교신저자：박석원, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(042) 220-7697 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：parkyh@cnu.ac.kr

서     론

   문명의 발달에 따라 증가된 소음은 후천적으로 발생하는 청력소실의 중요한 원인이 되고 있다. 소음에 의한 청력소실의 기전으로는 다양한 가설들이 제시되고 있으나 주로 Corti 기에 직접적인 물리적 손상과 내이 대사작용의 변화로 설명되고 있다. 그 중 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성이 소음성 난청의 중요한 기전으로 생각되고 있는데 Ohlemiller 등¹⁾과 Yamane 등²⁾은 소음노출 후 와우에서 ROS의 증가를 관찰하였고 기존의 연구에서 다양한 항산화제로 ROS를 제거하여 소음에 의한 와우손상을 경감시켰다는 보고가 있다.³⁾⁴⁾⁵⁾
   또한 산화질소(nitric oxide, NO)에 의해 유발된 조직의 손상이 소음성 난청의 기전으로 제시되고 있는데 산화질소 합성효소(NO synthase, NOS)에 의해 생산되는 산화질소는 세포독성 매개체로 과산소 음이온(superoxide anion)과 반응하여 peroxynitrate를 형성하여 조직의 산화와 질소화를 매개하고 조직손상을 유발하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾
   Ebselen, 2-phenyl-1, 2-benzisoelenazol-3(2H)-one은 항산화 효소인 glutathione peroxidase와 유사하게 peroxynitrate와 반응하여 lipoxygenase, NO synthase, NADPH(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase, protein kinase C와 H⁺/K⁺-ATPase를 억제한다.⁷⁾ 기존의 연구에서 ebselen 이 gentamicin,⁸⁾ cisplatin⁹⁾¹⁰⁾에 의해 유발된 와우손상을 경감하는 것으로 보고 되었으며, 최근 소음에 의한 와우손상을 경감하였다는 보고가 있다.¹¹⁾¹²⁾
   본 연구에서는 ebselen의 소음에 의한 와우 손상에서 예방 또는 보호효과에 대한 유용성을 알아보고자 하였다. 소음노출 후 대조군과 ebselen투여군에서 청력의 변화를 관찰하고 세포독성의 매개체인 산화질소(nitric oxide, NO)를 유발하는 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현과 산화질소와 과산소(superoxide)의 반응으로 생성되어 조직의 손상을 일으키는 peroxynitrite(ONOO-)의 발현을 관찰하였다.

재료 및 방법

실험동물과 소음의 노출
   수술현미경하 검사상에서 정상고막을 보이며 청성뇌간반응에서 정상의 소견을 보이는 6주령의 Sprague-Dawley 쥐(250~300 g) 30마리를 사용하였다. 방음 처리된 박스형으로 만들어진 100×80×60 cm의 동물우리 속에 쥐를 넣고 115 dB SPL, 125 Hz~12kHz의 광대역 소음에 6시간 노출시켰다. 소음원은 Goldwave(ver 5.09, Goldwave Inc.) 프로그램을 이용하여 증폭기와 두개의 스피커를 연결하여 사용하며 동물우리 속의 소음강도는 모서리를 포함한 9곳에서 1 dB 이내의 차이를 보이게 하였다.

실험군의 분류와 약물의 투여
   실험군은 각각 15마리씩 대조군과 ebselen 투여군으로 분류한다. Ebselen(Sigma, St. Louis, MO)은 10 mg을 1 mL dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해하고, 생리식염수로 희석하여 10 mg/kg의 용량으로 소음노출 12시간 전과1시간 전에 각각 복강내 투여하였다. 대조군에서는 Ebselen 투여군과 동량의 용매를 소음노출 12시간 전과 1시간 전에 각각 복강내 투여하였다. 예비의 실험으로 소음에 노출하지 않고 ebselen만 투여한 군에서는 청력의 변화가 관찰되지 않아 실험군에서 제외하였다.

청성뇌간반응의 측정
   청성뇌간반응의 측정을 위해 실험동물은 xylazine(10 mg/kg)와 ketamine(40 mg/kg)의 혼합액으로 근육마취를 시행하고 직장체온은 37℃ 이상, 심박동수는 210~270회/분으로 유지하였으며 방음실에서 ICS사의 MCU-80을 사용하여 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 삽입형 ear tip(3.5 mm, Nicolet Biomedical, Inc.)을 안연고를 도포하여 외이도에 위치시키고 전극은 활동전극을 두정부에, 기준전극은 측정할 귀의 후외부에, 접지전극은 반대측귀의 후외부에 위치하였다. 자극음은 100 μs의 click과 1 ms의 rise-fall time을 갖는 15 ms의 tone burst를 21.1/s로 주었으며, 청성뇌간반응의 측정은 파형을 얻기 위하여 1024 tone presentation을 평균하였고 2, 4, 8 kHz에서 역치를 측정하였다. 역치의 근방에서 음의 강도는 5 dB 간격으로 측정하였으며 청성뇌간반응의 역치는 제 1, 3, 5 파형이 나타나는 최소의 자극강도로 정의 하였다. 대조군과 ebselen투여군 모두에서 약물투여 전에 청성뇌간반응을 측정하여 기준점으로 정하였으며 시간의 변동에 따른 청성뇌간반응의 역치변화를 관찰하기 위하여 소음노출직후, 소음노출 3, 6, 12와 24시간 후에 각각 측정하였다.

조직학적 관찰

조직의 준비
   대조군과 ebselen 투여군에서 각각 5마리씩 소음노출 24시간 후에 실험동물은 ketamine과 xylazine의 혼합액으로 깊게 마취한 뒤 동물의 측두골을 채취하여 해부 현미경하에서 와우의 첨부와 등골을 제거하고 pH 7.4의 2% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 1시간동안 와우내 고정하였다.
   Phalloidin염색을 하기 위하여 체취한 와우는 해부 현미경하에서 기저 회전부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner막, 개막의 순서로 제거하여 와우 첨부로부터 기저부까지 전체의Corti 기관을 분리하였다.
   전자현미경적 관찰을 위하여 체취한 와우는 등골을 와우의 난원창으로부터 분리한 뒤 와우의 첨단을 개방하고 2.5% glutaraldehyde(pH7.2) 고정액으로 관류하고 고정액 내에서 와우의 기저 회전부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner막, 개막의 순서로 제거하였다.
   Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL) 염색과 iNOS 및 nitrotyrosin 의 면역조직화학염색을 위하여 와우는 pH7.4의 2% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 실온에서 12시간 동안 고정 후 hydrochloric acid(Apex Engineering Products Co, Aurora, IL)를 이용하여 약 30분간 탈회하였으며 파라핀에 포매한 다음 10 μm 두께로 절편을 만들었다.

유모세포의 손상확인
   손상된 유모세포를 확인하기 위하여 분리된 조직은 pH 7.4인 phosphated buffered solution으로 세척하고 0.3% Triton-X로 처리한뒤 flurorescein isothiocyanate(FITC)로 표지된 phalloidin(1：50；sigma, St. Louis, MO)으로 30분간 반응시킨 후 다시 PBS로 세척하고 수용성 마운트로 포매하여 형광현미경(BX50W/PH20, Olympus, Tokyo, Japan)하에 관찰하였다.
   전자현미경적 관찰을 위하여 glutaraldehyde에 고정된 조직은 탈수와 금도금 과정을 거쳐 주사전자현미경(S2500, Hitach, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다.

Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL) 염색
   세포자멸사를 확인하기 위하여 준비한 파라핀 절편에 TUNEL staining Kit(ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kt, Serologicals, USA)를 이용하였다. 조직절편은 xylene으로 5분간 3회 탈파라핀을 시행하고 99%, 95%, 70%의 alcohol 로 처리하였으며 20 μg/ml의 Proteinase K로 실온에서 약 15분간 반응시킨 후 내인성 peroxidase의 활성을 저지하기 위하여 3% H2O2(Sigma, St. Louis, MO) in PBS로 처리하였다. Equilibration buffer로 약 10초간 처리한 뒤 working strength TdT enzyme으로 37℃ Chamber에서 1시간 반응시키고 working strength stop/wash buffer로 약 10분간 처리하였다. PBS로 세정한 뒤 anti-digoxigenin conjugate로 실온에서 30분간 처리하고 PBS로 세정한 뒤 peroxidase substrate는 diaminobenzidine(DAB)로 발색하였고 대조염색으로는 hematoxylin을 사용하여 약 10분간 시행하였고 증류수에 세정하고 마운트하여 광학 현미경 (BX50W/PH20, Olympus, Tokyo, Japan)하에 관찰하였다.

iNOS와 nitrotyrosine의 면역조직화학염색
   소음 노출후 와우내 iNOS와 peroxynitrite의 발현을 알아보기 위하여 iNOS와 nitrotyrosine에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다. 탈파라핀 후 조직 절편을 citrate buffer(pH 6.0) 용액에 담근 다음 5분씩 2회에 걸쳐 microwave에 넣어 가열하였다. 0.1M PBS로 세정하고 내인성 peroxidase의 활성을 저지하기 위하여 0.5% periodic acid 용액에 10분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세정하였다. 세정 후 ABC kit(DakoCytomation, Carpinteria, CA)에 포함되어 있는 blocking serum(normal goat serum)을 1시간 동안 반응시키고 일차항체로 iNOS(1：200, Transduction Laboratories, Lexington, KY)와 nitrotyrosine(1：200, Upstate Biotechnology Co., Lake Placid, NY)으로 처리하여 4℃에서 12시간 반응시켰다. PBS로 세정후 이차 항체로는 biotinylated anti-rabbit IgG에 1시간 반응시켰으며 streptavidin-biotin-peroxidase로 1시간 반응시키고 발색은 diaminobenzidine(DAB)로 시행하였으며 methyl green으로 대조염색을 하였다.

통계학적 검정
   통계학적 검정은 SPSS(Version 12.0)을 이용하였다. 대조군과 약물 투여군에서 청성뇌간반응의 각각 시간대별 역치변화의 차이는 Student T-test를 이용하였고, 각 그룹내의 청성뇌간반응의 시간대별 차이는 One way ANOVA를 사용하였다.

결     과

청성뇌간반응의 역치변화
   실험동물 각각의 소음 노출전 기준점 청력은 유사하였으며 소음노출 직후와 소음노출 3, 6, 12와 24시간 후에 대조군과 ebselen 투여군에서 각각 시간대별 6마리씩 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. click으로 자극하고 측정한 결과에서 대조군에서는 각 시간대별 55±5.48, 47.5±7.58, 44.2±7.36, 44.2±4.92, 42.5±2.74 dB SPL로 소음노출 직후에 최고의 청성뇌간반응 역치상승을 보였으며, ebselen 투여군에서도 소음노출 직후와 소음노출 3, 6, 12와 24시간후에 청성뇌간반응의 역치변화는 시간대별 40.8±8.61, 35±9.47, 29.2±8.01, 25.8±9.17, 22.5±6.12 dB SPL로 소음노출 직후에 최고의 청성뇌간반응 역치상승을 보였다.
   Ebselen 투여군과 대조군에서 청성뇌간반응 역치상승의 정도는ebselen 투여군에서 대조군에 비하여 3, 6, 12와 24 시간에 각각 통계학적으로 유의 하게 역치상승 정도의 감소를 보였다(p<0.05). 각 그룹내 시간대별 역치상승 정도의 변화는 대조군과 ebselen 투여군에서 모두 소음노출 직후에 최고의 역치상승을 보이며 시간의 경과에 따라 역치상승 정도의 감소를 보였으나 소음노출후 24시간까지 유의한 청력의 회복은 보이지 않았다(Fig. 1).
   2, 4와 8 kHz의 tone에서 측정한 청성뇌간반응의 시간대별 역치변화는 Figs. 2, 3 and 4와 같으며 역치상승 및 시간대별 역치변화는 click으로 측정한 결과와 유사한 결과를 얻었다. Ebselen 투여군에서 대조군에 비하여 3, 6, 12와 24시간에 각각 통계학적으로 유의하게 역치상승 정도의 감소를 보였다(p<0.05).

유모세포의 손상확인
   유모세포의 손상을 확인하기 위하여 시행한 phalloidin 염색에서 대조군과 ebselen투여군 모두에서 소음노출 후 유모세포의 손상을 관찰할 수 있었다. 유모세포의 손상은 주로 외유모세포와 일부 내유모세포에서 관찰되었으며 주로 중간 회전에 위치하는 부분에서 주로 관찰되었다(Fig. 5). 주사전자현미경적 관찰에서 유모세포의 손상은 대조군과 ebselen 투여군 모두에서 난원창으로부터 1.5~2회전 부근에서 형태학적 변화가 관찰되었다. 대조군에서는 외유모세포의 배열이 불규칙해지고 부동모의 소실, 단축, 융합과 같은 퇴행성의 변화를 보였으며 ebselen 투여군에서도 외유모세포의 소실, 융합등을 보였으나 대조군에 비하여 그 손상의 정도의 경중을 측정하기는 어려웠다(Fig. 6).

Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL) 염색 
   유모세포의 손상 및 와우내 세포자멸사를 관찰하기 위한 TUNEL염색에서 대조군과 ebselen투여군 모두 외유모세포에서 세포자멸사가 관찰되었으며 특히 대조군에서는 ebselen 투여군에 비하여 다른 지지세포와 와우의 측벽에서도 세포자멸사가 뚜렷하게 관찰되었으며 와우의 나선 신경절에서도 ebselen 투여군에 비하여 많은 수의 세포자멸사가 관찰되었다(Fig. 7).

iNOS와 Nitrotyrosine의 면역조직화학염색
   iNOS의 발현은 내유모세포, 외유모세포, 지지세포, 혈관조, 나선신경절의 신경세포 등에서 관찰되었으며 nitrotyrosine의 발현은 주로 유모세포, 유모세포 신경접합부, 혈관조와 나선신경절의 신경세포 등에서 관찰되었다. 유모세포에서nitrotyrosine의 발현은 iNOS의 발현에 비하여 발현의 정도가 뚜렷하지는 않았다. Ebselen 투여군에서는 대조군에 비하여 iNOS의 발현이 현저히 감소되어 있었으며 nitrotyrosine의 발현도 ebselen 투여군에서 대조군에 비하여 감소되어 있었다(Figs. 8 and 9).

고     찰

   소음성 난청은 매년 증가하는 추세에 있으며 주로 내이 유모세포의 손상으로 발생한다. 손상의 초기에는 외유모세포가 영향을 받으나 점차로 지주세포, 내유모세포와 와우신경핵의 손상을 초래한다.¹³⁾ 과다한 소음노출로 인한 내이의 손상은 비가역적이어서 영구적인 청력소실을 유발하게 된다.
   본 연구에서도 115 dB SPL, 125 Hz~12kHz의 광대역 소음에 6시간 노출 후 와우내 유모세포의 손상이 관찰되었으며 또한 TUNEL 염색에서 손상된 유모세포와 주변의 지지세포, 혈관조 및 나선신경절 세포에서도 세포자멸사가 관찰되었다. 청력의 변화는 노출된 소음의 정도에 따라 가역적 혹은 비가역적일 수 있으나 본 연구에서는 소음노출 후 24시간까지 측정한 청성뇌간반응의 역치변화에서 소음노출 후에 청성뇌간반응의 회복의 근거는 없었다.
   내이의 손상은 소음 노출 후에 형성되는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)와 활성질소(reactive nitrogen species, RNS)가 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있으며¹⁾²⁾ 이러한 활성물질들은 세포막의 단백, 지방, 그리고 핵산과 반응하여 세포의 손상과 자멸사를 유도한다.¹⁴⁾
   기존의 보고에서 소음의 노출후에 변화된 와우내 미세 혈류와¹⁵⁾ 증가된 mitochondrial activity는 ROS를 증가시키는데 이는 세포막과 반응하여 4-hydroxy-2-noneal(4-HNE)을 형성을 유도하고 이는 신경세포의 자연고사를 유발한다.¹⁶⁾ 또한 내형성 항산화제인 glutathione이 소음 노출 후에 증가되는 것이 알려졌으며¹⁷⁾ 다양한 항산화제로 ROS를 제거하여 소음에 의한 와우 손상을 경감하려는 연구들이 진행되어 왔다.³⁾⁴⁾⁵⁾ 최근에는 guinea pig에서 내형성 황산화제인 glutathione이 소음에 의한 청력소실에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 glutathione 합성의 억제 역할을 하는 L-buthionine-[S, R]-sulfoximine(BSO)와 cysteine의 전구약물로 glutathione의 회복을 촉진하는 2-oxothiazolidine-4-carboxylate(OTC)를 투여한 실험에서 BSO를 투여한 군에서 대조군보다 청력소실이 뚜렷하였으며 OTC를 투여한 군에서 대조군보다 청력소실의 경감을 관찰하였다. 이러한 결과로 소음에 의한 청력소실에서 항산화제인 glutathione의 보호효과를 보고하였고 이러한 결과로 활성산소의 발생이 소음성난청의 중요한 기전으로 제시하였다.¹⁷⁾ 또한 Ohinata 등¹⁸⁾은 소음에 의해 유발된 청력소실과 활성산소 형성의 관계를 알아보기 위하여 ROS의 생화학적, 조직화학적 지표로 지질 과산화의 산물인 8-isoprostane을 측정한 실험에서 소음노출 5시간 후에 8-isoprostane의 양이 기준보다 약 30배 증가함을 관찰하여 ROS가 소음에 의한 청력소실에 관여함을 제시하였다.
   와우손상에서 활성질소(reactive nitrogen species, RNS)는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)에 비해서 주목을 받지 못하였지만 와우 생리에서 신경전달과 혈류조절 어떠한 병적인 조건에서 세포독성을 가지는 것으로 생각되어 소음성 난청의 기전에 관여할 것으로 생각되고 있다.⁸⁾ 활성질소는 산화질소와 과산소의 반응으로부터 유발되며 대표적인 물질은 peroxynitrite는 지질 과산화, 질소화와 DNA의 분열 등을 유발하며 세포손상을 야기한다.⁶⁾ Yamashita등¹⁹⁾은 동물 실험에서 소음노출 후에 자유기(free radicals)의 관찰에서 조기의 유모세포의 손상은 물리적인 손상과 ROS의 생성에 의하며 지속적으로 생성된 ROS와 RNS가 후기 지속적인 유모세포의 손상에 관여할 것이라고 하였다.
   최근의 연구에서 산화질소가 내이의 기능을 유지하는데 중요하게 생각되고 있는데 와우내에서 산화질소는 구심성 신경과 내유모세포의 신경접합부, 외유모세포 근처의 원심성신경 접합부, 혈관조와 나선인대의 혈관 내피세포에서 발견되며²⁰⁾ 이러한 결과는 산화질소가 정상 청각 생리의 유지에 중요한 역할을 하고 있음을 간접적으로 시사한다.
   본 연구에서는 세포독성의 매개체인 산화질소(nitric oxide, NO)를 유발하는 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현과 산화질소와 과산소(superoxide)의 반응으로 생성되어 조직의 손상을 일으키는 것으로 알려진 peroxynitrite(ONOO-)의 발현을 관찰하였다. iNOS의 발현은 내유모세포, 외유모세포, 지지세포, 혈관조, 나선신경절의 신경세포 등에서 관찰되었으며 nitrotyrosine의 발현은 주로 유모세포, 유모세포 신경접합부, 혈관조와 나선신경절의 신경세포 등에서 관찰되었다. 유모세포에서nitrotyrosine의 발현은 iNOS의 발현에 비하여 발현의 정도가 뚜렷하지 않은 양상이었으며, ebselen 투여군에서 대조군에 비하여 iNOS의 발현이 현저히 감소되어 있었고 nitrotyrosine의 발현도 ebselen 투여군에서 대조군에 비하여 감소되어 있었다. 이러한 결과는 ROS 이외에 RNS에 의한 조직손상도 소음에 의한 와우손상의 기전으로 작용할 것으로 생각되며 ebselen이 glutathione과 유사하게 peroxynitrite의 제거제의 역할을 한 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서는 소음에 노출된 환경에 항산화 효과를 가지는 ebselen을 투여한 후 청력의 변화를 관찰하고 유모세포의 손상여부를 관찰하였으며 산화질소를 유도하는 산화질소 합성 효소중 iNOS와 peroxynitrite의 존재 및 활성도를 간접적으로 알수 있는 nitrotyrosine의 발현을 면역조직화학 염색법을 통하여 관찰하였다. 대조군과 비교하여 ebselen투여군에서 소음노출 후 청력의 소실이 유의하게 감소하였으며 iNOS와 nitrotyrosine의 발현도 감소한 양상을 보였다. 이것은 ebselen이 peroxynitrite의 제거제의 역할을 한 것으로 생각되어 산화질소에 의한 조직손상이 소음에 의한 와우손상의 기전으로 작용할 것으로 생각된다. 결론적으로 소음노출 후 내이에서 발생하는 세포의 손상과 그에 따른 청력의 소실의 기전에서 산화질소와 peroxynitrite가 중요한 역할을 하는 것으로 생각되어 ROS 이외에 RNS가 관여하는 것으로 생각된다. 또한 이러한 와우손상에서 과산소, 산화질소, peroxynitrite 등의 생성을 억제하는 효과로 ebselen이 효과적인 예방 및 치료제로 적용될 수 있을 것으로 생각한다.

1. Ohlemiller KK, Wright JS, Dugan LL. Early elevation of cochlear reactive oxygen species following noise exposure. Audiol Neurootol 1999;4:229-36.

2. Yamane H, Nakai Y, Takayama M, Iguchi H, Nakagawa T, Kojima A. Appearance of free radicals in the guinea pig inner ear after noiseinduced acoustic trauma. Eur Arch Otorhinolaryngol 1995;252:504-8.

3. Seidman MD, Shivapuja BG, Quirk WS. The protective effects of allopurinol and superoxide dismutase on noise-induced cochlear damage. Otolaryngol Head Neck Surg 1993;109:1052-6.

4. Quirk WS, Shivapuja BG, Schwimmer CL, Seidman MD. Lipid peroxidation inhibitor attenuates noise-induced temporary threshold shifts. Hear Res 1994;74:217-20.

5. Yamasoba T, Schacht J, Shoji F, Miller JM. Attenuation of cochlear damage from noise trauma by an iron chelator, a free radical scavenger and glial cell line-derived neurotrophic factor in vivo. Brain Res 1999;815:317-25.

6. Arteel GE, Briviba K, Sies H. Protection against peroxynitrite. FEBS Lett 1999;445:226-30.

7. Schewe C, Schewe T, Wendel A. Strong inhibition of mamamalian lipoxygenases by the antiinflammatory seleno-organic compound ebselen in the absence of glutathione. Biochem Pharmacol 1994;48:65-74.

8. Takumida M, Popa R, Anniko M. Free radicals in the guinea pig inner ear following gentamicin exposure. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1999;61:63-70.

9. Kopke RD, Liu W, Gabaizadeh R, Jacono A, Feghali J, Spray D, et al. Use of organotypic cultures of Corti's organ to study the protective effects of antioxidant molecules on cisplatin-induced damage of auditory hair cells. Am J Otol 1997;18:559-71.

10. Rybak LP, Hussain K, Morris C, Whitworth C, Somani S. Effect of protective agents against cisplatin ototoxicity. Am J Otol 2000;21:513-20.

11. Pourbakht A, Yamasoba T. Ebselen attenuates cochlear damage caused by acoustic trauma. Hear Res 2003;181:100-8.

12. Lynch ED, Gu R, Pierce C, Kil J. Ebselen-mediated protection from single and repeated noise exposure in rat. Laryngoscope 2004;114:333-7.

13. Bohne BA. Mechanisms of noise damage in the inner ear. In: Henderson D, Hamernik R, Dosangh DS, Miller DK, editors. Effects of Noise on Hearing. New York; Raven Press;1976. p.41-70.

14. Ohinata Y, Miller JM, Schacht J. Protection from noise-induced lipid peroxidation and hair cell loss in the cochlea. Brain Res 2003;966:265-73.

15. Scheibe F, Haupt H, Nuttall AL, Ludwig C. Laser Doppler measurements of cochlear blood flow during loud sound presentation. Eur Arch Otorhinolaryngol 1990;247:84-8.

16. Kruman I, Bruce-Keller AJ, Bredesen D, Waeg G, Mattson MP. Evidence that 4-hydroxynoneal mediates oxidative stress-induced neuronal apoptosis. J Neurosci 1997;17:5089-100.

17. Yamasoba T, Nuttall AL, Harris C, Raphael Y, Miller JM. Role of glutathione in protection against noise-induced hearing loss. Brain Res 1998;784:82-90.

18. Ohinata Y, Miller JM, Altschuler RA, Schacht J. Intense noise induces formation of vasoactive lipid peroxidation products in the cochlea. Brain Res 2000;878:163-73.

19. Yamashita D, Jiang HY, Schacht J, Miller JM. Delayed production of free radicals following noise exposure. Brain Res 2004;1019:201-9.

20. Shi X, Ren T, Nuttall AL. The electrochemical and fluorescence detection of nitric oxide in the cochlea and its increase following loud sound. Hear Res 2002;164:49-58.