교신저자：전상준, 330-714 충남 천안시 안서동 산 29번지  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   항암제인 cisplatin은 두경부 악성종양 및 비뇨생식기계의 종양 치료에 우수한 효과를 나타내어 단독 또는 병용 요법으로 널리 이용되고 있다. 그러나 cisplatin은 이독성, 신독성, 골수 억제등의 심한 부작용을 가지고 있어 투여에 한계점을 지닌다. 따라서 이러한 부작용과 그의 예방법에 대한 여러 연구가 있어 왔다. Mannitol과 saline의 투여와 다량의 수액 섭취는 cisplatin의 신독성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 이독성의 기전과 그 예방법에 대해서는 정확히 알려져 있지 않으며 많은 연구를 통해 여러 가설이 제시되고 있다. 이에는 혈관조의 손상,¹⁾ 외유모세포의 칼슘 통로 차단 등²⁾이 있으며, 최근에는 유리기(free radical)의 중요성³⁾이 거론되고 있다. 특히, nitric oxide(NO)는 L-arginine이 L-cirtruline으로 변화하는 과정에서 nitric oxide synthase(NOS)에 의하여 생성되는 반감기가 짧고, 용해성이 큰 유리기로서 다양한 생물학적 활성을 갖고 있는 물질이다.
   NOS는 발현 세포와 발현 양상에 따라 사람 세포에서 3가지 다른 isoform이 밝혀져 있는데, type I인 nNOS(neuronal NOS)와 type II인 iNOS(inducible NOS), 그리고 type III인 eNOS(endothelial NOS)가 그것이다. 이 중에서 nNOS와 eNOS는 cNOS(constitutive NOS)에 속하며 이미 세포 내에 존재하여 생리적 조건에서 소량의 NO를 방출하여 체내 homeostasis를 유지한다. 이들은 체내에서 Ca^2＋과 calmodulin의 존재 하에서 활성을 보이며 acetylcholine, bradykinin, adenosine diphosphate, histamine, glutamine 유입에 의해 자극된다.
   심혈관계에서 NO는 EDRF(endothelium-derived relaxing factor)로 작용하여, 혈관의 평활근에 작용하여 혈류와 혈압을 조절하며, nNOS는 주로 중추신경계에서 발견되며 신경 전달 물질로서 작용한다.
   반면에 iNOS는 대식세포에서 처음으로 동정되었으며, Ca^2＋ 유입과 관계없이 병리적 조건에서 cytokines이나 lipopolysaccharide등의 자극에 의해 활성화되어 세포 내에서 새로이 합성되어 증가된다.⁴⁾⁵⁾ 활성화된 iNOS는 cNOS에 비해 100배에서 1000배 많은 양의 NO를 생성한다. 이러한 NO는 혈관을 확장시키고 peroxynitrite, hydroxyl radical을 생성하여 superoxide anion과의 반응을 통하여 세포 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 최근에는 대식세포뿐만 아니라 간세포, 암종세포, 성상세포, 염증성 호중구와 호흡 상피세포등에서도 iNOS가 동정되었다.⁴⁾
   생체 내에서 cisplatin의 투여에 의해 iNOS가 생성되며, NO가 유모세포 손상을 유발한다는 보고가 있었으며⁶⁾⁷⁾ 와우에서 병적 조건(e.g. 염증, 소음 폭로, 또는 메니에르병등)일 때 iNOS 활성이 발견된다는 보고가 있다.⁸⁾ 또한 신장과 위장관에서 NOS inhibitor에 의해 cisplatin의 독성이 감소된다는 보고가 있다.⁹⁾ 이러한 사실은 NO가 cisplatin 이독성의 병리 기전에 관여한다는 추론을 가능하게 한다.
   그러나 최근에는 NO 자체에는 이독성이 없다는 논문이 발표되는 등¹⁰⁾ cisplatin 이독성에서 NO의 역할에 대한 논란이 있어 왔다. 이에 본 연구는 실험적으로 guinea pig에 cisplatin 이독성을 유발하고 NOS 억제제인 L-NAME(NG-Nitroarginine Methyl Ester)와 NMDA(N-methyl-D-Aspartate) receptor antagonist인 MK-801(Dizocilpine Maleate)을 각각 또는 병용하여 cisplatin과 동시에 투여했을 때 guinea pig의 청성뇌간유발반응 검사와 주사전자현미경 소견을 관찰함으로써 cisplatin 이독성에서 NO의 역할을 연구하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험 동물은 체중 400~500 g의 외견상 건강하고, 수술 현미경 소견상 중이 및 외이도에 염증 소견이 없으며, 청성뇌간유발반응검사상 정상 소견을 보이는 guinea pig 25마리(50귀)를 사용하였다. 이들을 무작위로 추출하여 Group 1, 2, 3, 4, 5로 분류하였고 그 내용은 다음과 같다.
   Group 1：생리식염수를 5일간 복강 내 주입한 군 5마리(10귀)
   Group 2：cisplatin을 5일간 복강 내 주입한 군 5마리(10귀)
   Group 3：L-NAME를 3일간 주입한 후 cisplatin과 병용하여 5일간 복강 내 주입한 군 5마리(10귀)
   Group 4：MK-801을 3일간 주입한 후 cisplatin과 병용하여 5일간 복강 내 주입한 군 5마리(10귀)
   Group 5：L-NAME과 MK-801을 병용하여 3일간 주입한 후 cisplatin과 병용하여 5일간 복강 내 주입한 군 5마리(10귀)

방  법

마  취
   수술시 마취제로 ketamine(30 mg/kg)과 xylazine(2 mg/kg)을 근육 주사하여 guinea pigs의 자가호흡을 유지한 상태로 움직이지 못하도록 고정하였고, 필요에 따라 유지량으로 최초 용량의 반을 추가 근육 주사하였다. 또한 guinea pigs의 체온 유지를 위해서 실험실 내 기온을 25~27°C로 유지하였고, 마취하의 실험이 30분 이상 지속될 경우 guinea pigs의 직장을 통한 체온 측정을 실시하고 필요에 따라 전기담요(heating pad)를 사용하여 체온을 유지하였다.

복강내 생리식염수, cisplatin, L-NAME, MK-801의 투여
   Guinea pig을 앙와위 자세로 유지시킨 뒤 22 gauge 10 ml 주사기를 이용하여 Group 1에서는 생리식염수 2.5 ml를 복강 내에 5일간 매일 주입하였고, Group 2에서는 cisplatin(2 mg/kg/day, 1 mg/2 ml, 한국유나이티드제약)을 5일간 매일 복강 내에 주입하였으며, Group 3에서는 L-NAME(Sigma, Stenheim, Germany)를 PBS(phosphate buffered saline)에 녹여 5 mg/ml의 농도로 맞춘 후, 실험 전까지 -20°C에 보관하였다가 3일간 guinea pig 복강 내 주입(10 mg/kg/day)한 후 4일째부터는 L-NAME 복강 내 주입 후 2시간 후에 cisplatin(2 mg/kg/day)을 5일간 매일 복강 내 주입하였다. Group 4에서는 MK-801(RBI Co, USA)를 PBS에 녹여 0.25 mg/ml의 농도로 맞춘 후, 3일간 guinea pig 복강 내 주입(1 mg/kg/day)한 후 4일째부터는 MK-801 복강 내 주입 후 2시간 후에 cisplatin(2 mg/kg/day) 을 5일간 매일 복강 내 주입하였다. Group 5에서는 L-NAME(10 mg/kg/day)와 MK-801(1 mg/kg/day)을 병용하여 3일간 guinea pig 복강 내 주입한 후 4일째부터는 L-NAME와 MK-801 복강 내 주입 후 2시간 후에 cisplatin(2 mg/kg/day) 을 5일간 매일 복강 내 주입하였다.

청성뇌간유발반응검사
   각 군은 청성뇌간유발반응검사를 통해 실험 전 기저 청력 역치와 cisplatin의 복강내 주입 5일째 청력 역치를 측정하였다.
   청성뇌간유발반응검사(Viking IV；Nicolet, USA)의 전위는 피하세침전극을 두정부와 유양동 부위에 삽입하여 측정하였으며, 자극음은 100 μsec펄스의 교대 극성에 의해 생성된 광역밴드의 클릭음을 3.1 Hz의 비율로 Ear Tone 3A insert earphone을 통해 귀에 삽입하여 주었고, 청성뇌간유발반응은 증폭 및 150~3000 Hz의 Band Pass Filter로 여과되었다. 클릭 강도는 90 dB SPL에서 시작하여 청성뇌간유발반응이 나타나지 않을 때까지 5 dB씩 감소시켰으며, 청력역치는 측정 가능한 파형의 wave V를 보이는 최저자극역치로 결정하였다.

주사전자현미경
   Guinea pig을 cisplatin의 복강내 주입 5일째 청성뇌간유발반응검사를 시행하고, 각 군에서 주사전자현미경 검사를 위해 3마리씩 2% paraformaldehyde와 2.5% glutaraldehyde의 혼합액을 사용하여 심장내 관류를 시행한 후 실험 동물을 단두하여 양측 측두골을 얻은 뒤 와우를 채취하였다. 생체외 관류는 고실계에 낸 구멍을 통하여 난원창으로 시행하였으며, 관류는 정원창을 제거한 와우를 4°C 냉장고에 하루 동안 액침시켰다. 이 후 glutaraldehyde로 하루 동안 고정시킨 후, 와우를 0.1M phosphate 완충액으로 고실계에 낸 구멍을 통하여 씻어내는 과정을 3회 반복한 후 1.5% OsO4로 후고정하였다. 이어서 수술현미경하에서 와우의 골피막을 제거하고, 채취된 조직을 50%, 70%, 85%, 95%, 100% 에탄올로 점차 농도를 높여가며 탈수하고 임계점 건조기(Critical point dryer, Hitachi HCP-2, Tokyo, Japan)로 건조시킨 후, 13 mm platinum으로 도포된 stub 위에 위치시킨 후, 주사전자현미경(Hitachi S-2500, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하고 polaroid type 55 landfilm으로 촬영하였다. 주사전자현미경을 통한 유모세포 손상의 평가는 corti 기관의 0.5 Hz, 1 kHz, 2 kHz 부위를 얻어 유모세포의 1열부터 4열사이의 입체섬모(stereo-cilia)의 정렬, 융합, 벌어진 정도(splaying), 섬모의 손실 및 분열 여부를 관찰하였다.

분석 및 통계 처리
   각 군에서 청성뇌간유발반응검사상 기저 청력역치와 5일째 청력역치의 변화값을 평균±표준편차로 표시하였고, Group 1, 2, 3, 4, 5 사이의 청력 역치의 변화를 비교하기 위하여 one way ANOVA법을 이용하여 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.

결     과

청성뇌간유발반응검사
   청성뇌간유발반응검사상 대조군으로 설정한 Group 1의 기저 청력역치와 5일째의 청력역치의 변화치는 2.0±2.6 dB SPL 이었다. 이 변화치는 paired t-test 상 유의한 청력역치의 증가를 보이지 않았다(p>0.05).
   Cisplatin만을 투여한 Group 2에서는 기저 청력역치와 5일째의 청력역치의 변화치가 18.0±4.2 dB SPL 이었으며 대조군으로 설정하였던 Group 1과 비교하여 유의하게 청력역치의 증가를 보였다(p<0.05).
   Cisplatin과 L-NAME를 병용하여 투여한 Group 3에서는 기저 청력역치와 5일째의 청력역치의 변화치가 5.0±4.6 dB SPL이었다. 이는 Group 1과 비교하여 cisplatin에 의한 유의한 청력감소가 나타나지 않았다(p>0.05).
   Cisplatin과 MK-801을 병용하여 투여한 Group 4에서는 기저 청력역치와 5일째의 청력역치의 변화치가 4.0±3.2 dB SPL이었다. 이는 Group 1과 비교하여 cisplatin에 의한 유의한 청력감소가 나타나지 않았다(p>0.05).
   Cisplatin과 MK-801 및 L-NAME를 병용하여 투여한 Group 5에서는 기저 청력역치와 5일째의 청력역치의 변화치가 4.6±5.0 dB SPL이었다. 이는 Group 1과 비교하여 cisplatin에 의한 유의한 청력 감소가 나타나지 않았다(p>0.05)(Table 1, Fig. 1).

주사전자현미경 소견
   대조군으로 설정하였던 Group 1에서는 정상적인 와우의 유모세포들이 변형 없이 규칙적으로 배열되어 있었다.
   Cisplatin을 복강 내 투여한 Group 2에서는 유모세포 입체섬모의 융합, 휘어짐, 손실이 많이 나타나 대조군과 비교하여 유모세포의 손상이 심하게 나타났다(Fig. 2).
   L-NAME나 MK-801을 병용하여 투여한 Group 3, 4, 5에서는 내유모세포와 외유모세포의 형태가 잘 유지되어 있었다(Fig. 3).

고     찰

   Cisplatin은 aminoglycoside와 더불어 이독성을 가진 약제로서 잘 알려져 있다. Cisplatin에 의해 야기되는 이독성은 주로 와우의 기저부에 손상을 초래하여 고음역에서 양측성이고 비가역적인 감각신경성 난청을 유발한다.⁶⁾⁷⁾
   저자의 본 연구에서는 cisplatin 이독성을 만들기 위해 일반적으로 사용되는 복강 내 주입 방법을 이용하였으며 cisplatin의 농도, L-NAME의 농도, MK-801의 농도는 기존 문헌^11)12)13)을 참고하여 정하였고, L-NAME와 MK-801의 복강 내 단독 투여에 의한 청력 변화도 예비 실험을 통해 대조군과 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 또한 cisplatin에 의한 ototoxicity는 문헌에 의하면, 수일에서 실험동물에 따라 10~20일 후로 보고되고 있다.⁷⁾¹¹⁾ 본 연구에서 설정하였던 이독성 발현 여부의 시간은 예비실험을 통해 주어진 조건에서 청력 역치의 변화를 보인 시기를 설정하여 cisplatin 투여 후 5일째를 이독성이 발현되는 시기로 설정하였다.
   지금까지의 몇몇 보고에서 cisplatin 이독성의 기전으로 NO의 역할에 대해 언급되어지고 있다. Srivastava등¹⁴⁾은 cisplatin은 arginine 대사 과정에서 NO의 합성을 유발하며, NO 합성의 억제가 중요한 부작용의 하나인 신독성을 줄일 수 있음을 보고하였다. 그리고 Wink등¹⁵⁾은 NO는 cisplatin의 세포독성을 증가시킨다고 하였으며, Ruan등¹⁶⁾은 NO의 공여자인 sodium nitroprusside(SNP)을 이용해 NO가 이독성이 있음을 보고하였고 동시에 L-NAME를 이용하여 NO 합성을 감소시킴으로써 SNP에 의한 유모세포의 소실이 유의하게 감소됨을 관찰하였다. 그러나 Ruan등¹⁰⁾은 후에 의견을 바꾸어 NO에 의한 cisplatin 이독성을 연구하기 위해 흔히 NO의 공여자로서 사용되고 있는 SNP에 의해서 나타나는 청력 손실이 NO에 의한 이독성이라기 보다는 SNP에서 유래한 cyanide에 의한다는 것임을 발표하였고, NO 자체에는 유모세포에 독성이 없다고 하였다. 이렇듯 cisplatin 이독성에서의 NO의 역할에 대해서는 명확한 이해가 부족하였다. 따라서 저자의 본 연구의 필요성이 제기되었다.
   본 연구에서는 NOS의 억제제로 알려진 L-NAME를 전처치하여 투여함으로써 cisplatin에 의한 청력 감소를 유의하게 예방할 수 있었다. NO는 L-arginine으로부터 생성되는데, L-NAME는 L-arginine analog이며 NOS에 대해서 competitive inhibitor로 작용하여 cNOS와 iNOS 활성을 비특이적으로 저해한다.
   또한 본 연구에서는 NMDA(N-methyl-D-Aspartate) receptor antagonist인 MK-801(Dizocilpine Maleate)을 전처치하여 투여함으로써 cisplatin에 의한 청력 감소를 유의하게 감소시킬 수 있었다. Duan등¹⁷⁾은 noise와 aminoglycoside는 glutamate receptor를 과자극하여 spiral ganglion의 auditory afferent neuron에 있는 NMDA receptor를 과자극하여 Ca^2＋ 유입을 증가시킴으로써 calmodulin을 통해 NOS를 활성화시켜 NO 합성과 NO 방출을 증가시키고 이것이 와우의 유모세포 손상을 일으킨다고 하였고 실험 동물에서 noise과 aminoglycoside 투여 이전에 MK-801을 전처치한 경우에서는 형태학적, 생리학적으로 유모세포의 손상을 예방할 수 있었다고 하였다.
   본 연구의 결과는 MK-801이 noise과 aminoglycoside의 이독성뿐만 아니라 cisplatin의 이독성에 대해서도 예방 효과를 가질 수 있음을 암시한다.
   Cisplatin으로 인한 와우의 형태적인 변화는 동물 실험을 통해 제시되어 왔다. 즉, 형태적인 변화는 외유모세포의 손상이 주된 것으로 초기에는 와우의 기저 부위의 제 3 열 외유모세포의 손상으로부터 시작하여 진행된 손상에서는 다른 열의 유모세포의 손상 및 첨부의 손상도 관찰되며, 전자현미경적 관찰에 의하면 외유모세포 섬모의 왜곡(distorsion) 및 손실, Reissner's 막과 혈관조의 손상도 나타난다.^18)19)20) 또한 Kohn등¹⁾은 cisplatin에 의해 corti기관과 혈관조에 이독성이 같이 나타나며, 유모세포의 손상은 와우의 기저부가 첨부보다 심하고, 외유모세포가 내유모세포보다 심함을 보고하였다. 본 연구에서도 기존에 발표되어 있는 cisplatin 이독성에서의 주사전자현미경으로 관찰한 와우의 소견과 일치된 양상, 즉 와우의 유모세포의 입체섬모의 융합, 휘어짐, 손실이 나타났다. 반면, L-NAME를 투여한 군과, MK-801을 투여한 군, 그리고 L-NAME와 MK-801을 병용하여 투여한 군에서는 이러한 손상 없이 와우의 형태가 잘 유지되어 있었다.

결     론

   Guinea pig의 복강 내에 투여한 cisplatin에 의해 청력 감소가 유발되었으며, L-NAME나 MK-801을 전처치하여 cisplatin을 같이 투여한 군에서는 유의한 청력 감소가 발생하지 않았고, 주사전자현미경 소견에서도 cisplatin의 단독 투여에 의한 와우의 유모세포의 손상이 L-NAME나 MK-801을 전처치하여 cisplatin을 같이 투여한 군에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 cisplatin의 투여가 iNOS의 활성화와 NMDA receptor의 활성화를 통해 NO를 합성키며, 생성된 NO가 이독성을 유발한다는 사실을 시사하는 것으로서 기존의 여러 연구의 결과와 일치되는 것이라 할 수 있다. 결론적으로 cisplatin에 의한 청력 감소는 L-NAME 및 MK-801을 투여함으로써 예방되었고, 이는 cisplatin 이독성에서 NO가 중요한 매개 역할을 함을 시사한다.

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