교신저자：방충일, 420-743 경기도 부천시 원미구 소사동 2번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   마우스의 세반고리관은 임신 13.5일에 발달을 시작하여 14.5일에는 팽대부릉(crista ampullaris) 신경세포, 15.5일에는 팽대부릉정(cupula)이 형성되면서 출생일인 20.5일에는 모든 전정유모세포와 함께 완성된다.¹⁾ 구심성 전정신경에서 축삭내 표지법(intra-axonal labelling) 등을 이용한 형태학 및 전기생리학적 연구는 어류,²⁾³⁾ 양서류,⁴⁾ 파충류와⁵⁾⁶⁾ 조류에서⁷⁾ 이루어져 왔으며, 포유류에서는 친칠라^8)9)10)와 원숭이를¹¹⁾¹²⁾ 이용한 연구 결과 등이 있으나 연구에 이용된 실험동물의 수가 적다는(친칠라 36마리, 원숭이 5마리) 한계가 있다. in vitro나 in vivo 마우스를 이용한 전정신경의 전기생리학적 실험은, 충분히 많은 실험 개체수를 사용할 수 있고, 다루기 쉬우며 또한, 최근 마우스에 대한 유전자지도(mouse genome) 연구가 상당히 진행되어 오고 있고 청각계와 전정계에 관련한 여러 유전자 마우스 변이종이 개발되고 있어 이를 이용한 질병의 병태 생리적인 정보가 미흡한 실정이다. 이러한 시점에서 마우스 전정신경의 전기생리학적기초 연구는 반드시 필요하다고 하겠다. 본 연구에서는 마우스의 일차 구심성 전정신경과 말단 신경연접에서의 전기 생리학적 특성을 연구할 수 있는 in vitro 내이 실험표본을 개발하고, 되도록 말단 신경 연접과 가까운 부위에서 신경의 전기적 신호를 기록하고 동시에 해당 축삭내로 표시자(tracer)를 주입하여, 전정신경 말단의 형태와 위치에 따른 신경 활동의 특성을 분석하여, 다른 포유류에서 얻어진 결과들과 비교해 본 in vitro 마우스 내이 실험표본의 유용성을 알아 보고자하였다. 또한 압전변환기(piezoelectric transducer)를 이용한 미세밀기장치(micropusher)로 전정 세반고리관의 막부에 기계적 자극으로 내림프의 흐름을 만들어 전정팽대부릉의 전정 유모세포를 자극하고 이때 구심성 전정신경으로부터 신경의 전기적 활동을 기록하여 마우스의 전정 유모세포와 전정신경말단 사이의 신호 전달(signal transduction) 여부를 확인하여, 향후 in vivo 마우스 실험표본 개발에 기초 자료로 사용하고자 하였다.

재료 및 방법

일차 구심성 전정신경의 축삭내 표지(Intra-axonal labelling)
   머리두기(head position)와 걸음걸이에 이상이 없는 생후 2~3주(체중 9.2±1.3 g)의 C57BL6 마우스 200마리를 암수 구별 없이 사용하였다. 체중 1 g당 0.4 mg의 ketamine HCl을 복강내 주사하여 희생시킨 후, 미리 만들어 놓은 슬러시(slush) 형태의 sucrose Ringer 용액 내에서 양측 측두골을 빠르게 절제하였다. 현미경하에서(Stemi SV II, Zeiss, Germany) 전, 외반고리관 팽대부를 덮고 있는 골부를 제거하여 팽대부 막부와 전, 외팽대부신경을 노출시켰다(Fig. 1). 겔(gel) 형태의 순간접착제를 이용해 3.0×3.0 mm 크기의 유리 슬라이드 위에 측두골을 고정시킨 후, Ringer 용액이 흐르는(0.7 ml/초) 기록실(recording chamber) 안에 담그고 작은 핀을 이용해 유리판을 고정시켰다. 용액 내로 carbogen(95% O₂+5% CO₂)을 공급하고(1.0 l/분), 기록실내의 Ringer 용액의 온도는 22℃, 27℃, 34℃ 세 조건으로 하였다. 직경 1.5 mm의 borosilicate 유리관(WPI, Sarasota, FL, USA)을 micropipette puller (Model p-97, Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA)를 이용, 끝의 직경이 약 1 μm 되게 기록전극을 만들고, Neurobiotin tracer(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 0.1 M Tris 완충용액(pH 7.4)에 0.5 M KCl로 만든 인공세포내액(artificial intracellular solution) 속에 녹여 4% 용액으로 기록전극 속에 3분의 2 정도 채웠다. 기록전극의 저항값은 그 끝이 축삭에 안정적으로 위치할 때 70~90 MΩ으로 유지하며, 기록실과 전극의 미세조절장치는 공기를 채운 튜브 위에 올려놓아 외부로부터의 진동을 차단하였다. 현미경하에서 기록전극을 전정 팽대부에서 약 200~500 μm 정도 떨어진 지점의 전 또는 외팽대부신경다발 내로 전진시켜 자발활동전위(spontaneous action potential)를 찾아내 전극의 끝이 축삭내에 위치함을 확인하였다.
   축삭내에 위치한 전극과 세포외전극 사이의 전압차는 예비증폭기(pre-amplifier)를 거쳐 주증폭기(main-amplifier)에서 증폭시킨 후 필터(30~1000 Hz)를 거쳐 oscilloscope 나타나게 하며 아날로그-디지털 변환기를 거쳐 컴퓨터에 입력하였다(Fig. 2). 전정신경의 활동전위를 기록한 후 전극을 통해 +5.0 nA의 전류를 흘려보내 Neurobiotin tracer를 축삭내로 주입시켰다. 이때 전류는 2초 간격으로 1초씩 총 3분간 흐르게 하였다. 

전정신경말단의 염색
   측두골을 0.1 M PO₄, 완충용액내의 4% paraformaldehyde와 0.5% glutaraldehyde 고정액에 하루 정도 담아둔 후 꺼내어 30% sucrose 용액 내에서 측두골의 골부 전체와 막부의 팽대부 지붕을 제거하고 12% gelatin, 30% sucrose 용액에 포매시켜 블럭을 만들고 30% sucrose, 0.1 M PO₄, 완충용액내의 4% paraformaldehyde, 0.5% glutaldehyde 용액에서 다시 하루 정도 고정시켰다. 블럭은 0.1 M PO₄ 완충용액에서 세척한 후 25 μm 두께로 냉동 절편을 만들었다. 절편은 0.1 M PO₄ 완충용액이 담긴 용기에 순서대로 구분하여 옮긴 후 endogenous peroxidase를 제거하고 ABC kit(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)를 이용, Avidin-Biotin-Complex-Triton 용액에 3시간 반응시킨 후 DAB(diaminobenzidine)와 1% cobalt chloride, 1% nickel ammonium용액에서 15분간 반응시키고 0.3% H₂O₂ 용액으로 발색시켰다. 절편을 40% ethanol-gelatin 용액에서 편 다음, egg albumin이 덮인 슬라이드 글라스 위에 순서대로 놓고 8시간 동안 건조시킨 후 crystal violet 용액으로 염색하여 현미경하에서 검게 염색된 해당 전정신경의 축삭과 신경말단을 관찰하고 팽대부릉에 위치를 그렸다. 한편, 세 마리의 마우스 측두골에서 Osmium-Thiocarbohydrazide-Osmium(OTO) method로 주사전자현미경을 이용 팽대부릉의 형태를 관찰하였다.

전정신경의 활동 분석
   각각의 자발활동전위는 변동계수(CV；Coefficient of variation, 전위의 표준편차/활동전위의 간격)를 기준으로 규칙적(regular, CV<0.1), 불규칙적(irregular, CV≥0.4) 및 중간적(intermediate, 0.1≤CV<0.4) 활동으로 나누고¹¹⁾ 해당 신경말단의 팽대부릉 내에서의 위치, 형태와의 관계를 분석하였다(Fig. 3).

전정유모세포에서 전정신경말단으로 신호전달 확인 
   동일한 마우스 측두골 모델에서 전, 외반고리관의 팽대부 끝에서 팽대부의 반대 방향으로 200 μm 거리에 골부를 제거하여 20×50 μm 크기의 창을 만들고 전, 외반고리관의 막부를 노출시켰다(Fig. 1). 이 창을 통해 압전변환기(piezoelectric transducer)를 이용한 미세밀기장치(micropusher)로 여러 주파수(0.01~10.0 Hz)의 기계적 진동을 주고 내림프의 흐름을 만들어 전정유모세포를 자극하게 하고 동일한 방법으로 구심성 전정신경의 축삭으로부터 활동전위를 기록하여 각각 전, 외반고리관에서 내림프액의 흐름의 방향과 자극 주파수에 따른 축삭의 활동를 분석하였다. 미세밀기장치의 끝은 막성미로 표면에서 내측으로 10 μm 전진한 후 10 μm 진폭으로 내, 외측으로 움직이게 하였다.

통계분석
   통계는 unpaired t-test로 규칙성에 따른 자발전위 개수 차이, 온도 조건 따른 자발활동전위수와 안정기 막전위의 차이 및 전정막부 진동 자극시 신경활동의 변화 정도를 검정하였으며 p값은 0.01 이하일 때 유의하다고 하였고 분석 자료는 평균±표준편차로 나타내었다.

결     과

측두골 적출 후 신경의 활동 유지시간
   Ketamine HCl을 복강내 주사하여 호흡이 없어진 후부터 양측 측두골을 적출하고 전, 외 팽대부릉신경을 노출시켜 Ringer 용액이 흐르는 기록실에 담그기까지 걸린 시간은 31.0±5.0분이었고, 전정신경의 자발활동전위는 측두골 적출 후 7시간 이상 지난 후에도 기록할 수 있었다.

마우스 팽대부릉과 팽대부신경의 형태
   마우스 수평반고리관과는 달리 수직반고리관의 팽대부릉의 중앙에는 융기(torus)가 있고 이곳의 표면에는 전정유모세포가 없이 지지세포(supporting cell)로만 이루어져 있었다(Fig. 4). 또한 전팽대부신경(anterior ampullary nerve)은 외팽대부신경(lateral ampullary nerve)과 달리 미로막부(membranous labyrinth)를 통과하기 전에 내, 외측의 두 다발로 나뉘고(Fig. 5), 팽대부릉 내에서는 중앙 융기부를 서로 넘지 않고 있었으며, 전, 외팽대부릉에는 1,991±179개의(측두골 5개의 평균±표준편차) 전정유모세포가 분포되어 있었다.

일차구심성 전정신경 말단의 모양 및 분포 
   312개의 전, 외팽대부신경축삭 내에서 자발활동전위를 기록할 수 있었으며, 1분 이상 자발활동전위를 지속하는 축삭들의 첫 15초 이내에 측정한 안정기 막전위(resting membrane potential)는 45.0±9.8 mV이었고 외부 전류자극이나 기계적 자극이 없는 상태에서의 자발활동전위수는 9~71개/초 이었는데 규칙적 활동성을 보이는 축삭(58.7±6.3개)의 자발활동전위수가 불규칙적인 축삭(49.1±13.0)보다 많았다(p<0.01). 막전위와 자발활동전위의 수는 시간이 지남에 따라 점점 감소하였으며, 축삭내로 양전류(+0.2 nA, +0.5 nA)를 흘려 보낼 때 신경의 활동성은 증가되고 음전류를(-0.2 nA, -0.5 nA) 흘려 보낼 때 감소되었으며, 세 가지 온도 22℃, 27℃, 34℃에서 자발활동전위수의 개수와 막전위의 차이는 없었다. Neurobiotin으로 신경말단이 염색된 것은 71개였고, 대부분이 단추형(bouton type)과 잔형(calyceal type)을 동시에 갖고 있는 이중형(dimorphic type)이었고(79.0%) 단추형만으로 이루어진 말단은 염색되지 않았다(Table 1)(Fig. 6). 잔형 말단의 개수는 전반고리관의 이중형 말단에서 두 개인 경우가 가장 많았고(71.4%) 순수 잔형 말단에서도 두 개인 경우가 가장 많았으나(70.0%), 외반고리관의 경우에는 이중형일 때 잔형말단이 하나인 것은 45.0%, 두 개인 것은 50.0%로 비슷하였고 순수 잔형말단도 각각 60.0%, 40.0%이었다(Table 2).

일차구심성 전정신경 활동과 팽대부릉에서 신경말단의 분포
   전반고리관의 팽대부릉에서 자발 활동이 규칙적인 말단(CV <0.1)은 8.9%(4/45)로 가장 적었고, 불규칙적인 말단(CV >0.4)이 31.1%(14/45), 중간적인 활동을 보이는 말단(0.1 0.4)이 27.0%(7/26), 중간적인 활동을 보이는 말단(0.1    전, 외팽대부릉을 평면으로 펼쳐 그 위에 각 말단의 위치를 표시한 그림에서 자발 활동이 규칙적인 말단은 팽대부릉의 가장자리에, 불규칙적인 말단은 중심부위에 분포하고 중간적인 활동을 보이는 말단은 팽대부릉의 가장자리와 중심부 사이에 위치함을 알 수 있었다. 잔형의 말단은 팽대부릉의 가장자리와 중간 부위에서 이중형 말단은 팽대부릉의 전역에 걸쳐 관찰할 수 있었다(Fig. 7).

전정유모세포에서 전정신경말단으로의 신호전달 확인 
   압전변환기를 이용한 미세밀기장치는 주파수 0.01~10.0 Hz 범위에서 진폭(peak to peak) 20 μm까지 움직임이 선형성(linearity)을 유지하고 있었다. 미세밀기장치의 끝을 전반고리관의 막부 내측 방향으로 움직여 자극을 주었을 때 전팽대부신경축삭에서 기록한 활동전위 수가 감소하였고(12.5±9.9개/초) 반대로 외측 방향으로 움직일 때는 증가하였다(54.2±14.9개/초, p<0.01). 외반고리관에서는 내측방향으로 움직여 자극을 주었을 때 외팽대부신경축삭에서 기록한 활동전위 수가 증가하였고(48.4±15.0개/초) 반대로 외측방향으로 움직일 때는 감소하였다(10.5±8.7개/초, p< 0.01, Fig. 8). 기계적 자극에 대해 신경활동의 최대치 사이의(peak to peak) 위상은 180°위상차로(180° out of phase) 저주파역에서 앞서다가 고주파역으로 갈수록 작아지고, 10.0 Hz에서는 반대로 자극이 신경활동을 앞서는 결과를 보였으며(Fig. 9), Jones 등이 단순화한 반고리관에서 얻어낸 회전자극 주파수변화에 따른 팽대부릉정의 동적변화곡선(dynamic response curve)과13) 유사한 결과를 볼 수 있었다(Fig. 10).

고     찰

전 외반고리관의 팽대부릉에서 신경말단의 형태 및 분포 
   축삭내 표지법(intra-axonal labelling)을 이용한 척추동물 전정 말단의 형태학적 연구 결과에 의하면 무양막동물(anamniote)인 어류, 양서류의 전정 팽대부릉에서는 제 2형 전정유모세포(type II hair cell) 만이 관찰되고, 유양막 동물(amnioite)인 파충류와 조류 이상에서 제 1 형 전정유모세포(type I hair cell)를 관찰할 수 있는데, 이들에서는 주로 팽대부릉의 중심부(central zone)에 분포하는 것과 달리 포유류에서의 제 1 형 전정유모세포는 팽대부릉의 전역에 걸쳐 분포하고 팽대부릉의 기울기가 포유류 이외의 척추동물에 비해 보다 완만한 모양을 보인다고 한다.¹⁴⁾ 제 1 형 전정유모세포는 팽대부릉 내에서 일차 구심성 전정신경과 잔형 또는 이중형의 신경말단으로 신경연접을 이루고 있는데 본 연구의 마우스 내이 실험표본에서도 잔형과 이중형 신경말단은 전 외반고리관 팽대부릉의 전역에 걸쳐 발견할 수 있었다. 잔형 말단의 축삭은 주로 팽대부릉의 중심부에서 제 1 형 전정유모세포에 분포하며, 단추형 말단의 축삭은 팽대부릉 가장자리에서 제 2 형 전정유모세포에 주로 분포하는데 본 연구에서는 전, 외반고리관 모두에서 순수한 단추형 말단을 염색할 수 없었다. Baird 등(1988)도 in vivo 친칠라 실험 결과에서 총 50개의 염색된 말단 중 단추형은 1개만을 염색할 수 있었다고 하는데⁸⁾ 이는 단추형 말단의 축삭의 굵기가 잔형(3.28±0.27 μm)이나 이중형(2.55±0.13 μm)보다 가늘어 기록전극을 축삭내에 정확히 삽입한 후 신경표지 물질을 주입하기 어렵기 때문이라 생각된다. 염색된 신경말단의 형태는 친칠라에서의 결과나⁸⁾ 원숭이에서의 결과와¹²⁾ 마찬가지로 마우스에서도 이중형 말단이 가장 많이 나타났다.

전정신경 활동과 팽대부릉에서 신경 말단의 분포
   기록전극을 신경다발 속에서 전진시켜 그 끝이 축삭내에 위치하는지 여부는 전극의 저항값에 큰 변화 없이 안정기막전위가 급격히 떨어지면서 자발전위가 나타나는 것을 확인하거나 잠복활동축삭(silent activity axon)인 경우, 약한 직류 전류 자극(+0.2 nA)을 축삭내로 흘려 보낼 때 활동전위가 나타남으로 확인할 수 있는데, 본 연구에서는 잠복활동축삭을 제외하고 자발활동을 보이는 312개의 축삭만을 분석하였다. 자발활동 극파의 수는 규칙적인 활동의 축삭이 불규칙적인 활동의 축삭보다 많았으며이는 친칠라의 경우와⁸⁾ 유사한 결과이며, 가장 높은 빈도를 보이는 이중형 말단의 축삭중, 마우스에서는 규칙적 활동을 갖는 것(8개)보다 불규칙적 활동성을 갖는 것(21개)이 더 많았는데 친칠라에서는 규칙적 활동을 갖는 것(20개)이 불규칙적 활동성을 갖는 것(6개)보다 더 많았다. 신경 활동성과 팽대부릉에서 신경말단 위치와의 관계를 보면 어류인 toadfish와³⁾ 양서류인 bullfrog에서는⁴⁾ 축삭말단이 팽대부릉의 긴축을 따라 중앙에서 멀어지는 가장자리(planum semicircularis)로 갈수록 규칙적인 활동성을 보이고 파충류인 turtle과⁵⁾ lizard,¹⁵⁾ 포유류인 친칠라에서는⁸⁾ 팽대부릉의 가장 높은 중심부에서 팽대부의 바닥과 가장자리로 갈수록 규칙적 활동성을 보이는 축삭 말단이 분포하는데 마우스 경우에서도 후자와 같은 분포 특성을 보였다. Ringer 용액의 온도를 실험실 온도인 22℃와 마우스 체온에 가깝게 로그스케일로 증가 시킨 27℃와 34℃의 세 조건으로 변화시켜 보았는데, 정상적인 생리 환경에 가깝게 온도를 올려줌에 따라서, 자발활동 개수가 좀더 증가하고 안정기 막 전위가 좀더 낮을 것으로 예상하였으나 세 온도 조건에 따른 자발 활동 개수나 막전위의 차이는 보이지 않았다. 이는 in vitro 마우스 내이 실험표본을 만드는 과정에서 온도에 민감한 단백질 또는 효소들의 비가역적인 손상 등의 원인으로 생각할 수 있다. 

전정유모세포에서 전정신경말단으로의 신호전달 확인 
   포유류의 세반고리관 전정유모세포의 운동섬모(kinocilium)는 극성(polarity)을 띄고 있어 수직반고리관은 고리관 방향으로 수평반고리관은 난형낭(utricle) 방향으로 내림프가 움직일 때 전정유모세포내의 탈분극이 일어나고, 신경연접틈새(synaptic cleft)로 신경전달물질을 유리시켜 일차 구심성 전정신경의 근위부에 흥분성연접후전위(excitatory postsynaptic potential)를 증가시켜 활동전위가 증가되게 한다. 압전변환기를 이용한 미세밀기장치를 반고리관 막부 내로 밀 때 외팽대부신경에서는 활동전위가 증가하고 전팽대신경에서는 감소하는 것으로 보아 본 in vitro 마우스 실험표본에서, 전정유모세포와 일차 구심성 전정신경사이의 신경연접에서 일련의 신호전달과정이 잘 유지되고 있음을 알 수 있었다. 기계적 자극에 따라 막전위(membrane potential)의 조정(modulation) 즉, 활동전위가 증가할 때 막전위가 함께 증가되는 것을 관찰할 수 있었는데 해당 축삭에서 기록전극을 빼낸 후에는 조정 현상이 사라졌다. 축삭의 여러 이온통로들은 리간드(ligand gated), 전압(voltage gated) 또는 축삭이 당겨지는 기계적인 힘(stretching force)에 의해 막전위를 변화시키는데 기록전극을 세포 외에 위치하고 자극을 주었을 때 조정 현상이 사라지는 것으로 보아 기계적 자극의 원인은 가능성이 적고, 신경연접과 가까운 부위에 기록전극을 위치시킴으로(200~500 μm) 흥분성연접후전위가 반영되었음을 추측할 수 있지만 tetrodotoxin이나 dendrodotoxin 또는, cyanonitroquinoxalinedione 등의 신경조정제(neuromodulator)를 이용하여 이온 통로들을 차단한 후 조정현상의 변화를 확인하여 기계적 자극에 대한 원인을 배제해야 할 것으로 생각된다. 미세밀기장치의 자극 주파수를 증가시킴에 따라(0.01~10.0 Hz) 자극과 활동전위의 최대치 사이 위상차는 점차 줄어들었는데 이는 자연적인 회전자극이 아닌 인위적인 전정막부의 밀기자극에도 불구하고 Jones 등의 회전자극 주파수변화에 따른 팽대부릉정의 동적변화곡선(dynamic response curve)과¹³⁾ 유사한 결과를 볼 수 있었다. 친칠라에서 정현파 회전자극에 대해 잔형 말단의 축삭은 이득이 낮고(low gain), 단추형 말단 축삭들은 이득이 높다고 하였는데,⁸⁾ 본 in vitro 마우스 모델에서는 노출된 반고리관의 막부가 미세밀기장치로 반복 자극을 가했을 때 고리관 막부가 내측으로 찌그러지는 현상으로 주파수와 말단형태에 따른 이득을 분석할 수 없었다. 
   본 연구의 결과는 마우스에서 얻은 포괄적인 형태, 전기생리학적 자료로서, 다른 포유류 in vivo 모델과 비교할 때 안정기 막전위가 높고, 자발 활동 극파의 수가 적으며, 인위적인 밀기 장치에 의해 전정 막부가 찌그러지는 약점이 있었으나 팽대부릉 내에 신경말단의 위치와 형태 및 그와 관련된 팽대부신경의 활동성이 다른 포유류 in vivo 모델과 동일하였고 전정유모세포와 일차 구심성 전정신경사이의 신호전달과정이 잘 유지됨을 확인할 수 있어 향후 in vivo 마우스 내이 실험표본 개발에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

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