.
척추동물의 후상피는 기저세포로부터 생긴 새로운 후세포가 성숙세포로 변화되어 탈락 소실될 때까지 약 28.6일부터 30일의 시간이 소요되는데, Hinds13)는 Hthymidine을 이용하여 관찰한 결과 후세포의 재생은 확실하게 일어나며 대개의 후세포는 일정기간 후에 소실되지만 그 중 일부는 적어도 12개월 이상 생존한다고 하였고 후세포의 재생은 후구의 성장과 일치한다고 하였다. Inamitzu등10)은 후구를 제거한 후 후점막의 재생과정을 관찰한 결과 1일에서 7일 후에 모든 후세포가 사라지고 지지세포와 기저세포만 생존하며 7일 후에는 새로운 후세포가 후점막의 기저세포로부터 세포 분열하여 재생된다고 하였고, 후상피는 비강을 폐쇄함으로써 비강기류를 차단하면 위축되는데 이것은 기저세포의 세포분열이 감소되었기 때문이라고 하였으며1)2), Costanzo16)는 후신경 절단시 완전히 성숙된 후세포만 소실되고 시냅스를 형성하고 있지 않은 미성숙 후세포는 잔존한다고 하여 후세포는 후구나 후신경과의 연결 없이 후점막 자체의 어떤 요소에 의하여 기저세포로부터 분열되어 미성숙한 후세포가 된 후 후구와 시냅스를 형성하는 성숙한 후세포로 이행된다고 하였고, Camara등6)은 후세포의 재생능력이 후점막 자체의 어떤 인자나 혹은 중추신경으로부터 전달되는 정보에 의해 조절된다고 하였다. Farbman2)은 비강을 폐쇄하여 비강기류를 차단시키면 지각신경자극이 감소됨으로써 후세포의 세포분열능이 저하된다고 하였다. Maruniak1)등은 성숙마우스를 이용하여 비강을 폐쇄한 실험에서 비강을 폐쇄한 측에서는 오히려 정상 두께를 가진 채로 후점막이 보존되나 개방측에서는 후점막이 비정상적으로 보존되는데 이것은 외부의 해로운 물질에 대해 후점막이 보호됨으로써 비강폐쇄측의 후점막은 정상적으로 보존된다고 하였다. 저자들의 경우도 자연공 폐쇄와 포도상구균 주입 1주후부터 정상에 비하여 호흡점막과 후점막의 변성과 재생능의 현저한 감소를 관찰 할 수 있었고 이는 비점막에 있는 지각신경이 비강기류의 자극을 받지 못하고, 자연공을 통과하는 동정맥이 혈류공급 장애를 받아 산소공급이 저하되어 섬모의 운동이 저하되며 침윤된 염증세포중 호중구에서 분비되는 단백용해효소가 조직에 손상을 주기 때문으로 생각된다.
Johansson등9)은 자연공을 폐쇄한 군에서는 장액성 분비물만 관찰되었으며 화농성부비동염이 유발되기 위해서는 자연공의 폐쇄와 세균의 주입이 필수적이라 하였고, 자연공이 개방된 상태에서 점액섬모운동이 정상이라면 부비동내로 침투한 세균은 자연공을 향하여 끊임없이 움직이는 섬모에 의해서 곧 비인강내로 배출됨으로써 세균이 점막과 접촉하게되는 시간이 짧아져 점막내로의 침투도 불가능하게 되어 염증반응을 일으키지 못한다고 하였다.15) 저자들은 가토의 일측 자연공을 폐쇄한 후 포도상구균을 주입하여 부비강 해부시 전례에서 화농성 부비동염의 발생을 관찰 할 수 있었다.
비강염증시 기저막의 비후가 관찰되는데 이는 수액, 영양 및 방어인자들이 상피세포로 수송되는 것을 방해하며 미생물의 침입에 대한 저항력을 감소시킴으로써 염증에 따르는 복구작업을 지연시키기 때문이라고 하였다.14) 저자들의 연구에서는 실험 후 2∼4일째부터 점막부종, 종창, 염증세포의 침윤, 배세포의 화생, 비점막의 폴립양 변화 등을 관찰 할 수 있었다.
Larsen등4)은 폴립형성을 5기로 나누어 1기는 상피세포의 손상이나 파괴, 2기는 탈출된 조직의 상피화에 의한 작은 폴립의 생성, 3기는 폴립상피로부터 선(gland)의 형성, 4기는 폴립이 성장하고 증가되어 관상선이 발생, 5기는 완전히 발전된 폴립의 생성이라 하였다. Norlander등7)도 점막의 손상으로 인한 상피세포층의 파괴로 인해 섬유아세포가 침윤되고 혈관 증식이 발생되며 염증 발생 5일째부터 폴립형성의 초기 단계가 시작되고 상피세포층이 기저세포층으로부터 분리되면서 작은 공동이 형성되어 결국 완전한 폴립을 형성하게 된다고 하였고, 폴립의 유발 인자로는 만성 부비동염, 아스피린 비내성, 낭성섬유증 등이 있다.4) 저자들의 경우도 염증발생 3주 경과 후 비점막 결손 부위를 통한 결체조직의 탈출(herniation)을 관찰 할 수는 있었으나 재상피화를 통한 폴립형성은 관찰할 수 없었는데 이는 실험기간이 짧았기 때문으로 사료되며 비점막의 염증 반응으로 인한 상피세포층의 손상, 부종, 염증세포의 침윤 등이 폴립형성의 주된 요소라고 생각되고 낭종의 형성이 폴립형성의 유발 요인으로 생각된다.
결론
상악동의 자연공 폐쇄와 포도상구균의 주입은 가토에서 실험적 상악동염을 유발하는데 적절한 방법이다. 급성 부비동염은 비점막상피에서 배세포의 화생화 변화, 결체조직의 탈출 등을 포함한 염증반응을 일으킬 뿐만 아니라 후각상피의 염증성 변화와 재생능의 감소를 일으키는데, 이는 부비동염 환자에서 발생되는 후각기능 장애에 대한 기전으로 제시될 수 있을 것이다. 또한, 세포의 재생능을 관찰하기 위하여 분열하는 세포의 핵에 선택적으로 염색되는 BrdU를 이용한 면역조직화학염색의 결과, 부비동염 유발시 후상피세포의 재생능이 현저히 감소됨을 알 수 있었고 이는 상악동의 자연공 폐쇄와 세균의 감염이 함께 존재시 더 잘 유발된다는 것을 관찰할 수 있었다.
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