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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(12); 1999 > Article
Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(12): 1533-1540.
Expression of Cytokeratin Subtypes in Advanced Laryngeal Carcinoma and Its Relationship to p53 and Human Papilloma Virus.
Han Sung Jang, Min Sik Kim, Dong Il Sun, Seung Heon Song, Jeong Hak Lee, Seung Ho Cho
Department of Otolaryngology-HNS, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. entkms@cmc.cuk.ac.kr
진행된 후두편평세포암종에서 Cytokeratin 아형의 발현과 p53 및 인유두종 바이러스와의 연관성
장한성 · 김민식 · 선동일 · 송승헌 · 이정학 · 조승호
가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
주제어: 후두편평상피세포암종Cytokeratinp53인유두종 바이러스.
ABSTRACT
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
This study investigated the expression of cytokeratin 8, 18, 19 with low molecular weight, which have been classified as a group of simple epithelium-related marker for advanced squamous cell carcinoma of the larynx.
MATERIALS AND METHODS:
Detection of cytokeratin expression was performed by immunohistochemical study using antikeratin monoclonal antibodies (CAM5.2, RCK108). Immunohistochemical study was used further to detect the presence of p53 mutation in larynx carcinoma, and PCR was performed to detect the infection of HPV. We then tried to draw relationship among these factors with regard to advanced larynx carcinoma.
RESULTS:
Cytokeratin 8, 18 (CAM5.2) was detected in 17 cases among the 19 advanced larynx carcinoma, and in 3 cases among the 15 normal larynx. Cytokeratin 19(RCK108) was detected in 18 cases among the advanced larynx carcinoma, and in 11 cases among the 15 normal larynx. HPV DNA was detected in 4 of the 19 cases of larynx carcinoma. With regard to subtypes of HPV, HPV 16 was detected in 2 cases. And p53 was detected in 6 out of the 19 cases of larynx carcinoma. There was no correlation among the cytokeratin expression, the p53 expression, and the HPV infection.
CONCLUSION:
This results show that cytokeratin 8, 18 (CAM5.2) expression might be a meaningful parameter in malignant change of the larynx, but the prognostic role of the cytokeratin and the role of p53 and HPV in cytokeratin expression in larynx carcinoma was not confirmed.
Keywords: Cytokeratin 8, 18, 19HPVp53Larynx carcinoma
서론 Cytokeratin은 인체의 상피세포에 존재하는 intermediate filament의 단백질 성분으로서 아직 그 기능이 명확하게 밝혀지지는 않았으나 세포체질(cytoskeleton)을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.1) Moll 등2)은 cytokeratin의 분자량 및 pH를 기준으로 19가지의 아형들로 나누었고 또한 인체의 부위에 따라 정상조직 및 암종에서 존재하는 아형의 종류를 정립하여 발표한 바가 있으며 이후 많은 연구가 이루어지고 있다. 이비인후과 영역에서도 두경부에서 정상조직 및 암종에서의 cytokeratin 분포와 비교에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있으며 Terry 등3)과 Hellquist 등4)은 정상 후두의 상피조직에서는 cytokeratin 8, 18, 19가 발현되지 않다가 후두편평세포암에서는 발현된다는 사실을 발표하여 cytokeratin의 발현이 후두암의 발생에 관여할 가능성을 제시하였다. p53 유전자는 암 발생과 연관된 대표적인 유전자로 이의 돌연변이가 두경부암, 유방암, 식도암, 폐암 등의 발생에 있어 중요한 역할을 한다는 것에 대하여 현재까지 여러 학자에 의해 연구가 되고 있다.5)6) 인유두종 바이러스(human papilloma virus:이하 HPV)도 암 발생의 중요한 원인이 되는 종양유발 바이러스로 산부인과 영역의 자궁경부암 등에서 많은 연구가 진행되어 왔고 두경부 영역에서도 HPV-6, -11이 후두 유두종에 또 HPV-16, -18 등이 두경부 암 발생의 한 원인으로 작용한다는 연구가 발표된 바가 있다.7) 한편 이런 cytokeratin의 변형에 영향을 주는 인자로 p53 및 HPV에 의한 것이라는 주장이 제기되고 있다. p53 의 변형이 cytokeratin의 유전자 발현에 영향을 주고8)9) HPV 감염으로 상피세포의 증식 및 분화에 영향을 준다는 주장 등이 있으나10)11) 아직 확실하게 밝혀진 사항은 없다. 이에 저자는 후향적 연구를 통해 정상 후두와 후두암간에 cytokeratin 8, 18, 19의 발현 유무를 비교하여 암 발생에 따른 변화와 병의 임상병기, 조직학적 분화도 등에 따른 발현 정도를 측정하고 더불어 p53 발현 및 HPV의 감염여부를 확인하여 그 연관성을 간접 확인하고자 본 연구를 시행하였다. 재료 및 방법 재료 1993년 7월부터 1997년 8월까지 강남성모병원에서 진행된 후두암(American Joint of Cancer Committee, 1988 년 분류에 따른 원발병소 병기 3, 4)으로 진단 받아 수술을 받은 19예의 후두암 조직을 대상으로 하였고 같은 기간동안 본원에서 수술한 전체 후두암 환자 중 채취 가능하였던 정상부위 후두조직 15예를 정상 대조군으로 하였다. 이 중 2예는 수술전 방사선 치료를 받았고 1예는 방사선 치료 및 항암제 병합치료를 동시에 받았다. 이 들 조직은 파라핀 포매처리하고 남은 조직은 -70℃에 신속히 냉동 보관한 후 실험에 사용하였다. Cytokeratin 8, 18, 19에 대한 면역조직화학적 염색 후두암 조직 및 정상 후두조직을 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거쳐 4 μm 두께의 연속 절편을 만들어 ProbeOn plus(Biotech, USA)에 부착시켜 56℃의 보온기에서 30분간 항온처리하고 xylene으로 5분간 탈 파라핀을 3회 반복 시행하고 100% 무수알코올로 2∼3회 닦아주었다. Endogenous peroxidase activity를 막기 위해 0.3% 과산화수소수에 10분간 처리하고 인산완충액(PBS)으로 2∼3차례 수세 후 trypsin으로 30분간 처리했다. 일차항체는 cytokeratin 8, 18에 대한 monoclonal antibody로 CAM5.2 (Becton -Dickinson, San Jose ,USA)를 사용하고 cytokeratin 19 단독의 monoclonal antibody인 RCK108(BioGenex, San Ramon, USA)을 사용하여 45℃에 90분간 항온처리했다. 이후 이차항체인 biotinylated goat antimouse Immunoglobulin과 avidin-biotin peroxidase complex로 각각 30분, 20분간 항온처리 후 PBS로 세척후 AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole)용액으로 발색시키고 hematoxylin으로 대조염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰하였다. 염색결과 판독은 광학현미경시야에서 염색강도에 관계없이 종양세포의 세포질이 적갈색으로 염색되는 경우를 양성으로 판독하고 그 외는 음성으로 판독하였다(Fig. 1). 염색결과 판정을 위한 양성 및 음성 대조군은 정상인의 기관지 점막을 사용하였다. p53에 대한 면역조직화학적 염색 동일 후두암조직을 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 조직을 4 μm 두께의 연속 절편을 만들어 ProbeOn plus(Biotech, USA)에 부착시켜 56℃의 보온기에서 30분간 항온 처리하고 xylene으로 5분간 2∼3회 탈 파라핀을 시행하고 100% 에칠 알코올로 2∼3회 닦아주었다. 탈 파라핀 조직은 APAAP(alkaline phosphase anti-alkaline phosphatase)를 이용한 avidine -biotin으로 염색하였다. 일차항체는 mouse 단클론성 항체(clone DO-7, Novostra Lab, Ltd. Newcastle, U.K.)로서 정상형과 변이형 p53단백에 모두 반응하는 항체를 사용하여 1:100으로 희석한 후 45℃에서 1시간 항온처리시켰다. 이차항체는 biotinylated rabbit anti-mouse immunoglobulin을 사용하였으며 45℃에서 30분간 항온처리한 후 2∼3회 세척하고 45℃ 검출액에서 15분간 처리한 후 3회 세척하였다. 발색제(fast red)는 45℃에서 10분간 처리 후 hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 양성 판정은 세포 핵안에 붉은 색의 과립이 있을 때 양성으로 판정하였다(Fig. 2). 인유두종 바이러스의 검출 DNA 추출 DNA의 추출은 -70℃에 냉동 보관된 동일 후두암 조직의 DNA는 DNA추출 kit(InstaGene Marrix, Bio-Rad Laboratories, U.S.A.)를 이용하여 추출하였다. 먼저 3 mg의 조직을 잘게 잘라 1.5 ml microcentrifuge 시험관에 넣고 세포용해용액을 첨가하여 원심분리하고 상층을 깨끗이 제거시키고 1×PBS buffer 1 ml를 넣어 다시 원심분리시켰다. 3차 증류수와 세포부유액을 각각 20 μl씩, kit시약 InstaGene matrix 200 μl를 넣어 56℃에서 15∼30분간 처리하였다. 시험관 바닥에 굳혀진 소량의 조직이 풀어질 만큼 vortex로 섞어준 뒤 남아있는 단백질의 비활성화를 위해 100℃에서 8분간 처리하고 재부유 시킨후 원심분리하여 상층액 5 μl를 PCR에 이용하였다. 중합 효소 연쇄반응 HPV DNA의 증폭은 Manos 등 12)이 고안한 L1 open reading frame 중 450bp를 증폭할 수 있는 L1 consensus primer를 이용하였다(Fig. 3). HPV DNA가 검출된 경우에는 HPV-16, -18의 아형을 구별하기 위해 한국 생명공학 연구소의 주문 합성한 206 bp를 증폭할 수 있는 HPV-16 E6 primer와 419 bp를 증폭할 수 있는 HPV-18 E6 primer를 PCR에 이용하였다(Table 1). PCR은 추출된 DNA 5 μl에 0.2 mM의 각 dNTP들, PCR buffer 10 X concentration 10 μl, 0.5 mM의 consensus primer, 2.5 unit의 Taq polymerase(Boehringer manheim, Germany)와 증류수를 섞어 총 100 μl의 양이 되도록 하였다. Thermal cycler(Perkin-Elmer, U.S.A.)에서 94℃에서 1분, 55℃(annealing temperature)에서 1분, 72℃에서 1 분간의 처리과정을 40회 반복하였다. 양성대조군으로 HPV-16, 18, 31 DNA 5 μl를 표본 DNA로, 음성대조군으로는 조직 대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 각각 사용하였다. 증폭 산출물 중 10 μl를 2% agarose gel(Boehringer manheim, Germany)에서 전기영동(80 volts에서 5분, 120 volts에서 45분)한 후 0.5 μl/ml 농도의 ethidium bromide(Boehringer manheim, Germany)용액으로 30분간 염색하였다. 양성 결과로 나온 검체를 HPV-16, -18 E6 primer를 이용하여 같은 방법으로 증폭한 다음 HPV-16은 206 bp(Fig. 4), HPV-18은 419 bp 위치에 형광띠가 나타나는 것을 양성으로 하여 분리하였다. 통계처리 자료의 유의성 검정에서 정상후두와 진행된 후두암간에 cytokeratin 8, 18, 19의 발현빈도의 차이는 χ 2 검정을 이용하였고 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다. 표본수가 적은 경우에는 Fisher's exact test로 하였다. 결과 Cytokeratin 8, 18, 19의 발현정도 총 19예의 후두암에서 cytokeratin 8, 18에 대하여 양성을 보인 경우는 17(85%)예에서 나타났고 cytokeratin 19 예는 18(95%)예에서 양성 소견을 보였다. 또한 정상 후두조직에서 cytokeratin 8, 18에는 3(25%)예에서 cytokeratin 19는 11예(73%)에서 발현하였다(Table 3)e. Cytokeratin 8, 18의 발현은 정상 후두에 비해 진행된 후두암에서 유의하게 발현하였으나(p<0.05) cytokeratin 19의 발현은 유의한 차이를 보이지 않았다. 후두암 환자 19예 중 well differentiated type이 2예, moderately differentiated type이 14예, poorly differentiated type이 3례였으며 각각 1예(50%), 13예(93%), 3예(100%)에서 cytokeratin 8, 18에 대해 양성으로 나와 통계적으로 유의하지는 않았다. 림프절 전이는 11례에서 나타났으며 이들 모두에서 cytokeratin 8, 18에 대해 발현하였고 또한 현재까지 8명이 재발하였는데 이들 모두 cytokeratin 8, 18에 대해 발현하였다. 후두암 조직 중 원발병소 병기 3은 11예, 원발병소 병기 4는 8예였으며 이중 원발병소 병기 3의 2예를 제외한 17예에서 cytokeratin 8, 18에 대해 발현하였다. Cytokeratin 19도 림프절 전이여부, 재발여부, 원발병소 병기에 대한 두 군간의 발현빈도의 차이는 없었다(Table 2). 후두암에서 p53, HPV 발현정도 p53은 19명의 후두암 조직 중 6예에서 나타나 32%의 발현율을 보였고 HPV DNA는 전체 조직 중 4예에서 나타나 21%의 양성율을 보였으며 아형에 따른 검출 빈도는 16형은 2예였고 18형은 발견되지 않았으며 16, 18이외의 형이 2예가 나왔다(Table 2). 후두암에서 p53, HPV, cytokeratin 8, 18, 19 발현간의 관계 p53발현과 cytokeratin 8, 18의 발현은 Table 4에서와 같이 p53이 발현된 6예 중 5예에서 cytokeatin 8, 18이 발현하였으나 통계적 의의는 없었으며 cytokeratin 19에서도 p53의 발현과 상관 없이 1예를 제외한 모든 예에서 발현하였다. 또한 HPV발현과 cytokeratin발현(Table 2)도 통계적으로 유의한 상관관계는 없었다. HPV발현과 p53발현 사이에도 통계적으로 유의한 상관관계는 없었다(Table 5). 고찰 Cytokeratin은 척추동물에서 세포질의 세포체질을 이루는 성분 중에 하나인 7∼11 nm 크기의 intermediate filament에 속하며 상피세포에만 존재하는 단백질인데 그 역할 및 상피내 분포에 따라1) cornification marker,2) stratification marker,3) basal cell marker,4) hyperpro-liferation-associated marker,5) simple epithelium-related marker 등으로 나눌 수 있고 이 중 cytokeratin 8, 18, 19는 모두 simple epithelium-related marker에 속한다.2) Moll 등2)은 처음으로 cytokeratin을 아형 19가지로 분류하고 이를 이용하여 신체 각 부위별, 장기별 분포양상을 관찰하여 cytokeratin 8, 18, 19가 주로 소화기관의 선암과 자궁경부의 편평세포암에서 주로 발현된다고 하였다. 두경부에서의 정상 및 편평세포암에서 cytokeratin의 분포는 Nagle 등13)이 처음으로 발표한 이래 저자들마다 그 결과가 조금씩 달랐으나 cytokeratin 4, 5, 6, 13, 14 등의 비교적 분자량이 큰 군들과는 달리 작은 군은 미량이거나 존재하지 않는 것으로 알려져 있다.2)3)4) Murakami 등14)은 Piriform sinus에서 정상에서는 cytokeratin 13이 존재하고 cytokeratin 19는 존재하지 않다가 편평세포암이 되면 cytokeratin 13은 사라지고 cytokeratin 19가 나타난다고 하였고 Morgan 등15)은 구강암에서 cytokeratin 19의 발현이 특징적이라 하였고 Moll 등2)은 설암에서 cytokeratin 5, 14, 16, 17들이 나타난다고 하였다. Terry 등3)과 Hellquist 등4)은 정상 후두에서는 보이지 않는 분자량이 작은 cytokeratin 8, 18, 19을 후두암에서 발현한다고 보고하였으나 Nagle 등13)과 Velden 등16)은 cytokeratin 19는 정상에서도 발현된다고 하였고 그 밖의 연구에서도 조금씩 다른 결과를 보고하였다.7)17) 기타 자궁암에서도 cytokeratin 8 ,18, 19의 발현에 관한 논문이 발표된 바가 있다.18) 본 실험에서는 cytokeratin 8, 18의 발현은 진행된 후두암 19예 중 17예에서 양성소견을 보이는 반면 정상 조직에서는 15예 중 3예만이 양성으로 나타나 두 군간에 유의한 차이를 보여(p<0.05) 후두암에서 관련된 인자로서의 가능성을 발견할 수 있었다. Cytokeratin 19는 15예의 정상후두 중 11예가 발현했고 후두암에서는 19예 중 18예가 발현하여 두 군간에 통계적인 유의성이 없었으며 이는 Velden 등16)의 연구에서와 같이 cytokeratin 19가 정상 후두에서도 발현되어 후두암 관련인자로 보기가 어려운 결과를 보였다. 또한 Terry 등3)은 cytokeratin 8, 18, 19의 발현이 종양조직 일부에서만 된다고 하였고 Hellquist 등4)은 다양한 모양으로 염색된다고 한 바가 있다. 본 실험에서는 cytokeratin 발현이 대부분 상피 전체에 걸쳐 염색되는 양상을 보였는데 이는 기존의 실험들이 조기암을 대상으로 하였고 이번 실험은 진행된 암조직으로만 이루어져 있었고 원발병소 병기 3인 경우에 2예에서는 염색이 안되고 원발병소 병기 4에서는 모두 염색되는 것으로 볼 때 병이 진행됨에 따라 염색의 분포 및 강도도 커질 것으로 추측되나 통계적으로 유의하지는 않았다. 한편 Mallofre 등17)은 cytokeratin의 발현여부로써 병의 예후인자와의 관계를 알아보는 실험을 통해 조직의 분화도와 cytokeratin의 발현양상과 관련이 있다고 하였다. 본 실험에서는 림프절 전이는 11예에서 나타났으며 모두에서 cytokeratin 8, 18 양성을 나타냈고 전이가 없는 8예 중 6예(75%)에서 양성을 나타내 차이가 없었으며 분화도는 후두암 환자 19예 중 well differentiated type이 2예, moderately differentiated type이 14예, poorly differentiated type이 3예였으며 각각 1예(50%), 13예(93%), 3예(100%)에서 cytokeratin 8, 18에 대해 양성으로 나와 통계적으로 유의하지는 않았으나 분화도가 떨어질수록 발현율이 높은 경향을 나타냈다. 이런 cytokeratin의 발현 양상이 암조직에서 정상조직과 다른 아형으로 발현되는 원인에 관한 연구가 되어왔으나 아직 확실한 규명된 결과는 없다. Syrjnen 등16)은 HPV 감염으로 인한 simple epithelium related marker인 cytokeratin 8, 18의 발현을 증가시킨다고 하였고 Mukhopadhyay 등17)은 p53 유전자 변이와, Mole 등18)은 p53 유전자 변이 및 human papilloma virus 감염 모두 관련이 있다고 하였다. HPV는 60여종의 아형이 있으며 약 8000 base pair를 갖는 이중나선구조의 DNA 바이러스로 우리 몸의 상기도에 2% 정도가 잠복 감염 형태로 존재하다가 어떤 요인에 의해 활성화되어 암발생에 보조적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 두경부 영역에서는 점막이 외부에 직접 노출되어 있어 HPV 감염의 가능성이 높고 특히 HPV-16, -18형이 암발생과 관계가 있는 것으로 알려져 있다. Syrjnen 등11)은 자궁경부암에서 HPV에 감염된 경우에서 cytokeratin 8, 18의 발현율이 매우 높은 것으로 보고하였으며 Durst 등19)은 HPV16 immortalized human keratinocyte cell line의 악성화 과정에서 cytokeratin 8, 18이 발현된다고 하였다. 또한 Sun 등10)도 HPV 16 immortalized ectocervical keratinocyte에서 cytokeratin의 분포가 변형됨을 주장하였다. 본 실험에서는 HPV의 발현이 총 4예에서 있었고 이들 모두에서 cytokeratin 8, 18 및 cytokeratin 19의 발현이 모두 있었으나 HPV 발현이 안 된 경우에도 cytokeratin 발현이 대부분 양성으로 나와 의미있는 차이는 발견할 수 없었다. 암억제 유전자인 p53은 정상에서는 세포주기를 조절하여 세포 변형과 증식을 조절하여 암 발생을 억제하나 변이가 일어나면 암의 발생을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이런 p53의 변이는 자궁경부암을 비롯한 여러 가지 암종에서 발현되고 후두암에서도 발현율이 높은 것으로 나타나고 있다.20) p53은 정상형과 변이형으로 나눌 수 있고 정상형은 세포내 농도가 낮고 반감기가 6∼20분으로 짧아 발견이 잘 안되는 한편 변이형은 반감기가 6시간 이상의 안정된 형태로 존재하여 면역 조직화학법에 의해 검출이 가능하다. Moles 등9)은 in vitro에서 정상 keratinocyte의 reconstituted epidermal culture에서 mutant p53이 cytokeratin 19의 발현을 유도한다고 하였다. 또한 Anderson 등21)은 p53의 변형이 cytokeratin 8, 18의 발현에 관계가 있다고 하였고 Mukhopadhyay 등8)은 wild type의 p53이 cytokeratin 8의 발현을 조절한다고 하였다. 이를 알아보기 위해 본 실험에서도 cytokeratin 19 단독의 1차 항체인 RCK108을 사용하여 mutant p53과의 관계를 관찰하였으나 이들 사이의 통계적인 유의성을 보이지는 않았고 cytokeratin 8, 18과 p53과도 상관관계가 없는 것으로 없는 것으로 나타났다(Table 4). Velden 등은16)은 조기 후두암과 이형성증에서 cytokeratin 8, 18을 확인하여 정상조직과 조기암과의 감별에 중요한 지표가 된다고 한 바가 있으나 본 연구에서는 진행성 후두암만을 대상으로 후향적 연구로 이루어져 이를 확인 할 수 없었다. 한편, 자궁경부암종이나 후두암종에서 HPV감염과 p53 유전자 발현의 연관성에 대한 연구가 보고되고 있는데 Salam 등22)은 HPV가 감염된 조직에서는 HPV 유전자 산물인 E6 단백질과 정상형 p53 유전자가 결합을 이룬 후 정상형 p53 유전자가 분해됨으로써 HPV 감염과 p53 유전자 발현은 역비례의 관계가 있다고 하였고 Park 등23)은 관련이 없다고 한 바가 있다. 본 실험에서는 HPV DNA 발현과 p53 발현은 Table 5에서와 같이 HPV DNA 발현군에서 p53은 역비례의 양상을 보이나 통계적으로 유의하지는 않았다. 이상의 결과를 볼 때 후두암에서 p53 및 HPV를 포함한 cytokeratin의 발현에 영향을 주는 인자에 대한 지속적인 연구와 추 후 조기암을 포함한 좀 더 많은 증례를 대상으로 전향적인 연구가 이루어져야 될 것으로 본다. 결론 저자들은 이번 실험을 통해 cytokeratin 8, 18의 발현 정도가 정상 후두와 진행성 후두암 사이에 통계적으로 유의한 차이를 보여 후두암 발생과정에 한 지표임을 알 수 있었으나 이러한 변화의 원인으로 제기되어온 p53 및 HPV와의 관계는 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나 조기암을 포함한 좀 더 많은 환자를 대상으로 연구가 지속될 필요가 있다고 생각된다.
REFERENCES
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