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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 55(1); 2012 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2012;55(1): 30-36.
doi: https://doi.org/10.3342/kjorl-hns.2012.55.1.30
Porous Polyurethane Scaffold as a Tracheal Prosthesis Material.
Han Su Kim, Sung Min Chung, Soo Yeon Jung, Soo Jin Kim, Kyung Yeon Kim
Department of Otorhinolaryngology, School of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea. sevent@ewha.ac.kr
인공기관 재료로서 다공성 폴리우레탄 스캐폴드의 유용성
김한수 · 정성민 · 정수연 · 김수진 · 김경연
이화여자대학교 의학전문대학원 이비인후과학교실
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The purpose of this study was to confirm the usefulness of the porous polyurethane scaffold as a tracheal prosthesis for repair of partial tracheal defect.
SUBJECTS AND METHOD:
A porous polyurethane (PU) scaffold was manufactured by salt-leaching method. Polyethylene glycol (PEG) was grafted onto the surface of the PU scaffold following surface ozonation treatment. Scanning electro-microscopy (SEM) was then performed to evaluate the morphklogy. For the biocompatibility evaluation, a 5x5 mm sized PU scaffold was implanted into the rabbit's ear. A histological examination was performed with the tissue one month later. Polymerase chain reaction for tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-6, procollagen, fibromodulin, fibronectin, and actin was also performed. The tensile strength was measured and compared with beagle's trachea to evaluate the mechanical property of the prosthesis.
RESULTS:
The effect of ozonation and surface grafting with PEG was on the porous scaffold was confirmed by SEM and X-ray photoelectron spectroscopy. The histological examination showed a large amount of fibrous tissue and capillary had grown through the pores of the porous scaffold. The inflammatory reaction was not so severe. TNF-alpha and IL-6 were slightly elevated in the PU scaffold transplanted tissue. However, the concentration levels of the other cytokines were similar between transplanted tissue and normal tissue. The tensile strength was very similar with the beagle's normal trachea.
CONCLUSION:
The polyethylene grafted polyurethane scaffold is a good candidate prosthesis for tracheal reconstruction.
Keywords: TracheaPolyurethaneTissue scaffolds

Address for correspondence : Han Su Kim, MD, Department of Otolaryngology, School of Medicine, Ewha Womans University, 1071 Anyangcheon-ro, Yangcheon-gu, Seoul 158-710, Korea
Tel : +82-2-2650-2686, Fax : +82-2-2648-5604, E-mail : sevent@ewha.ac.kr

서     론


  
기관(trachea)의 손상을 치료하는 방법은 손상 부위의 침범 정도(일부 혹은 원형) 및 침범 길이에 따라 다르다. 원형 손상의 치료는 단단문합술(end to end anastomosis)이 일반적이며 기관벽의 일부만 손상이 있을 경우 그 부위를 제거한 후 크기가 작을 경우 일차봉합을 하거나 아니면 각종 피판을 이용하여 재건하여 준다. 그러나 단단문합술의 경우 수술 후에 접합 부위가 안정될 때까지 약 2주간 머리 위치를 고정해야 하며1) 일차 봉합이나 피판술의 경우 기관협착을 초래할 수 있다. 최근 들어 조직공학 및 재생의학 기반의 인공장기 개발 기술이 발전하면서 기관재건을 위한 각종 연구가 시도되고 있다. 기존의 연구는 생체분해성 스캐폴드에 연골세포, 줄기세포 등을 이식하여 복강 등에 삽입한 후 기관골격을 만든 후 점막을 재이식하는 복잡한 과정이 필요하다.2) 하지만 실제 임상에서 자주 만나는 상황은 갑상선암, 외상 등에 의해서 기관벽의 일부가 손상되어 수술장에서 바로 기관벽의 재건이 필요한 경우가 많아 복잡한 조직공학 과정을 기다릴 수 있는 시간이 없는 경우가 많다. 이에 인공 재료만을 이용한 기관재건이 시도되었으나 점막 재생이 불량하고, 염증에 취약하여 육아조직이 형성되며, 접합부위의 분리, 주위 조직의 손상 및 재협착 가능성이 높아 임상적으로 적용하는 데는 많은 문제점이 있다.3,4,5)
   기관은 정적인 구조가 아니라 기관이물을 배출하기 위해서 기침을 할 때 매우 짧은 시간 동안 수축과 신장을 하게 된다. 그러나 기존에 사용되었던 인공재료들은 이러한 기관의 기능을 고려하지 않았기 때문에 인공재료가 기관과 접합하지 못하고 탈락하는 문제가 발생하는 것으로 생각된다. 이에 현재 생활 현장 및 의료 현장에 널리 사용되고 있는 폴리우레탄(Polyurethane)을 이용하여 다공성 인공기관용 스캐폴드를 개발하고 이의 물성을 확인함으로써 인공기관의 스캐폴드 후보 물질로 가능한지 알아보고자 한다.

재료 및 방법

스캐폴드 제작

스캐폴드 도안 및 주물 제작
  
정상 기관의 형태를 참고삼아 스캐폴드의 형태를 도안한 후(Fig. 1) 폴리우레탄 주입이 가능한 주물을 테플론(Teflon)을 이용하여 제작하였다(Fig. 2).

다공성 폴리우레탄 스캐폴드 제작
   Salt-leaching 방법을 이용하여 다공성 스캐폴드를 제작하였다. 방법은 다음과 같다. 소금을 막자 사발에 갈아 100
~200 μm짜리 채를 통과한 것을 모은다. 플라스크에 폴리우레탄(Tecoflex®, Thermedics Inc., Woburn, MA, USA) 3 g과 클로로포름(Sigma-Aldrich C-5312, St. Louis, MO, USA)을 25 mL 넣은 후 약 4~5시간 저어주어 12% 농도의 폴리우레탄 용액을 만든다. 이 용액에 위에서 걸러낸 소금 27 g을 넣어 녹여 소금 : 폴리우레탄 용액의 비율이 1 : 9인 용액을 만든다. 이 용액을 유리주사기를 이용하여 주물에 주입한다(Fig. 3).
   동결건조 방법을 이용하여 폴리우레탄 용액을 굳힌 후 주물 전체를 약 48시간 동안 증류수 용액에 넣어 소금을 녹여 제거한다. 이후 주물을 분리하고 나온 스캐폴드를 다시 24시간 동안 증류수 용액에 넣어 남은 소금을 제거한다. 

오존처리 및 폴리에틸렌글라이콜 표면처리
  
스캐폴드 표면의 세포생착성을 증가시키기 위해 스캐폴드 표면에 오존처리 및 폴리에틸렌글라이콜(Polyethylene glycol, PEG)로 표면처리를 하였다. 건조 산소를 유압 0.35 kgf/cm2, 전류 5 Amp, 유속 5 litter per minute으로 설정한 오존 형성기(Ozonepia Ozone Generator, Sei Myung Techron Co. LTD, Seoul, Korea)로 통과시켜 만들어진 오존이 들어있는 후드에 폴리우레탄 스캐폴드를 1시간 동안 넣어 오존처리를 하였다. 이후 메톡시 폴리에틸렌글라이콜(Methoxy Polyethylene Glycol, mPEG-AM 2000, Sunbio, Anyang, Korea)을 증류수에 녹여 10% 용액으로 만든 후, 이 용액에 오존 처리된 폴리우레탄 스캐폴드를 담근 후 50
에서 24시간 동안 두어 PEG를 표면처리 하였다. 

물성 검사
  
스캐폴드의 형태를 관찰하기 위하여 전자 현미경(FESEM H800, Hitachi, Tokyo, Japan) 촬영을 하였다. 오존처리 및 폴리에틸렌글라이콜의 표면 처리 결과는 X-ray photoelectron spectroscopy(XPS, PHI 5700, Physical Electronics, Chanhassen, MN, USA)의 electron spectroscopy for chemical analysis(ESCA)를 이용하였다. 강도 및 인장력(tensile strength) 측정은 Lloyd LR 10K plus universal tester(Beamar industrial supply Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 대조군으로는 생후 6개월의 체중 10 kg beagle의 기관을 스캐폴드와 동일한 크기로 절제하여 측정한 이전 연구의 결과를 활용 하였다.6)

생체적합성 검사

조직검사
   3
~4 kg 중량의 뉴질랜드 토끼에게 Zolazepam HCL(Zoletile®, Virbackorea, Seoul, Korea) 0.3 cc/kg과 Xylazine chloride (Rumpum®, Bayerkorea, Seoul, Korea) 0.2 cc/kg를 근주하여 마취하였다. 이후 우측 귀 하단부의 피하 조직이 풍부한 부위에 약 1 cm 길이로 피부를 절개한 후 피하에 5×5 mm 크기의 폴리우레탄 스캐폴드를 이식한 후 봉합하였다. 대조군으로는 반대편 귀에 피부 절개만 한 후 봉합한 조직을 이용하였다. 이식 한 달 후에 동물을 희생하여 조직을 얻은 후 Hematoxilin-Eosin 염색을 하여 조직검사를 시행하였다.

중합효소연쇄반응검사(Polymerase chain reaction, PCR)
   조직검사에 사용된 동일한 시료로 중합효소연쇄반응검사를 시행하였다. 염증반응과 관계된 인자로는 tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6를 검사하였고 결합조직 재생과 관계된 인자로는 procollagen, fibromodulin, fibronectin, actin에 대한 PCR 검사를 시행하였다.7) Trizol reagent를 이용하여 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 2 ug과 1pmole oligo dt, 0.5 mM dNTP를 섞어 65℃에서 5분, 얼음에서 5분을 둔 후, 5X first standard buffer, 5 mM DTT, 2 Unit rRNasin, 10 U Spuer script3 reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)의 조성으로 50℃에서 한 시간, 70℃에서 15분 두어 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. cDNA의 증폭을 위한 PCR 과정은 PCR Thermal cycler DICE TP600(Takara, Shiga, Japan)을 사용하였고, cDNA와 10X buffer, 0.25 mM dNTP, 0.5 pmole의 Forward와 Reverse primer, 2.5 unit Taq polymerase(Solgent, Daejeon, Korea)를 섞어 초기변성과정 5분 수행 후, Denaturation 과정 94℃에서 30초, Annealing 과정 58℃에서 30초, Extension 과정 72℃에서 30초를 25 cycle 수행하였으며, 최종 합성과정 72℃에서 7분을 거쳐 PCR 시료를 합성하였다. 합성된 PCR 시료는 1% agarose gel에 부착하여 그 크기를 확인하였다. 

결     과

   정상 기관을 반으로 자른 모양의 3 cm 길이의 폴리우레탄 스캐폴드를 제작하였다(Fig. 4). 전자현미경 검사를 통해 본 스캐폴드의 형태는 약 150
~200 μm 크기의 다공성 구조로 오존처리 후에 표면이 거칠어졌으나 폴리에틸렌글라이콜 표면 처리 후 표면이 이전에 비해 다소 매끄러워진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 
   ESCA 검사결과를 보면, 한 시간 동안의 오존 처리를 통해 스캐폴드 표면의 산소 함량이 증가하였으며 폴리에틸렌글라이콜 이식 후에는 산소와 탄소의 농도가 더 증가하였다(Fig. 6). 이런 결과는 폴리에틸렌글라이콜이 3개의 탄소원자와 한 개의 산소원자를 가지고 있기 때문이며 스캐폴드 표면에 폴리에틸렌글라이콜이 제대로 이식된 것을 증명하는 소견이다.
   인간의 정상 기관 조직을 얻기 힘들어 이전 연구에서 얻어진 개(beagle)의 기관 측정치와6) 비교한 폴리우레탄 스캐폴드의 긴장변형곡선(stress-strain curve) 형태는 개의 정상 기관과 비슷한 형태를 나타내었다(Fig. 7). 개의 기관은 약 500% 신장되었을 때 끊어졌고 폴리우레탄 스캐폴드는 약 600% 이상 신장되었을 때 끊어졌지만 장력에 따른 신장 정도를 나타내는 곡선의 전체적인 형태는 매우 비슷한 것으로 보아 폴리우레탄 스캐폴드가 개의 정상 기관과 매우 유사한 탄성을 가지고 있다는 것을 보여준다. 
   조직검사 소견을 보면 폴리우레탄 스캐폴드의 다공성 구조 내에 성긴 섬유조직이 성장해 들어와 있고 그 주변에 새로 형성된 혈관 및 출혈소견과 동반된 염증 세포가 관찰된다. 반면 대조군은 피부조직에만 절개를 가한 후 봉합하였기 때문에 피하 조직에는 별다른 소견은 관찰되지 않았다(Fig. 8). PCR 검사에서 보면 염증 반응과 관계되는 TNF-α, IL-6의 발현 정도는 폴리우레탄 스캐폴드 이식 부위에서 대조군에 비해 상대적으로 약간 높았으나 그 정도가 심하지는 않았다. 조직재생에 관계되는 procollagen, fibromodulin, fibronectin, actin의 발현 정도는 양측이 비슷한 결과를 보였는데 이는 폴리우레탄의 이식이 조직 재생을 유도하는 데 최소한 나쁜 영향은 주지 않을 것이란 것을 시사한다고 할 수 있다(Fig. 9).

고     찰

   갑상선암 수술 도중 기관침범이 발견되어 기관의 1
~2 cm 길이 정도의 일부 벽을 절제한 경우 어떠한 치료법을 쓸 것인가? 가장 확실한 방법은 손상된 부분을 포함하여 정상적인 기관의 위, 아래를 추가로 절제하고 건강한 기관을 서로 이어주는 단단문합술이지만 기관벽의 부분 손상을 재건하기 위해 정상적인 다른 부분까지 절제해야 하는 문제가 있고 만약 수술 후 염증 등이 발생하면 오히려 기관협착을 유발할 수도 있다. 따라서 예전부터 다양한 종류의 생체 조직과 인공 물질을 이용하여 기관의 일부 또는 전체를 위한 재건 방법이 모색되어 왔다. 하지만 생체 조직을 이용하는 경우 자가 조직의 경우 수혜자에게 조직 채취에 대한 부담과 위험이 있으며 조직 체취 후 배양/증식에 많은 시간이 필요하다.8,9,10) 반면 동종 조직이식이나 인공 조직이식의 경우 자가 조직이식에 따른 불편감은 적으나 이식 거부반응, 만성감염 및 육아조직 형성, 점막 상피 재생 불량, 접합부위의 파손 등 다양한 문제가 발생한다.1,2,3,4,5)
   이번 연구에서는 기관벽의 일부 손상시 임상현장에서 바로 사용 가능한 패취 형태의 기관 스캐폴드를 개발하고자 하였다. 폴리우레탄은 명칭 그대로 우레탄의 고분자 집합체로서 첨가물의 종류에 따라 다양한 형태와 강도를 가질 수 있기 때문에 타이어, 자동차 내장제, 접착제, 합성고무, 발포체, 섬유, 방수제, 카페트 등 일상 생활에서 널리 사용되고 있는 물질이다.11) 폴리우레탄의 장점은 그 넓은 사용처에서도 볼 수 있듯이 고무와 같은 탄성 및 유연성을 가지면서도 금속과 같은 내구성을 가진다는 것이다. 또한 플라스틱에 비해 한층 높은 충격저항성을 가지면서도 탄성기억력(elastic memory)은 높다.12) 이러한 장점으로 인해 최근 들어 피부 드레싱 재료,13) 인조혈관 및 각종 카테터 등14,15,16) 다양한 의료재료로 사용되고 있다.17) 폴리우레탄이 기관재건용 스캐폴드로서의 중요한 장점은 제작 방법에 따라 다양한 다공성(porosity)을 가지게 할 수 있다는 것이다. 다공성 구조는 인공물질이 인체 내에 삽입되었을 때 주변 정상조직으로부터 결체조직, 혈관 등이 성장해 들어와 생물학적 결합을 형성하는 데 필수적이다. 이번 연구에서는 막자 사발에 간 소금 가운데 100
~200 μm짜리 채를 통과한 것을 사용하였다. 이는 다공의 크기가 최소 40~60 μm 정도 되어야 모세혈관의 성장이 가능하고 너무 큰 경우 강도 및 공기밀폐성에 문제가 있기 때문이다.18)
   인공재료를 기관재건에 사용할 때 가장 문제가 되는 것이 호흡점막상피세포의 섬모운동에 의한 점액 배출 기능이 없어 가피가 형성되어 염증유발, 기도폐쇄, 인공기관탈락과 같은 합병증이 발생하는 것이다. 기관벽의 손상이 크지 않은 경우 염증만 잘 조절되면 주변 정상 점막에서 호흡점막상피세포가 성장해 들어온다. 따라서 인공기관 스캐폴드를 이식할 경우 주변 정상 점막이 성장해 들어올 때까지 가피형성을 억제하는 것이 필요하다. 폴리에틸렌글라이콜(PEG)과 폴리에틸렌옥사이드(Polyethylene oxide)는 상업적으로 사용되는 폴리에테르(polyether) 중에 가장 중요한 물질의 하나로 서로 연쇄 길이(chain length)와 말단기만 다를 뿐 동일한 구조를 가진 중합체이다. 폴리에틸렌글라이콜은 상온에서 액체 상태인데 반해 폴리에틸렌옥사이드는 낮은 녹는점을 가진 고체 상태(low-melting solid)로 존재하는데 그 점성의 차이 때문에 서로 다른 용도로 사용된다. 폴리에틸렌글라이콜이 가장 널리 사용되는 분야는 각종 윤활제의 기본 물질이며 피부외용제의 기본 물질로도 널리 사용된다.19) 폴리에틸렌글라이콜은 물, 메탄올, 벤젠 등에 용해되는데 특이한 특성 중의 하나가 소수성 분자(hydrophobic molecule)와 결합하여 비이온성 계면 활성제(non-ionic surfactant)를 형성한다는 점이다.19) 따라서 폴리에틸렌글라이콜을 폴리우레탄 스캐폴드 내부에 접합하여 일종의 계면 활성제로 작용하게 함으로써 가피 및 육아조직 형성이 줄어들고 주위로부터 정상 호흡점막상피세포가 성장해 들어올 때까지 시간을 확보할 수 있을 것이다. 중합체(polymer)의 표면에 다른 물질을 접합하기 위해 사용되는 다양한 표면 처리 방법들이 있다. 그 중 표면 산화 처리는 비교적 널리 쓰이는 방법으로 corona, radio frequency glow discharge, UV/ozone 등의 가스가 주로 사용되었으며20) 오존을 이용한 방법은 중합체의 표면에 고르게 과산화물(peroxide)을 형성할 뿐 아니라 다루기가 쉽고 비용이 비싸지 않기 때문에 널리 사용되는 방법이다.21) 따라서 본 연구에서도 표면처리의 방법으로 오존을 이용하였다. 전자 현미경 소견에서 보듯이 오존 처리 후 폴리우레탄 스캐폴드 표면에 많은 주름이 만들어졌으며(Fig. 5) 표면에 형성된 과산화물은 0-0-H 밴드를 가지게 되어 다른 물질의 접착을 용이하게 만들었고 XPS 결과에서 보듯이 폴리에틸렌글라이콜이 폴리우레탄 표면에 제대로 이식되었음을 알 수 있었다.
   스캐폴드 제작을 위한 주물(frame)은 초기에 강화 유리를 사용하여 세공하였으나 보관 및 사용상의 문제가 발견되어 클로로포름과 반응하지 않는 테플론을 이용하여 제작하였다. 테플론으로 제작된 프레임에 폴리우레탄 용액을 주입하여 스캐폴드를 제작하였으나 완성된 스캐폴드를 분석한 결과 폴리우레탄이 균질하게 분포하지 않고 중간중간에 깨짐(crack)이 발생하고 중간 부분이 잘 마르지 않는 문제점이 발견되었다. 이를 해결하기 위해 폴리우레탄 용액을 한 번에 다 주입하지 않고 여러 번에 나누어 주입하고 각 주입마다 다양한 시간 차이를 두어 가장 좋은 결과를 나타내는 시간대를 구한 결과 약 6시간 간격으로 2
~3회에 걸쳐 주입하는 것이 가장 질 좋은 스캐폴드를 얻을 수 있었다. 그러나 적당량 이상의 폴리우레탄 용액 이 주입되면 건조 과정에서 남는 용액에 의해서 깨짐 발생 및 균일하지 못한 두께의 스캐폴드가 얻어지는 문제점이 지속적으로 발생하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 시도를 하던 중 주물 위쪽 부위에 배출구(drain hole)를 만들어 폴리우레탄용액이 조금씩 흘러나오게 함으로써 중간부분까지 잘 건조되고 깨짐이 발생하지 않게 스캐폴드를 제작할 수 있었다(Fig. 2).
   이번 연구에서 가장 중점을 둔 것은 폴리우레탄 스캐폴드의 강도 및 인장력을 정상 기관 조직과 가장 비슷하게 만드는 것이다. 기관은 기침 반사시 매우 빠른 속도로 수축과 이완을 하게 되는데 이런 상황에서 이식된 스캐폴드의 강도 및 인장력에 차이가 있을 경우 접합된 부위가 서로 분리되는 상황이 발생하게 된다. 수차례의 반복연구를 통해 100
~200 μm 크기의 소금을 폴리우레탄 용액과 1 : 9 비율로 혼합하여 건조하였을 때 강도 및 인장력이 개의 정상기관과 가장 유사한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 7). 이번 연구에서는 개의 기관과 비교를 하였는데 이는 인간의 기관 조직을 얻기가 쉽지 않고 개의 기관의 해부학적 구조가 인간과 가장 비슷하기 때문이다. 
   폴리우레탄과 같은 인공물질이 체내에 삽입되었을 때 발생하는 문제는 염증반응이다. 폴리우레탄은 고분자로서 생체 내에서 불활성 상태로 유지되기 때문에 비교적 염증 반응이 적은 것으로 알려져 있다. 조직검사에서 보면 다공성 구조 안으로 섬유조직 및 모세혈관이 자라 들어와 있고 주변에 염증 세포가 있는 것이 관찰되었다. 섬유조직 및 모세혈관의 성장은 스캐폴드가 주변 조직과 생물학적으로 결합하는 소견으로 긍정적이나 염증세포의 침착은 염증반응을 시사하는 소견이다. 그러나 그 침착 정도가 심하지 않고 PCR 검사에서도 염증 반응 사이토카인의 발현 정도가 높지 않은 것으로 보아 폴리우레탄의 염증 유발 정도는 심하지 않은 것으로 생각된다. 


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