교신저자：박경호, 137-701 서울 서초구 반포동 505  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 590-4933 · 전송：(02) 590-1354 · E-mail：khpent@catholic.ac.kr

서     론

   감각신경성 난청은 이독성 약제, 방사선 치료, 소음 노출, 외상 등 다양한 원인에 의해 발생하며 유모세포가 비가역적으로 기능을 하지 못하는 것을 의미한다. 유모세포는 나선신경절에서 신경 흥분이 일어나게 만드는 중요한 역할을 하는데, 고막을 통해 전달된 소리 에너지는 유모세포에서 전기 에너지로 변환되어 수초를 거쳐 나선신경절로 에너지를 전달하게 된다. 한편 유모세포의 손상이 발생하게 되면 일부에서는 가역적 회복 과정을 거쳐 재생되기도 하지만, 대부분의 경우에서는 유모세포의 비가역적인 손상으로 인해 영구적인 난청이 발생하는 것으로 알려져 있다. 최근 많이 시도되고 있는 인공와우이식의 경우 유모세포의 손상이 있는 환자에서 시행되는데, 정원창을 통해 전극을 삽입함으로써 헤드셋, 마이크로폰, 언어처리기를 통해 전기적 신호를 인공적으로 만들어주게 된다. 따라서 나선신경절 손상이 있는 환자에서는 인공와우이식을 시행할 수 없게 되는데, 실험적으로 유발된 이독성 동물에서 신경성장인자를 이용한 치료를 하였을때 나선신경절에서 세포 재생이 발생한다는 여러 보고들이 있어 왔다.^1,2,5)
   저자들은 guinea pig에서 kanamycin과 ethacrynic acid를 투여해 전농을 만들고, 기존에 보고되었던 여러 가지 신경성장인자들을 사용해 청력향상에 주는 영향에 대해 분석해보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물
   실험 동물로 미세현미경하에서 중이염 소견이 보이지 않았고, 이소골이 관찰되는 정상 고막을 가지고 있는 15마리의 guinea pig(30귀)를 대상으로 하였다. Preyer's reflex 양성 소견을 나타내었으며, 시행한 청성뇌간반응검사상 정상청력을 보였다(Fig. 1). 체중은 200~300 g 정도였다. 실험 동물의 마취는 tiletamine hydrochloride(50 mg/kg)와 xylazine(1 mg/kg)을 복강 주사하여 마취를 유도하였다.

이독성 유발 및 실험 설계
   실험동물 15마리에 이독성을 유발하기 위해서 kanamycin(450 mg/kg)을 피하 주사하였고, 2시간 후에 ethacrynic acid(60 mg/kg)를 정맥 주사하였다. 1주 후 청성뇌간유발반응검사를 시행하여 모두에서 전농 상태가 유발됨을 확인하였다(Figs. 2, 3 and 4). 저자들은 실험설계를 위해 미리 실험하였던 실험에서 5주 이상 전농상태가 지속되는 것을 확인하였다. 한편 청력 확인 후 정원창으로 신경성장인자를 투여하기 위해 현미경하에서 guinea pig의 양측 고막의 후 하방에 고막 절개를 실시하였으며, 우측 귀에는 신경성장인자를 충분히 묻힌 gelfoam을 pick을 사용하여 중이강 내로 주입하여 정원창 주위에 위치되도록 하였다. 좌측 귀에는 생리식염수를 묻힌 gelfoam을 pick을 사용하여 중이강 내로 주입하여 정원창 주위에 위치되도록 하였다. 5마리의 guinea pig에는 brain-derived neurotrophic factor(BDNF, 5 ng/mL), glial cell derived neurotrophic factor(GDNF, 5 ng/mL), neurotrophin-3(NT-3, 10 ng/mL) 혼합액을 주입하였고, 5마리의 guinea pig에는 insulin-like growth factor(IGF, 50 ng/mL)를 주입하였으며, 나머지 5마리의 guinea pig에는 epidermal growth factor(EGF, 100 ng/mL)와 fibroblast growth factor(FGF, 500 ng/mL)의 혼합액을 주입하였다. 약물 투여 후 1주 단위로 청성뇌간반응을 측정하였다. 연속적으로 신경성장인자가 투여되고 있는지를 확인하기 위해서 매주 현미경하에서 guinea pig의 양측 고막의 정원창 부위에 gelfoam이 존재하는지를 확인하였으며, 3주까지 gelfoam이 관찰되었다.

청성뇌간유발반응검사
   신경성장인자를 투여 후 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 째 각각의 청성뇌간반응을 측정하였으며, 청성뇌간반응 측정을 위해 방음실에서 Navigator Pro(Biologic systems Co., Model Number：580 NAVPR2)를 사용하여 검사하였다. 전위는 활동전극을 두정부에 삽입하였고, 기준전극은 양측 귀의 후하방에, 접지 전극은 양측 유양동 부위에 삽입하여 측정하였다. 청각 자극을 위해 삽입형 ear phone(Biologic systems)을 양측 외이도에 위치시킨 후 전기 자극을 가하였다. 청각 자극음은 100 us의 click음을 초당 11.1회의 비율로 1,024회 자극음을 주었다. 청력의 역치 측정을 위해 주파수에 따른 전위 역치를 90 dB SPL의 click 강도로부터 시작하여 10 dB씩 단계적으로 줄여 청성뇌간유발반응검사상 인지가 가능한 형태의 V wave가 관찰될 때를 최저 자극치로 정하였다.

통계분석
   결과값은 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 분석을 위해서 SPSS 11.0(SAS inc. USA)을 사용하였으며, 실험군과 대조군 사이에 차이가 있는지를 알아보기 위해서 paired t-test를 수행하였다.

결     과

   BDNF, GDNF, NT-3의 혼합액을 투여하였던 1군에서는 5주째에 평균 35.00±13.78 dB(유의수준 0.001)의 역치감소가 측정되었으며(Fig. 2), IGF를 투여하였던 2군에서는 34.0±5.47 dB(유의수준 0.001)의 역치감소가 측정되었다(Fig. 3). EGF와 FGF의 혼합액을 투여하였던 3군에서는 20.0±10.07 dB(유의수준 0.74)의 역치감소가 측정되었지만, 유의한 의미는 없었다(Fig. 4). 
   신경성장인자를 투여한 후 청각역치를 대조군과 비교하였을 때 신경성장인자를 투여한 군에서 대부분 첫 번째 주부터 역치감소가 나타났으며, 3주째부터 의미있는 역치감소를 나타내었다(Fig. 5).

고     찰

   신경성장인자란 신경의 분화를 촉진하며, 신경의 생존과 성장을 촉진시키는 단백질을 의미하게 되는데, nerve growth factor(NGF), NT-3, neurotrophin 4/5(NT-4/5), BDNF 등으로 구성되어 있다. 이들 neurotrophin은 tropomyosin related kinase(Trk) 수용체에 결합하게 되는데 NGF의 경우 TrkA에 결합하고, NT-3와 NT4/5는 TrkB에 결합하게 되며, BDNF는 TrkC에 결합하여 작용하게 된다.^3,4) 이중에 BDNF와 NT3는 와우의 유모세포에서 방출되게 되는데 이들은 나선신경절에 존재하는 Trk 수용체에 결합하게 되어 나선신경절을 보호하는 역할을 한다.⁵⁾ 1997년 Miller 등은 신경성장인자가 손상 받은 유모세포의 회복을 도우며, 나선신경절의 유지에 중요한 역할을 한다는 연구결과를 발표하였다.⁵⁾
   의미있는 청력 개선 효과를 알기위해 전농 실험동물을 만드는 것이 필수적인데, 본 논문에서는 amynoglycoside에 속하는 kanamycin과 고리형 이뇨제에 속하는 ethacrynic acid를 함께 투여하여 전농을 유도하였다. Conlon 등은 ethacrynic acid와 aminoglycoside를 함께 투여하였을 경우 이뇨제가 내이의 혈류량을 증가시켜서 aminoglycoside가 유모세포에 작용하는 시간을 늘리는 것을 밝혔다.⁶⁾ 또한 Glueckert 등은 kanamycin(450 mg/kg) 투여 후 2시간 후에 ethacrynic acid(60 mg/kg)를 투여하였을 때, 유모세포가 파괴되는 것을 조직학적으로 보고하였는데, 내유모세포와 외유모세포 모두 효과적으로 파괴되는 것을 관찰하였다.⁷⁾ 본 논문에서도 역시 Kanamycin에 의해 유모세포의 손상이 일차적으로 발생하고 이어 이차적으로 나선신경절의 손상이 유발된다고 가정하고 실험을 하였다. 추후 병리조직학적인 검사를 통해 보고할 예정이다.
   이독성이 유발된 유모세포에서는 순차적으로 나선신경절의 손상도 나타나게 되는데, 회복과정에서 이들 Trk 수용체가 나타나게 된다.⁸⁾ 또한, 전기적 자극이나 기타 성장인자들에 의해 손상 받은 유모세포가 회복될 수 있으며, 이들 손상 받은 나선 신경절을 보호하는 역할을 한다는 보고도 있었다.⁹⁾ 조직학적 검사상 이들 나선신경절의 세포는 정상 나선신경절세포의 80%까지 회복을 보였으며, 치료받지 않았던 군에서는 50%의 나선신경절의 파괴가 관찰되었었다. Malgrange 등은 여러 신경성장인자의 농도에 따른 외유모세포의 변화를 관찰하면서, 외유모세포의 분포를 Jeol 전자현미경을 사용해 분석하였다.¹⁰⁾ GDNF의 경우 5 ng/mL 이상의 농도를 유지했을 때 유의한 외유모세포의 생존을 보고하였고, IGF-1의 경우 25 ng/mL 이상에서, EGF의 경우 100 ng/mL 이상에서, 그리고 FGF의 경우 500 ng/mL 이상에서 의미 있는 생존이 관찰되었다.¹⁰⁾ 이에 저자들도 유효한 신경성장인자의 농도를 구하기 위해서 이들 연구를 참고하여 결정하였었고, 이를 통해 의미 있는 결과를 얻을 수 있었다.
   일부 연구자들의 보고에 따르면 신경성장인자들은 손상 받은 유모세포를 보호하는 기능뿐만 아니라 말초 신경에서 세포의 재생을 촉진하기도 한다고 하였다.¹¹⁾ 또한, 유모세포가 손상을 받게 되면 Corti기관에 존재하는 내유모세포의 손상과 지지세포의 손상이 이차적으로 나선 신경절의 퇴화를 유발한다고 한다.¹²⁾ 따라서 난청 환자의 치료는 이들 내유모세포뿐만 아니라 나선 신경절의 회복 역시 고려해야 할 것이다.
   외부에서 주입한 신경성장인자들이 청신경 체계를 보호하는 기능을 한다는 보고는 여러 연구자들에 의해 보고되고 있으며, Yamagata 등은 BDNF와 ciliary neurotrophic factor axokine-1 analogue(CNTF)를 함께 투여했을 때 청성뇌간반응 민감도가 증가하는 것을 보고하였고,¹³⁾ Miller 등은 BDNF와 FGF를 함께 투여하였을 때 청성뇌간반응이 개선되는 것을 발견하였다.⁵⁾ 한편, Richardson 등은 NT- 3을 정원창에 투여하였을 때, 나선신경절과 지지 조직의 밀도가 증가하는 것을 보고하였다.¹¹⁾
   Varela-Nieto 등은 IGF deficient mice에서 내이 성숙의 저하와 미발달 등을 보고하였으며, 내이에서 IGF가 신경자극효과를 지녔음을 발견했다.¹⁴⁾ 또한 Lee와 Ito 등은 gelatin hydrogel을 사용해 cochlea 내로 IGF-1을 투여하는 실험을 통해 IGF를 투여했을 경우 유의한 청력개선 효과가 발생하는 것을 보고하였다.¹⁵⁾ 또한, Iwai 등도 조직학적 보고를 통해서 IGF-1을 투여했을 때 유모세포에서 세포 재생에 관여하는 것을 발견하였다.¹⁶⁾ IGF체계는 IGF-1과 IGFBP(IGF binding protein), IGF 수용체, IGFBP 관련 단백질들로 구성되게 되는데, 쥐의 난원낭에서 유모세포를 조직적으로 관찰한 결과, IGF-1과 IGFBP-5를 함께 투여했을 때 유모세포의 생존을 촉진한다는 보고도 있어왔다.¹⁷⁾
   한편 EGF와 FGF의 경우 수용체가 나선기관 전체에 걸쳐 광범위하게 분포하고 있는데, Zine 등은 이들 EGF와 FGF의 수용체가 유모세포뿐 아니라 지지세포들에도 분포한다는 사실을 보고하면서 신경성장인자를 투여했을 경우 유모세포 및 지지세포의 분화에 영향을 미칠 가능성에 대해 언급하였다.¹⁸⁾ Miller 등에 따르면, 나선신경절이 파괴되지 않은 동물모델에서 주변에 존재하는 여러 신경물질들에 의해 유모세포를 거치지 않고 직접 신경전달이 가능하다는 보고가 있는데,⁴⁾ 본 논문에서 EGF와 FGF를 사용했던 군에서 의미있는 청력역치가 발견되지 않았던 점도 EGF와 FGF가 나선신경절을 보호하는데 효과가 미미한 것을 예상할 수 있었다. Wei 등은 porcine 배아에서 EGF를 주었을 때 비특이적 신경 분화가 진행된다는 사실을 찾았다.¹⁹⁾ 또한, Sekiya 등은 외상에 의해 파괴된 와우세포에서 FGF를 투여했을 경우 나선신경절의 재생이 발생한다는 사실을 보고하였다.²⁰⁾
   이에 저자들은 여러 저자들이 보고했던 신경성장인자들을 guinea pig의 정원창에 직접 투여하였을 때 청력에 어떤 변화가 생기는지를 알아보고자 하였으며 BDNF, GDNF, NT- 3를 투여하였던 군과 IGF를 투여했던 군에서 유의한 청력역치감소가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 한편, EGF와 FGF를 투여했던 군에서는 약 20 dB의 청력역치감소가 나타났지만 유의한 의미를 나타내지는 않았다.
   Guinea pig에 약물을 투여하는 방법으로, 고실개방을 통해 신경성장인자를 gelfoam에 묻혀서 직접 투여하는 방법과 miniosmotic pump를 사용해 투여하는 방법 두 가지가 있는데, 전자의 경우 투여농도를 조절할 수 없다는 점과 시술자의 숙련도에 따라서 정확한 투여가 불가능할 수도 있다는 단점이 존재한다. Iwai 등에 따르면 IGF를 적신 hydrogel을 정원창 주변으로 투여할 경우 3일에서 7일까지 유지된다고 보고하였다.¹⁶⁾ 한편 자극이 연속적 혹은 간헐적이냐에 대한 연구도 있어 왔는데, 지속적으로 신경성장인자 자극을 주는 것과 간헐적으로 자극을 주는 것이 동일하게 나선신경절을 보호하는 역할을 한다는 사실도 알려져 왔다.¹¹⁾ 신경성장인자를 직접 투여하는 방법의 경우 비교적 저렴한 비용으로 실험이 가능하며, 미리 보고된 바와 같이 충분한 양을 투여했다면 우수한 결과를 얻을 수 있다는 점에서 많이 사용되고 있다. Mini osmotic pump를 사용해 투여하는 경우 기계 구입시 비용이 소요되며, 지속적으로 pump를 고막을 통해 주입하기 때문에 실험동물에 스트레스를 줄 수 있다는 단점이 있다. 하지만 농도의 변화를 주거나 실험의 정확도를 높여줄 수 있다는 장점이 있다. 본 저자들은 실제 임상적 적용이 가능한 gelform을 이용한 성장인자의 투여를 시도하였고 매주 현미경으로 guinea pig의 고막을 확인하여 절개창에 gelfoam이 존재하는지를 확인하였다. 실험 3주까지 gelfoam이 관찰되는 것을 확인할 수 있었고, 기존의 보고와 같이 1주 이상 지속적으로 신경성장인자의 자극이 있을 것이라고 가정할 수 있었다. 

결     론

   본 연구에서는 기존의 연구결과와 마찬가지로 BDNF, GDNF, NT-3 혼합액을 투여하였던 군과 IGF를 투여했던 군에서 의미있는 청력역치감소가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 EGF와 FGF혼합액을 투여했던 군에서는 약 20 dB 정도의 청력개선이 나타났지만, 유의한 결과를 보이지는 않았다. 이와 같은 결과를 바탕으로 새로운 난청 치료제로서 신경성장인자가 고려될 수 있으리라 생각된다.

1. Staecker H, Gabaizadeh R, Federoff H, Water TR. Brain-derived neurotrophic factor gene therapy prevents spiral ganglion degeneration after hair cell loss. Otolaryngol Head Neck Surg 1998;119(1):7-13.

2. Kopke R, Staecker H, Lefebvre P, Malgrange B, Moonen G, Ruben RJ, et al. Effect of neurotrophic factors on the inner ear: Clinical implications. Acta Otolaryngol 1996;116(2):248-52.

3. Barbacid M. The Trk family of neurotrophic receptors. J Neurobiol 1994;25(11):1386-403.

4. Ylikoski J, Pirvola U, Moshnakov M, Palgi J, Arumäe U, Saarma M. Expression patterns of neurotrophin and their receptor mRNAs in the rat inner ear. Hear Res 1993;65(1-2):69-78.

5. Miller JM, Chi DH, O'keeffe LJ, Kruszka P, Raphael Y, Altschuler RA. Neurotrophins can enhance spiral ganglion cell survival after inner hair cell loss. Int J Neurosci 1997;15(4-5):631-43.

6. Conlon BJ, McSwain SD, Smith DW. Topical gentamicin and ethacrynic acid: Effects on cochlear function. Laryngoscope 1998;108(7):1087-9.

7. Glueckert R, Bitsche M, Miller JM, Zhu Y, Prieskorn DM, Altschuler RA, et al. Deafferentiation-associated changes in afferent and efferent processes in the guinea pig cochlea and afferent regeneration with chronic intrascalar brain-derived neurotrophic factor and acidic fibroblast growth factor. J Comp Neurol 2008;507(4):1602-21.

8. Park SY, Chae SY. Immunohistochemical expressions of TrkB and TrkC receptors in rat cochleas with amikacin-induced ototoxicity. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 1998;41(12):1507-12.

9. Leake PA, Hradek GT, Rebsher SJ, Snyder RL. Chronic intracochlear electrical stimulation induces selective survival of spiral ganglion neurons in neonatally deafened cats. Hear Res 1991;54(2):251-71.

10. Malgrange B, Rigo JM, Coucke P, Thiry M, Hans G, Nguyen N, et al. Identification of factors that maintain mammalian outer hair cells in adult organ of Corti explants. Hear Res 2002;170(1-2):48-58.

11. Richardson RT, O'Leary S, Wise A, Hardman J, Clark G. A single dose of neurotrophin-3 to the cochlea surrounds spiral ganglion neurons and provides trophic support. Hear Res 2005;204(1-2):37-47.

12. Bredberg G. Cellular pattern and nerve supply of the human organ of Corti. Acta Otolaryngolog 1968;236 Suppl:1-135.

13. Yamagata T, Miller JM, Ulfendahl M, Olivius NP, Altschuler RA, Pyykko I, et al. Delayed neurotrophic treatment preserves nerve survival and electrophysiological responsiveness in neomycin-deafened guinea pigs. J of Neuroscience Res 2004;78(1):75-86.

14. Varela-Nieto I, Morales-Garcia JA, Vigil P, Diaz-Casares A, Gorospe I, Sanchez-Galiano S, et al. Trophic effects of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in the inner ear. Hear Res 2004;196(1-2):19-25.

15. Lee KY, Nakagawa T, Okano T, Hori R, Ono K, Tabata Y, et al. Novel therapy for hearing loss: Delivery of insulin-like growth factor 1 to the cochlea using gelatin hydrogel. Otol Neurotol 2007;28(7):976-81.

16. Iwai K, Nakagawa T, Endo T, Matsuoka Y, Kita T, Kim TS, et al. Cochlear protection by local Insulin-like growth factor-1 application using biodegradable hydrogel. Laryngoscope 2006;116(4):529-33. 

17. Park JY, Park YH, Shin DH, Oh SH. Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-mediated hair cell survival on the mouse utricle exposed to neomycin: The roles of IGFBP-4 and IGFBP-5. Acta Otolaryngologica 2007;558:22-9.

18. Zine A, Nyffeler M, Ribaupierre F. Spatial expression patterns of epidermal growth factor receptor gene transcripts in the postnatal mammalian cochlea. Hear Res 2000;141(1-2):19-27.

19. Wei Z, Park KW, Day BN, Prather RS. Effect of epidermal growth factor on preimplantation development and its receptor expression in porcine embryos. Mol Reprod Dev 2001;60(4):457-62.

20. Sekiya T, Shimamura N, Yagihashi A, Suzuki S. Effect of topically applied basic fibroblast growth factor on injured cochlear nerve. Neurosurgery 2003;52(4):900-7.