교신저자：박경유, 301-070 대전광역시 중구 목동 24번지  을지의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   면역 반응들은 신체 전부에서 일어나는 현상이고 이런 반응들은 내이에서도 일어난다고 알려져 있으며, 원인 미상의 감각 신경성 난청의 병태생리를 이런 면역 기전으로 설명하려는 추세이다.¹⁾²⁾ 내이에 존재하는 혈관선조는 면역 매개성 손상이 발생할 수 있는 부위로 알려져있고, Kusakari 등³⁾은 MRL/MP-lpr/lpr(이하 MRL/lpr) 쥐에서 뇌간 청력 반응 역치의 증가를 보고하였고, 내이 중 유일하게 혈관선조에서만 IgG의 침착을 보인다고 하였다. 그리고 자가항체나 면역 복합체의 순환에 의해 생후 20주 전까지 면역 복합체 매개성 사구체 신염을 일으키며 이런 쥐에서 사구체 기저막을 관찰하면 혈관선조에서와 유사한 IgG를 특징적으로 관찰할 수 있다고 하였다. 이들 면역복합체는 순환 면역복합체(circulating immune complex)나 동소 발생 부위에서 형성된 면역복합체(immune complex formed in situ)로 생각되어지며 최근에 histone은 MRL/lpr 쥐에서의 사구체 기저막의 면역 침착에 관여한다고 하였고, 동맥내 histone을 주사한 후 정맥내 항 histone 혈청을 주사한 정상 동물에서 면역 매개성 사구체 신염을 유발시키는 것으로 보고되었다.⁴⁾ Histone은 세포핵 염색체내 DNA 부착과 농축에 관여하는 고 양이온을 지닌 단백질이기 때문에 동맥내로 주입된 histone이 음이온을 지닌 사구체 기저막 부위에 부착되므로 면역 매개에 의한 사구체 신염의 동물 모델로써 예상할 수 있으며, 이것은 사구체 기저막이 histone에 대한 항체의 이식된 표적항원(planted target antigen)으로써 작용하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구의 목적은 혈관선조에서도 위와 같은 현상을 관찰하므로써 혈관선조에서 일어나는 면역침착의 기전을 이해하고자 하였다.

재료 및 방법

   이 실험에는 Preyer reflex 양성인 250~300 g 짜리 숫컷 백색 기니아 픽 14마리가 사용되었다.

기저막의 음이온 부위 관찰
   먼저 두 마리 기니아 픽에서 혈관선조 미세혈관 기저막의 음이온 부위를 증명하기위해 기니아 픽을 깊은 마취하에 0.1 M phosphate buffer에 2% paraformaldehyde와 0.25% glutaraldehyde(pH 7.4) 및 3% polyvinylpyrrolidone이 함유된 용액으로 심장 관류시켜 고정하였고, 즉시 혈관선조 및 신장을 적출한 후 2시간동안 동일 고정액에 후고정 시킨 후 LR white에 봉매하였다. 극초박피로 절개 후 poly-L-lysin-gold complex에 배양하고 투과 전자 현미경(JEOL, 100S)으로 관찰하였다. 다음으로 RIVI adjuvant에 key hole limpet hemocyanin(KLH)-histone complex를 두 마리 기니아 픽에 면역시켜 항 histone 혈청을 얻었다.

면역반응
   각기 두 마리씩 4개의 대조군과 1개의 실험군으로 나누었다.

대조군
   대조군은 4개군으로 생리식염수, 0.5 ml 생리식염수에 녹인 histone(2 mg/100 g b.w), 4배 생리식염수로 희석된 항 histone 혈청 1 ml를 동맥내 주입 한 군과, 고 양이온을 띄며 histone과 유사한 성질을 가진 lysozyme을 동맥내 주입한 후 10분 뒤 항 lysozyme 혈청을 정맥내 주사한 군으로 나누어서 정원창을 통해 기저부 회전에서 내와우 전위를 측정하였다.

실험군
   실험군에서는 0.5 ml 생리 식염수에 녹인 histone(2 mg/100 g b.w)을 동맥내 주입한 후 10분 뒤 4배 생리 식염수로 희석된 항 histone 혈청 1 ml를 정맥내 주사하여 정원창을 통해 기저부 회전에서 내와우 전위를 측정하였다.
   대조군과 실험군 모두에서 마취하에 periodate lysine paraformaldehyde를 심장 관류시켜 고정시키고 모든 와우를 냉동 절편 시킨 뒤 IgG, C₃, histone 분포를 면역 전자 현미경적으로 관찰하였다.

결     과

기저막의 음이온 부위 관찰
   사구체 혈관의 기저막(Fig. 1) 및 혈관선조의 미세혈관의 기저막에 cationic gold가 부착됨을 관찰하였다(Fig. 2).

내와우 전위

대조군
   대조군은 4군(8마리) 모두에서 내와우 전위의 변화가 없었고, 대조군 중 lysozyme 주입 후 항 lysozyme 혈청 정맥 주사 받은 동물에서 내와우 전위의 감소가 관찰되지 않음을 보여주고 있다(Fig. 3).

실험군
   2마리 모두에서 histone의 동맥내 주사를 받은 후 항 histone 혈청 정맥 주사를 받은 직후 내와우 전위의 뚜렷한 감소가 관찰되었다(Fig. 4).

형태학적 관찰

대조군
   대조군은 4군(8마리) 모두에서 IgG 침착이 관찰되지 않았고 세포간 사이 공간의 증가도 보이지 않았다. 대조군 중 lysozyme 투여 후 항 lysozyme 혈청을 정맥내 주사 받은 와우에 IgG 침착이 관찰되지 않음을 보여주고 있다(Fig. 5).

실험군
   2마리 모두에서 혈관선조의 미세혈관 기저막에 IgG 침착이 linear and hump모양으로 보였으며(Fig. 6) 혈관선조의 변연 세포와 중간 세포 사이의 세포간 사이 공간이 증가되어 있었다(Fig. 7).

고     찰

   최근들어 원인 미상의 감각 신경성 난청을 면역 기전으로 설명 하려는 경향을 보이고 있다. McCabe 등¹⁾은 청력 장애의 병인으로 면역 기전의 가능성을 다음과 같이 보고하였는데, 첫번째로 내이 항원에 대한 림프구 억제 실험에서 양성 반응을 보였고, 생검상 순수한 혈관염 소견을 보였으며, 마지막으로 스테로이드와 면역 억제제로 청력이 향상됨을 확인하였다. 또 Harris 등²⁾은 실험을 통하여 내이에서 항원에 대한 면역 반응이 가능하리라는 것과 외림프액 자체에서 항체를 생성한다는 것을 증명하였다. Histone은 강력한 자발적 응집력을 가진 고 양이온의 단백질로써 in vivo 상태에서 사구체 기저막에 강력한 친화도가 있음을 실험을 통해 알 수 있었으며 이로 인해 사구체신염을 일으키는 것을 알 수 있었다.⁵⁾ 또한 본 실험을 통하여 사구체혈관의 기저막 및 혈관선조 미세혈관의 기저막에 cationic gold가 부착됨을 관찰함으로써 혈관선조의 기저막이 음전하를 띄고 있음을 나타내었다. 이러한 사구체 기저막 손상를 일으키는 기전에는 Heyman nephritis와 같이 fixed intrinsic tissue antigen에 의한 것과 이식된 항원(planted antigen)에 의한 In situ immnue complex deposition에 의해 일어 날수 있으며 이러한 여러 면역 반응 중 이식된 항원에 대한 연구에 의하면 histone들이 혈관선조 미세혈관의 기저막에 부착될 수 있음을 알 수 있다. Kusakari 등³⁾은 자가면역종 MRL/lpr쥐의 혈관선조에 IgG가 침착되는 것으로 보고 하였는데, 이는 histone 주사 후 항 histone 혈청을 주사한 정상 동물군에서도 얻을 수 있었고, MRL/lpr 쥐와 histone과 항 histone 혈청이 주사된 동물군의 혈관선조에서 여러 개의 형태학적인 유사점들이 관찰되었다. 또한 혈관선조의 미세혈관 기저막에 C 3 침착없이 IgG 침착이 관찰되었고 변연 세포, 중간 세포 및 미세혈관사이의 확장된 세포간공간도 분명히 관찰되었다. 이러한 실험모델에서의 청력장애는 파괴적인 변화에 의해서가 아니라 항원-항체 복합체의 축적에 의한 혈관선조 기능장애에 의해 유발되는 것으로 생각된다.
   어떻게 항원-항체 복합체가 혈관선조 기능에 영향을 주는지 분명치 않으나 histone 대신 lysozyme을 항원으로 이용한 대조군실험에서는 IgG 축적, 내와우 전위의 변화, 또는 혈관선조의 병리학적인 변화가 일어나지 않았다. 이는 lysozyme은 histone처럼 고 양이온이지만 자발적인 응집성질이 부족하기 때문인 것으로 해석된다. 이런 사실들을 고려한다면, 이 실험에서의 혈관선조 기능장애는 투여된 항원과 항체에 의해서 유발된 전신적인 과민성에 의해서가 아니라 국소적으로 생성된 항원-항체 복합체에 의해서였고 혈관선조의 항원-항체복합체를 형성하기위해 투여된 항원은 안정된 복합체를 형성 할 수 있게 자발적인 응집을 위해서 고 양이온을 띄어야 할 것이다. 이런 항원들로 가능한 물질은 렉틴, 약물, 감염인자, DNA, 그리고 내인성 면역글로불린 등이 있다. 본 연구를 통하여 양이온의 항원이 음전위를 띈 혈관선조 미세혈관의 기저막에 유착된 것을 확인 할 수 있었고, 이는 기저막이 순환성 항체에 대해 표적항원으로 작용할 수 있으며 이로 인해 in situ 면역 복합체를 생성하여 결국 청력소실을 유발할 수 있음을 암시하게 된다(Fig. 8). 이 이식된 항원설(planted antigen theory)은 항원-항체 매개성 신우 신염의 병인론중의 하나로 알려져 있고 와우와 신장사이에는 면역학적 유사점이 관찰된 바⁶⁾⁷⁾ 이 이식된 항원설로써 면역 매개성 내이 손상의 병인론을 설명할 수 있을것으로 사료된다.

결     론

   저자들은 본 연구에서 혈관선조 미세혈관 기저막의 음이온 부위를 증명하였고 histone과 항 histone 혈청을 주입한군과 여러 대조군의 실험을 통하여 국소적으로 생성된 항원-항체 복합체에 의해서 혈관선조에서도 사구체신염과 유사한 병리학적인 변화가 일어 난다는 것을 관찰하였고, histone과 항 histone 혈청을 투여한 군에서만 내와우 전위가 감소하므로 histone이 자발적인 응집성질을 가진 고 양이온임을 증명하였다. 또한 이와같은 항원-항체 복합체에 의한 혈관선조의 기능장애가 결국 청력손실을 유발할 수 있음을 암시하므로써 향후 면역 매개성 내이손상의 기전을 밝히는데 도움이 되리라 사료된다.

1. McCabe BF. Autoimmune sensorineural hearing loss. Ann Otol Rhinol Laryngol 1979;88:585-9.

2. Harris JF. Immunopathology of the inner ear. In: Bernstein J, Ogra P editors. Immunology of the Ear. New York: Raven press;1987. p.437-52.

3. Kusakari C, Hozawa K, Koike S, Kyogoku K, Takasaka T. MRL/MP-lpr/lpr mouse as a model of immune - induced sensorineural hearing loss. Ann Otol Rhinol Laryngol 1992;101(Suppl 157):82-6.

4. Schmiedeke T, Stoecki F, Muller S, Sugisaki Y, Batsford S, Woitas R, et al. Glomerular immune deposits in murine lupus models may contain histones. Clin Exp Immunol 1992;90:453-8.

5. Schmiedeke T, Stoeckl FW, Webber R, Sugisaki Y, Batsford SR, Vogt A. Histones have high affinity for the glomerular basement membrane: relevance for immune complex formation in Lupus nephritis. J Exp Med 1989;169:1879-94.

6. Quick CA, Fish A, Brown C. The relationship between cochlea and kidney. Laryngoscope 1973;83:1469-82.

7. Arnold W. Inner ear and renal disease. Ann Otol Rhinol Laryngol 1984;93(Suppl 112):119-24.