서     론

   Glucocorticoid는 알레르기성 비염 및 비용의 효과적인 치료제로서 널리 이용되고 있으며, 비점막의 과민성을 감소시키고 다양한 항염증작용을 나타내지만 정확한 기전 및 작용세포에 대해서는 밝혀지지 않은 것이 많다. Glucocorticoid의 작용은 glucocorticoid receptor(GR)와의 반응으로 시작되며 glucocorticoid가 세포막을 투과해 세포질 내에 있는 GR과 결합하여 GR을 활성화시키고 활성화된 glucocorticoid-GR 결합체가 핵 내로 들어가 염증과 관계된 여러가지 유전자의 발현을 조절한다.¹⁾
   GR은 α와 β isoform이 있으며 α isoform은 glucocorti-coid와 결합하지만 β isoform은 GR 유전자에서 일차 전사된 RNA의 교대성 접합절단(alternate splicing)에 의해 형성된 것으로서 glucocorticoid와 결합하지 않는 것으로 알려져 있다.²⁾ 이러한 GR β isoform의 역할에 대해서는 논란이 있지만 α isoform의 작용을 억제함으로써 β isoform의 발현정도가 조직의 glucocorticoid에 대한 반응성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.^2-4)
   GR의 발현정도는 조직과 세포마다 차이가 있고 같은 조직이라도 개체간의 차이가 있는 것으로 알려져 있다.⁵⁾ 조직 내의 GR의 분포 및 양이 glucocorticoid의 작용정도와 관련이 있고,⁶⁾⁷⁾ 일반적으로 호르몬에 대한 조직의 반응정도는 수용체의 발현정도와 관련이 많기⁸⁾ 때문에 비용 및 비점막에서의 GR의 발현정도 및 분포에 관한 연구는 중요하다고 할 수 있다. 또한 조직의 glucocorticoid에 대한 반응성과 관련이 있는 것으로 알려진 GR β isoform의 발현정도 및 분포에 관한 연구도 중요하다고 할 수 있다. 그러나 정상 및 천식환자의 폐와 기관지 점막에서의 GR의 분포에 대한 연구는 있었으나⁹⁾¹⁰⁾ 비점막 및 비용에서의 GR 및 GR β isoform의 분포에 관한 연구와 비용의 조직학적 특징인 호산구의 침윤과 알레르기 동반유무가 GR 및 GR β isoform의 발현에 미치는 영향에 대한 연구는 아직까지 보고된 바가 없다.
   이에 저자들은 GR 및 GR β isoform에 대한 면역조직화학법을 이용하여 비용 및 비점막에서의 GR 및 GR β isoform의 분포를 알아보고, 비용조직에서 호산구의 침윤정도와 알레르기 동반 유무가 GR 및 GR β isoform의 발현에 어떤 영향을 나타내는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상

   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 40명(남자 27명, 여자 13명, 평균연령 37.5세)에 대한 내시경적 부비동 수술시 채취한 비용조직을 대상으로 하였으며, 동일환자의 중비갑개와 하비갑개 점막을 채취하여 비교 대상으로 하였다. 모든 환자는 최소 6주 동안 경구 및 국소 스테로이드를 사용하지 않았고 심한 감염이 있는 경우는 대상에서 제외하였다. 비용조직표본은 비용의 중간부를 이용하였으며, 중비갑개 점막에서 비용이 발생한 경우는 연구대상에서 제외하였고 모든 비갑개점막 조직표본은 전방 1/3 지점에서 획득하였다. 알레르기의 동반여부는 집먼지진드기를 포함한 흡인성 항원 56가지에 대한 피부단자 검사(Bencard, UK)를 시행하여 히스타민 대조 비교법으로 2^＋이상의 반응을 보이면서, 비폐색, 재채기, 수양성 비루, 소양감 등의 4가지 증상 중 2가지 이상을 가진 경우를 알레르기성 비염으로 정의하였다. 연구대상 환자 40명 중 14명에서 알레르기성 비염을 동반하였다.

방  법

   비용조직과 비갑개 점막을 두조각으로 절제하여, 한 조각은 호산구 침윤을 관찰하기 위해 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀에 포매시켜 4~5 μm 두께의 절편을 만들었고, 다른 한 조각은 면역조직화학적 염색을 하기 위하여 4% paraformaldehyde 용액으로 4°C에서 하루간 고정한 후 30% 자당에 하룻밤 담구어 cytoprotection하고 냉동절편기(Shandon, UK)으로 9 μm 두께의 연속 동결절편을 만들어 ProbeOn slide(Fisher Scientific, Los Angeles, CA)에 부착하였다.
   동결절편은 실온에서 1시간동안 건조시킨 후 단계적으로 농도를 낮춘 에탄올을 이용하여 함수화하고 증류수로 세척하였다. 3% H₂O₂-methanol 용액에 30분간 처리한 후 1% Triton X-100에 30분간 처리하였으며 희석된 정상 염소 혈청과 1시간동안 반응시킨 다음 일차 항체로 하룻밤 동안 4°C에서 반응시켰다. 인산완충식염수로 세척한 후 이차 항체인 biotinylated anti-rabbit IgG(Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며 avidin-biotin-peroxidase complex 용액(Vector Labo-ratories)으로 2시간동안 반응시켰다. 발색제로는 3-amino-9-ethylcarbazole(Vector Laboratories)을 사용하였고 상온에서 3분간 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. Mayer's hematoxylin으로 대조염색을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 일차항체로는 GR α isoform과 β isoform에 공통으로 작용하는 다크론성 항­인간 GR 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 GR β isoform에만 작용하는 다크론성 항­인간 GR β 항체(Calbiochem, San Diego, CA)를 각각 1：100, 1：200으로 희석하여 사용하였고 양성 대조염색으로 사람 편도선을, 음성 대조염색으로 일차항체 대신 정상 염소 혈청을 사용하였다.
   파라핀에 포매된 조직은 Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하여 한 조각당 3개의 절편에서, 한 절편당 3개의 시야에서 호산구 수를 세고 그 평균을 산술하여 호산구수를 산출하였다. 호산구수, GR 및 GR β isoform 양성 세포 수는 eye reticule이 설치된 광학 현미경 200배 시야에서 상피하층의 표면부 0.25 mm×4.0 mm(1 mm²)내에 양성으로 염색된 세포수를 세었으며, 염색된 표본은 서로 다른 두 명의 관찰자가 슬라이드 표식을 가린 상태에서 관찰하여 각각의 수를 측정한 후 두 관찰자의 평균값을 통계분석에 이용하였다.
   통계처리는 상관관계 검증에서는 Spearman's rank correlation coefficient를 이용하였고 알레르기성 비염을 동반한 군과 동반하지 않은 군간의 비교는 Mann-Whitney U test를, 동일환자에서 비용, 중비갑개 및 하비갑개 점막간의 비교는 Wilcoxon signed rank test를 사용하였다. 유의성 검증은 p<0.05를 기준으로 하였다.

결     과

GR 및 GR β isoform의 분포

   비용 및 비점막에서의 GR 및 GR β isoform은 상피세포 및 점막하 염증 세포에 주로 발현이 되었고 혈관내피세포와 일부 점막하 분비선 주위세포에도 발현이 관찰되었으며 GR β isoform은 GR과 유사한 발현정도 및 분포를 보였다(Fig. 1). 상피세포는 모든 조직에서 대부분의 세포가 일정하게 발현되었지만 상피하층에서의 발현은 조직마다 큰 차이를 나타냈으며, GR의 발현은 비용 조직에서 10~91개/mm² (median：47), 중비갑개에서는 5~72개/mm²(median：37), 하비갑개에서는 6~69개/mm²(median：41)였다. GR β isoform 발현은 비용조직에서 9~82개/mm²(median：43), 중비갑개에서는 3~63개/mm²(median：35), 하비갑개에서는 7~65개/mm²(median：37)였다. GR 및 GR β isoform의 발현이 비용에서 중비갑개나 하비갑개보다 많은 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다(p>0.05)(Fig. 2).

GR 및 GR β isoform의 발현정도와 알레르기 동반여부 및 호산구의 침윤정도와의 관계

   비용조직에서의 호산구수는 23~410개/mm²(median：137)였으며 호산구수와 GR 및 GR β isoform의 발현은 통계적으로 유의한 상관관계를 나타내지 않았다(p>0.05)(Figs. 3 and 4). 알레르기가 동반된 비용조직에서의 GR 및 GR β isoform의 발현은 각각 15~74개/mm²(median：41)와 19~60개/mm²(median：42)였으며, 알레르기가 동반되지 않은 비용조직에서의 GR 및 GR β isoform의 발현은 각각 10~91개/mm²(median：50)와 9~82개/mm²(median：45)였다. 알레르기 동반 유무와 GR 및 GR β isoform의 발현과는 통계적으로 유의한 상관관계를 나타내지 않았다(p>0.05)(Fig. 5).

고     찰

   GR은 세포질 내에서 2개의 heat shock protein(hsp) 90과 결합되어 있으며 glucocorticoid가 GR과 결합되면 GR이 활성화되고 hsp가 분리되면서 GR의 DNA 결합부위가 노출된다. Glucocorticoid에 의해 활성화된 GR은 핵 내로 들어가 염증과 관계된 유전자의 glucocorticoid response elements(GREs)와 결합하여 유전자의 발현을 조절하고 염증과 관계된 유전자의 전사인자인 AP-1(activator protein-1)과 NFкB(nuclear factor-кB)와 직접 결합하여 이러한 전사인자의 작용을 억제한다.¹⁾
   세포 내 GR의 발현정도는 한 개체 내에서 조직과 세포마다 차이가 있고 같은 조직이라도 개체간의 차이가 있다.⁵⁾ 세포 내의 GR농도가 glucocorticoid에 대한 세포의 민감도와 직접적인 관련이 있고⁶⁾ 알레르기성 비염에서 국소 스테로이드에 대한 개체간의 반응차이는 부분적으로 염증세포의 수뿐만 아니라 GR의 발현의 개체차이에 의한다는 보고가 있지만,⁷⁾ glucocorticoid에 대한 반응성은 염증환경 내에서 여러가지 요소에 의해 결정되며 GR의 농도 및 결합력뿐만 아니라 GR과 glucocorticoid가 결합한 이후에 GR이 GREs나 AP-1 및 NF-кB와 같은 전사인자와의 상호작용에 의해서도 결정된다.⁴⁾¹¹⁾ 실험적으로 cAMP, phorbol esters 및 retinoic acid 등이 GR의 발현을 증가시키며¹²⁾ IL-10과 IFN-γ(interferon-γ)가 단핵세포 내에서 GR의 세포 내 농도를 증가시켜 스테로이드에 대한 반응성을 증가시키고, TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 IL-1α는 GR의 세포 내 농도를 감소시켜 스테로이드에 대한 반응성을 감소시킨다.¹³⁾¹⁴⁾
   GR β isoform은 GR 유전자에서 일차 전사된 RNA의 교대성 접합절단에 의해 형성된 것으로서 α isoform의 호르몬 결합부위(hormon binding domain：HBP)인 카르복실 말단(carboxyl terminal)에서 50개의 아미노산이 15개의 다른 아미노산으로 대치되어 glucocorticoid와 결합하지 못한다.²⁾ 이러한 GR β isoform은 여러 조직에서 광범위하게 분포하고 GR β/α isoform의 비는 0.2~1 정도로 알려져 있다.²⁾ GR β isoform이 생리적으로 유의한 억제작용을 하지 못한다는 보고도 있지만¹⁵⁾ 대부분 β isoform이 α isoform의 기능을 억제한다고 보고하고 있다.^2)-4)16)17) GR β isoform은 α isoform과 이종이합체(heterodimer)를 형성함으로써 α isoform의 작용을 억제하는데 이러한 억제작용은 β isoform의 발현정도와 hsp 90과의 결합강도에 의해 결정된다.¹⁶⁾ 스테로이드에 반응하지 않는 천식환자에서 GR β isoform이 증가되어 있으며, 스테로이드에 반응하지 않는 천식환자에서 증가되어 있는 IL-2와 IL-4에 의해 GR β isoform의 발현이 유도되는 것으로 알려져 있고¹⁷⁾ 외상, 감염 및 열 등이 열성자극(thermal stimulus)를 유발시켜 GR β-hsp 90 결합체를 분리시킴으로써 α isoform과의 이합체 형성을 촉진시킬 수 있다.¹⁶⁾ 본 연구에서 비용과 비점막의 GR β isoform은 GR과 유사한 발현정도 및 분포를 보였고 침윤된 호산구 수나 알레르기 동반유무와 유의한 상관관계를 나타내지 않았다. 이것은 조직에 침윤된 호산구나 알레르기가 β isoform의 발현에 영향을 미치지 못한다는 것을 시사하지만 β isoform의 발현과 역할에 대해 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.
   정상 및 천식환자의 기관지에서 GR의 발현은 주로 상피세포, 염증세포, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등에 발현이 되었고⁹⁾ 본 연구의 비용 및 비점막에서도 GR 및 GR β isoform은 상피세포 및 점막하 염증세포에 주로 발현이 되었으며 혈관내피세포에도 발현이 관찰되었다. 상피하층에서의 발현은 조직마다 큰 차이를 나타냈지만 상피세포는 모든 조직에서 대부분의 세포가 일정하게 발현되었다. 상피세포는 과거에는 외부환경에 대한 물리적 방어기능만 한다고 생각되었으나 최근 사이토카인, 펩타이드 매개물 및 지질매개물 등을 분비함으로써 기도염증을 조절하는 중요한 세포로 인식되고 있다.¹⁸⁾ 상피세포가 국소 스테로이드의 첫 작용세포이고 상피세포 내에 GR의 발현이 강하게 나타나며 glucocorticoid가 상피세포의 염증매개물질 합성을 억제하기 때문에 상피세포가 국소 스테로이드의 중요한 작용부위라고 할 수 있다.¹⁰⁾ 또한 혈관내피세포는 지질매개물을 분비하고 접착분자의 발현을 조절하며 혈장 삼출의 조절에 중요한 기능을 하는데 glucocorticoid가 이러한 기능을 억제하기 때문에 염증세포와 함께 glucocorticoid의 중요한 작용세포라고 할 수 있다.¹⁹⁾
   GR의 발현 정도는 정상, 만성 기관지염 및 천식환자간에 기관지 상피세포뿐만 아니라 전체 점막에서도 유의한 차이가 없었고 호산구성 염증의 정도, 증상정도 및 glucocorticoid에 대한 반응정도와도 관련이 없는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 본 연구에서 비용조직에서의 GR의 발현은 침윤된 호산구 수나 알레르기 동반유무와 통계적으로 유의한 상관관계를 나타내지 않았고 이것은 조직에 침윤된 호산구 수의 증가나 알레르기가 GR의 발현을 증가시키지 못한다는 것을 의미한다. 또한 비용조직의 GR 및 GR β isoform의 발현이 중비갑개나 하비갑개 점막조직과 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았다. 비용조직에서 조직내 호산구 증가와 관계 있는 IL-3, IL-5, IL-8 및 GM-CSF(granulocyte macro-phage-colony stimulating factor) 등과 같은 사이토카인과 IL-1 및 TNF-α 등의 발현이 관찰되는데²⁰⁾ 본 연구의 결과들은 이러한 사이토카인 및 염증매개물들이 중비갑개나 하비갑개 점막 조직보다 GR 및 GR β isoform의 발현을 증가시키지 못한다는 것을 의미한다.
   결론적으로 비용 및 비점막조직에 대한 glucocorticoid의 작용 특이도는 세포 내 특이적인 GR의 발현에 의한다기 보다는 GR과 세포 내 특이한 전사인자와의 상호작용에 의해 결정됨을 시사하며⁹⁾¹⁰⁾ 앞으로 glucocorticoid의 정확한 작용기전 및 GR β isoform의 역할을 포함하여 glucocorticoid의 반응정도를 결정하는 요소를 파악함으로써 비과분야에서 흔히 쓰이는 glucocorticoid의 사용에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

결     론

   비용 및 비점막에서의 GR 및 GR β isoform은 상피세포 및 점막하 염증세포에 주로 발현이 되었고 상피세포는 모든 조직에서 대부분의 세포가 일정하게 발현되었으며, GR β isoform의 발현은 GR의 발현과 유사한 분포를 보였다. 비용조직에서의 GR 및 GR β isoform의 발현은 호산구의 침윤 정도 및 알레르기 동반 유무와 통계적으로 유의한 상관관계를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 상피세포가 스테로이드의 중요한 작용부위이며 조직에 침윤된 호산구수의 증가와 알레르기가 GR 및 GR β isoform의 발현을 증가시키지 못한다는 것을 의미한다.

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