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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(7): 976-983. |
| Mitotic Activity of Tympanic Membrane and External Auditory Canal Skin in Normal Mongolian Gerbil. |
| Kee Hyun Park, Young Myoung Chun, Seong Mo Koo, Seong Kyun Kim |
| Department of Otolaryngology, School of Medicine, Ajou University, Suwon, Korea. |
| 정상 Mongolian gerbil의 고막과 외이도상피의 세포증식도 |
| 박기현 · 전영명 · 구성모 · 김성균 |
| 아주대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Understanding the differentiation and migrating character of the tympanic membrane, external auditory canal as well as cholesteatoma pathogenesis needs knowledge about epithelial generation center.
OBJECTIVE: We investigated the distribution of the epithelial generation center in the tympanic membrane and external auditory canal using 5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU) immunohistochemistry.
MATERIALS AND METHODS:
BrdU was injected into peritoneum of 10 Mongolian gerbils and gerbil's temporal bones were obtained and serial section was done. Anti-BrdU antibody immunohistochemical stain was done.
RESULTS:
The labeling index was highest at posterosuperior quadrant of pars tensa, higher at malleus handle attached area and annulus region. On pars flaccida, labeling index was high at entire area. The labeling index of deep meatal skin was higher than that of lateral meatal skin, especially near annulus area. According to results, epithelial generation centers are thought to be on pars flaccida, posterosuperior quadrant of pars tensa, malleus handle attached area and annulus region.
CONCLUSION:
These findings are similar to those of human tympanic membrane and external auditory canal, and gerbils can be used as a animal model for study of normal human tymapnic membrane, external auditory canal and cholesteatomas. |
| Keywords:
BrdUㆍEpithelial generation centerㆍImmunohistochemistryㆍMigration |
서론
고막과 심부외이도상피의 이동속성은 인체에서는 유일하게 귀에서만 일어나며 귀지나 이물질 등을 외이도의 바깥쪽으로 이동시키는 현상으로서, 1877년 Burnett이 paper patch를 이용하여 처음 기술하였고, Litton1)은 3H-thymidine uptake를 이용하여 외이도에서 바깥쪽으로의 이동속성에 대하여 기술하였다. Alberti2)는 정상고막에서, Boedts3)는 고막천공과 같은 병적상태에서의 이동속성의 변화에 대해 기술하였다. 세포분화생성은 고막과 외이도의 상피생성중심부에서 일어나며 표층에서의 수평이동과 기저세포에서 수직방향으로 이동이 일어난다. 이러한 이동속성의 임상적 의의는 고막과 심부외이도상피의 자가세척과 고막천공시 회복과정에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 고막과 심부외이도상피의 각화과정이나 진주종형성에도 관련이 있슬 것으로 생각되고 있다. 특히 진주종의 형성에 대한 관련기전으로서, 염증과 수축낭이 생기면 성장인자나 사이토카인 등의 분비가 증가되어 고막과 외이도에 이미 존재하고 있는 상피생성중심부의 활성도가 증가되거나, 새로운 상피생성중심부가 다른 부위에서 형성되고 이에 의해 상피세포의 과증식이나 이동속성의 변화가 생겨 케라틴이 축적되면서 진주종이 생기는 것으로 생각되고 있다.
이러한 상피이동속성은 Burnett 이후 많은 학자들이 인체2) 및 기니아피그1) , 마우스3) , 햄스터3) , Mongolian gerbil4)등 동물에서의 고막의 이동속성에 대해 보고하였다. 각 동물과 인체에서 상피이동속성을 비교해 보면 서로 차이가 있스며 본 연구에서는 우선 중이질환의 동물실험모델로 많이 이용되고 있는 Mongolian gerbil에서 고막과 심부외이도의 상피생성중심부가 그 나름대로의 특이성을 가지고 있을 것이라는 가정을 하였다. 상피생성중심부의 위치를 찾기위한 방법으로 ink dot method2) , 3H-thymidine uptake, BrdU 면역조직화학적 염색방법5)등이 이용되어왔는데 ink dot method는 상피표층에서의 이동속성만을 관찰할 수 있는 반면, BrdU 면역조직화학적 염색방법은 수시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 상피의 심층부에서 표층부까지의 수직이동까지 관찰할 수 있스며, 또한 BrdU가 시간대별로 각층에서 변화되는 양상을 통하여 세포의 교체를 알 수 있는 장점이 있다. 본 저자는 BrdU 면역조직화학적 염색방법을 이용하여 gerbil의 고막과 심부외이도상피에서 상피생성중심부의 위치를 찾아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 실험재료
실험동물은 체중 60∼75g의 생후 90일에서 120일된 10마리의 정상 Mongolian gerbil(Meriones unguiculatus)을 사용하였다.
2. 실험방법
1) 조직 채취
Gerbil의 복강내에 5-bromo-2-deoxyuridine(Sigma Chemical Co. St. Louis, USA)를 10mg/kg의 용량으로 주입하고 두시간이 경과한 후, 솜에 ethyl ether를 적시고 흡입시켜 충분히 마취시킨 다음, 흉부를 절개하여 심장을 노출하였다. 노출된 심장의 좌심실에 카테터를 삽입하여 생리식염수 50cc와 10% 중화 완충 포르말린 100cc를 각각 주입한 후 우심실에 절개를 가하여 배액을 시키면서 관류고정을 시행하였다. gerbil의 두개골이 완전히 고정된 것을 확인한 후 측두골포와 후이부 피부 및 배부 피부를 취하였다. 조직을 상온에서 10% 중화 완충 포르말린 용액에 약48시간 이상 고정한 후 10% EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)용액에 2주간 탈석회화시켰다. 조직을 파라핀에 포매시킨 후 이를 4μm의 두께로 연속적인 조직 절편을 만들고, hematoxylineosin 염색을 하여 광학현미경(Olympus, Venox-S, Japan)으로 조직세포를 관찰하여 조직의 각 부위를 확인한 후 다음과 같이 BrdU 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
2) 면역조직화학적 염색
파라핀조직을 xylen에 넣어 파라핀을 용해세척시키고 100, 90, 80, 70%의 에틸알코올로 수화시킨 후, 메틸알코올에 3% 과산화수소수를 혼합한 용액에 5분간 반응시켰다. 0.01M, pH7.6의 PBS(phosphate buffered solution)에 5분간 3회 세척한 후 37℃의 0.1% calcium chloride와 0.1% trypsin 용액에 20분간 반응시킴으로써 효소 소화를 하였다. 다시 0.01M, pH 7.6의 PBS에 세척한 후 10% 정상 토끼 혈청에 10분간 반응시켰다. 0.01M, pH7.6의 PBS에 세척한 후 95% formamide(Merck Co. Darmstadt, Germany)와 0.15M trisodium citrate 혼합 용액에 70℃에서 45분간 반응시켜 double stranded DNA를 부분변성시켰다. 0.05M, pH7.6의 TBS(trizma buffered solution)에 5분간 3회 세척한 후 20배 희석된 BrdU 1차 항체(DAKO Co. Denmark)에 12시간동안 반응시켰다. 다시 0.05M, pH7.6의 TBS에 세척한 후 2차 항체에 10분동안 반응시키고, 0.05M, pH7.6의 TBS에 세척한 후 ABC(avidin-biotin peroxidase complex)용액으로 염색하였다. 0.05M, pH7.6의 TBS에 세척한 후AEC(3-amino-9-ethylcarbazole) (DAKOCo. Denmark)로 염색시켜 광학현미경(Olympus, Venox-S,Japan) 시야에서 관찰하였다.
3) 결과 분석
고막은 크게 이완부와 긴장부로 나누고 긴장부는 다시 추골병을 중심축으로 후상부와 전상부, 후하부, 전하부 및 추골병부착부위등 다섯부위로 나누었스며 외이도상피는 심부와 측부로 나누었다. 각 부위에서 AEC에 염색되는 양성세포를 관찰하고 200개의 기저세포 중에서 양성발현세포의 갯수를 백분률로 Labeling index(LI)라고 정의하였다. 각 부위별로 LI의 평균치와 표준편차를 구하고 Spearman 상관계수법을 이용하여 통계학적인 의미를 살펴보았다.
결과
10마리의 gerbil에서 20개의 골포조직을 얻고, 외이도의 횡축에 평행하게 상부부터 하부까지 연속적인 절편으로 만들어서 BrdU 면역조직화학적 염색한 후 광학현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1. 고막
고막은 크게 긴장부와 이완부로 나누고 긴장부는 다시 전상부, 후상부, 전하부, 후하부와 추골병부착부위로 나누어 관찰하였다. 고막의 긴장부(Fig. 1-a)에서 대개의 양성세포는 고막륜주위와 추골병주위에 주로 분포하였고 기저세포에서만 발현을 보였다. 후상부(Fig. 1-b)는 다른 부위보다 세포수가 여러층으로 약간 두껍고 이 부위의 LI는 13.2(4∼20)이었고, 전상부에서의 LI는 10.0(4∼16)이었다. 추골병부착 부위(Fig. 1-c)는 LI는 18.0(8∼28)이었다. 후하부(Fig. 1-d)에서 양성발현세포는 후상부나 전상부에 비해 적은 갯수로 관찰되었스며 LI는 3.6(1∼10)이었고, 전하부는 후하부와 마찬가지로 후상부나 전상부에 비해 양성발현세포의 갯수가 적은 갯수로 관찰되었스며 LI는 3.2(2∼4)이었다. 고막의 긴장부에 비해 이완부(Fig. 2)는 두꺼운 세포층이 관찰되었는데 BrdU 양성세포는 특정부위에 국한되지 않고 고르게 관찰되었다. LI는 19.3(8∼38)이었다.
각 부위별로 LI의 통계학적인 의미를 살펴보았다. 고막(Table 1)에서 이완부와 추골병부착부위의 양성발현세포의 갯수는 긴장부의 후하부 및 전하부에 비하여 많은 수로 관찰되었고 이는 통계학적인 의미가 있었다(p<0.05). 긴장부의 후상부 및 전상부에서도 후하부 및 전하부에 비하여 많은 수로 관찰되었스나 통계학적인 의미는 없었다(p>0.05).
2. 외이도상피
심부외이도상피(Fig. 3)는 전부와 후부로 나누었스며 전부에서 LI는 12.8(4∼20)이었고, 후부에서 LI는 11.3(2∼20)이었다. 전반적으로 고막륜에 인접된 부위의 밀집도가 높았다. 측부외이도상피(Fig. 4)에서는 심부외이도에 비해 적은 갯수로 관찰되었스며 LI는 6.3(2∼11)이었다.
각 부위별로 LI의 통계학적인 의미를 살펴보았다(Table 2). 심부외이도상피에서 양성발현세포의 갯수는 측부 외이도상피에 비하여 많은 수로 관찰되었고 이는 통계학적인 의미가 있었다(p<0.05).
고찰
외이도의 상피는 체부 피부상피의 연장이고, 외이도의 연골부피부상피는 다른 피부와 같이 분비선이나 모낭을 포함하고 있는데 반하여, 외이도 내측부의 골부와 고막의 피부상피는 여러가지 면에서 다른 피부상피와 다르다. 외이도심부상피는 피부부속기가 없고, 고막은 매우 얇으며, 또한 피부표면을 통해 각질세포가 이동하여 측방이동을 하는 특성이 있다.6) 즉, 고막이나 외이도심부상피는 이동속성을 갖고 있는 유일한 장기구조로 귀에서의 상피이동속성은 고막과 외이도상피의 측방이동을 시키며 케라틴의 제거에 관여한다. 이러한 상피이동속성은 일찌기 1877년 Burnett이 paper patch를 이용하여 처음 기술하였고, 많은 학자들이 ink dot method를 이용하여 인체2) 및 기니아피그1) , 햄스터3) , mouse3) , Mongolian gerbil4)등 동물에서의 고막의 이동속성에 대해 보고하였다. 각 동물과 인체에서 상피이동 속성을 비교해 보면 대부분의 rat와 mouse에서 상피생성중심부는 추골병부착부위의 상부와 고막륜 근처에 위치하며 상피이동은 추골병을 따라 하부로, 그리고 추골병에서 외측과 하부로 향한다. 그러나 대부분의 인체에서 상피이동은 고막제대부에서 말단부를 향하며, 20% 정도에서는 추골병에서의 상피이동이 제대부에서 고막이완부를 향하여 일어난다.7) 또한 기니아피그에서 상피생성중심부는 심부 외이도의 하벽에 위치하여 고막에서의 상피이동이 고막에서 상부로 향하는 차이가 있다.1)
한편 Yi 등4)에 의하면 Mongolian gerbil에서 ink dot method를 이용한 실험에서 상피생성중심부가 추골병부착부위에 있스며 상피이동이 추골병부착부위에서 원심방향 및 추골병을 따라 상부로 향하는 양상을 보였다. 본 저자의 gerbil 실험에서 상피생성중심부는 주로 긴장부의 추골병 주위외에도 후상부, 고막륜 그리고 고막 이완부로 생각되며, 이것은 Yi 등4)의 결과와 차이를 보이고 있다. 그 차이는 실험방법에 있어서 ink dot method가 표층의 상피이동을 주로 관찰할 수 있는 반면 BrdU 면역조직화학적 방법이 상피의 심층부에서 표층부까지의 수직이동까지 관찰할 수 있는 것에 기인하는 것으로 보인다. Gratzner8)에 의해 개발된 BrdU은 thymidine유도체로서, 증식세포의 합성기(S-기)에 표식되어 항 BrdU 단클론항체를 이용한 면역조직화학적 방법으로 검출하는 방법이 개발되어 수시간 내에 결과를 얻을 수 있고, 방사선의 위험이 없어 임상에 쉽게 적용할 수 있스며, 세포증식의 정량적 관찰에도 이용되고 있다. 그러나, 세포교체의 기간을 검사하기 위하여 장시간의 관찰이 필요한 경우에는 BrdU의 대사에 문제가 있슬 수 있다.7)
Soucek 등8)은 상피이동속성의 방향에 대하여 두가지 위치와 방향을 제시하였다. 첫번째는 고막의 이완부와 추골병부착부위의 상피로서 이동이 추골병을 따라서 상부로 향한 후, 추골의 측돌기와 이완부를 따라 후상방으로 향한다고 하였다. 두번째는 고막의 긴장부상피에서 일어나는 것으로서 추골병부착부위에서 고막륜쪽을 향해 이동하며, 이 두가지 이동이 외이도에 도달하면 외이도를 따라서 바깥쪽으로 향하게 된다고 하였다. Alberti2)는 인체의 정상고막과 외이도에서의 상피이동의 속도가 고막에서는 25∼70μm/day이고 외이도에서는 89∼157μm/day라고 밝혔다. Litton1)은 기니아피그를 이용한 연구를 하였는데 이동속성이란 상피생성중심부가 인접한 상피를 측방으로 전이시키는 과정이라 하였으며, Boedts 등9)은 상피이동이 일어나는 층이 stratum corneum이라고 주장하였다. 그러나 Johnson 등10)은 그러한 주장들을 반박하였는데 기니아피그에서 고막상피의 심층부에서 filamentous actin이 분포함을 발견하였고 이는 상피의 stratum spinosum과 stratum basale에서 상피이동이 능동적인 기전으로서 일어나는 증거라고 주장하였다.
Koba11)는 가토의 정상고막과 인공적으로 천공된 고막에서 BrdU 면역조직화학적 방법을 이용하여 상피이동에 대한 실험을 하였는데 BrdU 양성세포가 고막륜근처, 추골병부착 부위, 그리고 후상부 및 전상부에서 높은 빈도로 발견되었다고 보고하였스며, 천공 후 상피세포의 증식은 천공변연 뿐만이 아니라 고막의 전장에서 일어나며 천공의 치유과정에 있어서 시간적인 변화도 관찰하였다.
이러한 상피이동의 장애가 중이진주종과 고막이나 외이도의 keratosis 등을 유발할 수 있다.12) 진주종과 수축낭에서의 상피이동속도에 관하여서 아직도 많은 논란이 있어왔는데 Saad13)는 그 속도가 느리거나 정상이라고 주장하였고 Sade14)는 매우 느리다고 하였으나, Bahadur 등15)은 수축낭에서의 상피이동이 정상에서보다 더 빨리 일어난다고 하였다. Makino 등16)은 수축낭에서는 상피이동의 장애가 없스며 진주종에서도 상피이동의 회복가능성이 있다고 하였다.
Litton1)은 후천성 중이진주종이 고막이나 심부외이도상피에서 중이강내로 자라들어가는 것을 상피세포 이동속성의 장애로 설명하였다. 그는 상피증식과 이동을 고막 혹은 심부외이도상피의 표면을 기준으로 수직이동과 측방이동으로 구분하여 중이나 외이도의 염증이 있을 경우, 이들 두 상피이동기전의 평형이 파괴되어 이들중 수직이동이 측방이동을 압도하여 케라틴이 축적된다고 하였다. 축적된 케라틴은 더욱 염증반응을 악화시키고, 이는 결국 상피이동기전의 불균형을 악화시켜, 결국 진주종을 형성한다고 주장하였다. 이와는 달리 이들 두 상피이동기전의 장애가 초래되지 않는 경우는 단순한 수축낭만을 형성한다고 하였다. 그런데 이들 질환의 원인은 상피이동의 장애로 인한 케라틴의 축적외에도 보다 능동적인 기전으로 상피증식도가 증가되어 유도될 수 있다. 따라서 고막과 외이도상피의 분화와 이동속성을 이해하고, 또한 유도된 진주종의 형성과 병리기전등의 옳바른 해석을 위해서는 고막과 외이도상피의 “epithelial generation center”에 대한 이해가 선행되어야 한다. 이러한 측면에서 볼때 진주종과 고막 혹은 외이도심부상피의 분화도 변화는 상호 밀접한 관련이 있슴을 가정해 볼 수 있다.
이러한 중이 질환의 연구를 위해 인체 외에도 적절한 동물 모델로서 Mongolian gerbil이 많이 이용되고 있는데 propylen glycol이나 chemical irritant 투여, 또는 이관폐쇄등의 방법으로 진주종을 유발할 수 있다. 또한 gerbil은 그 자체가 자발성 진주종을 유발할 수 있는 동물일 뿐 아니라 외이도를 수술적 방법으로 폐쇄시키면 외이도내에 케라틴의 축적이 가속화되어 진주종이 형성되며 이것이 더욱 진행되어 고막이 내측으로 밀리게 된다. 이러한 현상은 gerbil에서 외이도의 케라틴 생성도가 매우 높은 이유도 있겠스나 다른 종의 경우 초기의 케라틴 축적이 그 이상의 케라틴 생성을 억제하기 때문에 gerbil과는 다르게 고막의 내측이동과 같은 현상을 관찰할 수 없다.17) 이에 저자는 gerbil의 고막과 심부외이도상피의 상피생성중심부의 정상적인 분포를 알아보고자 BrdU을 gerbil의 복강에 투여한 후 단클론성 항 BrdU를 이용한 면역조직화학적 방법을 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
고막의 긴장부에서의 양성발현세포의 분포도는 고막의 후상부가 가장 높았고, 특히 추골병과 고막륜주위에 집중된 소견을 보였다. 이에 비해 고막이완부는 특정 부위없이 전반적으로 증가된 소견을 보였다. 심부외이도상피는 외이도 연골부에 비해 높은 증식도를 보였고, 주로 고막륜에 인접된 부위의 밀집도가 높았다. 이상의 결과로 gerbil에서의 상피생성중심부는 주로 고막 이완부와 긴장부의 후상부, 고막륜 그리고 추골병 주위로 생각된다. 한편 전 등18)은 인체의 심부 외이도상피에 대한 PCNA 면역조직화학적 염색 결과 외이도 연골부와 후이개상피에 비해 과증식 성향을 보이며 이 부위가 외이도의 상피생성중심부라 보고한 바 있다. 본 저자의 gerbil에 대한 연구결과는 대체적으로 현재까지 보고된 사람의 고막 및 외이도상피의 연구결과와 유사한 결과이며 장차 gerbil을 사람의 고막과 외이도상피의 정상구조 및 진주종발생의 연구에 기초자료로 이용할 수 있슬 것으로 사료된다.
결론
Mongolian gerbil의 고막과 심부외이도상피의 상피생성중심부의 정상적인 분포를 알아보고자 BrdU을 gerbil의 복강에 투여한 후 단클론성 항 BrdU를 이용한 면역조직화학적 방법을 사용하여 실험한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
Gerbil에서의 상피생성중심부는 주로 고막 이완부와 긴장부의 후상부, 고막륜 그리고 추골병 주위로 생각되며, 이의 결과는 대체적으로 현재까지 보고된 사람의 고막 및 외이도상피의 연구결과와 유사한 결과이며 이는 장차 gerbil을 사람의 고막 및 외이도상피의 정상구조 및 진주종의 연구에 기초자료로 이용할 수 있슬 것으로 사료된다.
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