교신저자：신승헌, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(053) 650-4525 · 전송：(053) 650-4533 · E-mail：hsseung@cu.ac.kr

서     론

   진균은 알레르기 천식, 알레르기성 진균성 부비동염 등의 호흡기 질환을 유발하며 면역기능 장애를 가진 환자에서는 전신감염을 일으키기도 한다. 진균은 여러 종류의 항원성 물질과 단백질 분해효소로 구성되어 있고 이들 물질이 직접 호흡상피세포의 탈피를 유도할 뿐 아니라 상피세포의 수용체와 반응하고 활성화를 유도하여 화학매개물질을 만들어 알레르기 등의 염증 반응을 유발할 수 있다.¹⁾ 여러 진균들 중 20여 종이 전신감염을 일으키며 그 중 Alternaria, Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Candida 등이 호흡기 질환과 연관이 있는 것으로 알려져 있다.²⁾ 호흡기로 침범한 진균의 병원성은 호흡상피세포의 점액섬모운동에 장애가 초래되어 호흡기로 흡입된 진균의 배출이 늦어져 상피세포와 진균의 접촉시간이 길어지는 경우에 나타나게 된다. 혹은 상피세포에서 만들어진 살진균성 단백물질의 이상이 발생하는 경우에 병원성 진균으로 작용하게 된다. 세 번째로는 진균에 의해 보체 체계와 항원-항체 반응이 억제되고, 탐식세포에 의한 진균의 탐식작용이 진균에서 분비되는 gliotoxin, hyphal toxin 등에 의해 억제되는 경우이다. 마지막으로 진균에서 분비되는 단백질분해효소들이 진균의 조직내 침투를 용이하게 하여 여러 가지 질병을 일으키게 된다.^3,4,5)
   호흡상피세포는 알레르기 물질에 노출되거나 세균의 침입을 받는 경우 염증 반응이 일어나게 되고, 이때 granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF), interleukin-8(IL-8), tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등 각종 화학물질을 분비하여 염증세포의 이주와 활성화에 영향을 미쳐 국소 염증 반응을 유지, 악화시키게 된다.⁶⁾ 조직내로 이동한 염증세포, 즉 인체 면역 방어기전에 관여하는 림프구, 단핵구, 수상세포 등은 상피세포와 물리적으로나 생리적으로 밀접한 관계를 가지게 된다. 상피세포의 E-cadherin, lymphocyte-endothelial-epithelial-cell adhesion molecule(LEEP-CAM) 등은 T-림프구의 기능을 조절한다.⁷⁾ 또 T-림프구에서 만들어진 interferon-γ(INF-γ)에 의해 단핵구가 활성화되어 상피세포의 생리적 기능에 이상을 초래하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 이처럼 상피세포와 염증성 면역세포의 상호작용을 통해 조직내 염증 반응이 조절된다. 이에 저자들은 공기 중에 존재하는 진균에 의해 호흡상피세포의 활성화 즉 염증 반응이 유발되는 경우 말초혈액에 존재하는 면역세포와 활성화된 상피세포 사이에 어떠한 반응이 일어나게 되는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

진균에 의한 호흡상피세포의 활성화 유도
   호흡상피세포는 정상인 기관지상피세포 세포주인 BEAS-2B(ATCC, Manassas, VA)를 사용하였다. 10% FBS를 포함한 DMEM/F-12(Gibco, Grand Island, NY)로 배양하여 confluent monolayer가 형성되면 Alternaria alternata, Aspergillus versicolor, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum 등으로 활성화를 유도하였다. 0~200 ug/mL의 농도로 8~24시간 배양하여 최적의 반응조건을 구하였다. 양성대조군으로 tumor necrosis factor-α(TNF-α) 1 ng/mL을 사용하였다.

말초혈액 면역세포의 분리 및 상피세포와의 합동배양 
   Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)는 정상인의 heparin 처리된 말초혈액을 phosphate-buffered saline(PBS)(Gibco)과 혼합하여 Histopaque(Sigma, St. Louis, MO) 위에 놓고 원심분리하여 얻었다. CD4⁺ 림프구, Natural Killer 세포(NK 세포), 단핵구 등은 얻어진 PBMC를 CD4, CD56, CD14 항체를 이용한 magnetic cell separation (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) 방법으로 분리하였다. 
   상피세포를 Alternaria alternata 10, 25, 50, 100 μg/mL로 24시간 자극 후 상등액을 제거하고 PBS로 두 번 세척하였다. 각각의 면역세포 1×10⁶/mL을 상피세포와 함께 3~5일간 합동배양한 후 상등액을 얻어 -70℃에 보관하였다.
   면역세포 혹은 상피세포의 활성화는 상피세포의 경우 IL-6와 IL-8을 측정하였으며, PBMCs는 IL-5, INF-γ, IL-8, IL-1β, TNF-α를, CD4⁺ 림프구, NK 세포, 단핵구는 IL-6, IL-1β, TNF-α, GM-CSF를 ELISA (R&D system, minneapolis, MN)법을 이용하여 측정하였으며, 민감도는 5 pg/mL이었다. 
   상피세포와 면역세포의 상호작용이 화학매개물질에 의한 것인지 혹은 물리적 접촉에 의해 이루어지는지 알아보기 위해 transwell insert system(Corning Coster, Cambridge, MA)을 이용하여 실험을 시행하였다. 24 well plate에 lower chamber에 상피세포를 배양 후 0.4 μm의 구멍으로 이루어진 막을 가진 upper chamber에 PBMCs를 1×10⁶개를 넣고, 37℃ 5% CO₂에서 5일간 배양 후 상등액을 모아 사이토카인을 측정하였다. 

통계분석
   각각의 실험은 5회 이상 반복하여 그 결과를 얻어 말초혈액 면역세포와 상피세포 합동배양 후 얻어진 사이토카인 생성 결과를 Kruskal-Wallis test를 이용하여 분석하였으며, 통계학적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   BEAS-2B를 각종 진균으로 활성화를 유도한 경우 Alternaria alternata로 자극한 경우에만 진균의 농도와 배양 시간의 증가에 따라 IL-6와 IL-8의 생성이 증가되었다. 이에 본 연구는 타 진균을 배제한 Alternaria를 이용하여 실험을 진행하였다(Fig. 1).
   상피세포를 Alternaria로 24시간 자극 후 PBMCs와 함께 합동배양 하였다. Alternaria 10, 25, 50, 100 μg/mL로 활성화를 유도한 경우 TNF-α는 52.55±87.86 pg/mL, 139.45±142.44 pg/mL, 69.16±67.41 pg/mL, 96.68±150.75 pg/mL로 활성화를 유도하지 않은 경우의 0.33±0.51 pg/mL보다 유의한 증가 소견을 보였으나, IL-5, INF-γ, IL-8, IL-1β의 경우는 두 군간에 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). 
   Alternaria로 활성화가 유도된 상피세포와 CD4⁺ 림프구, NK 세포, 단핵구를 합동배양 후 IL-6, IL-1β, TNF-α, GM-CSF의 생성을 비교하였다. CD4⁺ 림프구와 단핵구를 활성화된 상피세포 혹은 활성화를 유도하지 않은 상피세포와 합동배양하였을 때 생성된 사이토카인의 양은 두군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. PBMCs에서 NK 세포를 분리하여 활성화된 상피세포와 합동배양한 경우와 non-NK 세포와 상피세포를 배양하여 얻은 사이토카인은 NK 세포에 의해 유의하게 많은 양의 화학매개물질이 생성되었다(p>0.05)(Fig. 3). 
   PBMCs를 transwell insert system을 이용하여 호흡상피세포와의 물리적 접촉을 막은 경우 IL-6는 8481.39±12827.26 pg/mL, IL-1β 47.54±48.21 pg/mL, GM-CSF 49.62±77.92 pg/mL, TNF-α 21.09±39.64 pg/ mL이었으며, insert를 사용하지 않아 물리적 접촉이 가능한 경우는 IL-6 33112.46±33132.91 pg/mL, IL-1β 154.14±136.20 pg/mL, GM-CSF 1012.43±1166.11 pg/mL, TNF-α 236.98±359.88 pg/mL로 통계학적으로 유의하게 물리적 접촉이 가능한 경우 각종 화학매개물질의 생성이 증가되었다(p>0.05)(Fig. 4). 

고     찰

   진균에 대한 인체 반응은 개인의 유전적 요인, 감염 경로와 부위, 국소 면역반응과 침범한 진균의 종류 등에 의해 결정된다. Th1 림프구에 의한 세포매개면역반응의 탐식작용을 통해 진균에 대한 방어가 이루어지며, Th1 림프구의 역할이 약해지고 상대적으로 Th2 림프구의 역할이 강화되는 경우 진균성 감염이 발생하게 된다.⁹⁾ 진균 대사물질인 gliotoxin은 강력한 면역억제효과를 가지고 있어 T, B 림프구의 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제하고, 진균의 p43 면역억제단백물질이 직접적으로 질병을 유도하는 등 다양한 기전을 통해 인체 면역반응에 영향을 미치며, 진균의 세포 표면에 존재하는 integrin family와 보체 수용체들은 옵소닌 및 탐식작용에 관여한다.¹⁰⁾
   진균은 집먼지 진드기 다음으로 주된 항원으로 알레르기를 유발하며, 진균이 가지고 있는 다양한 항원성 물질들은 만성 부비동염, 알레르기성 비염, 기관지 천식의 발병과 만성화에 관여하고 있다. Aspergillus는 알레르기성 기관지폐 질환으로 오래전부터 많은 연구가 이루어져 왔고, Alternaria는 기관지 천식을 악화시키는 진균으로 알려져 있다.¹¹⁾ 만성 부비동염 환자의 경우 비즙에서 Alternaria, Penicillium, Cladosporium 등이, 알레르기성 진균성 부비동염 환자는 Bipolaris, Culvularia, Aspergillus 등의 진균이 배양되어 진균이 부비동염의 발병에도 관여하는 것으로 보고되었다.^12,13) 이에 본 연구에서는 호흡기에서 흔히 배양되는 Alternaria, Aspergillus, Candida, Cladosporium, Penicillium으로 상피세포의 활성화를 유도하였고 이 중 Alternaria에 의해서만 IL-6와 IL-8의 생성이 유의하게 증가하여 타 진균과 달리 Alternaria가 호흡기 상피세포의 활성화에 관여함을 알 수 있었다. 이는 비강 상피세포가 Alternaria 등 비강내에 존재하는 진균에 의해 활성화되어 IL-8, GM-CSF, RANTES 등의 화학매개물질을 유리하게 되고 이로 인해 국소 염증반응을 유지하며 악화된다는 기존의 보고와 유사한 소견이었다.¹⁴⁾ 진균의 항원성 물질과 단백질분해효소들은 직접 호흡상피세포의 탈피를 유도할 뿐 아니라 호흡상피세포의 수용체와 반응, 활성화를 유도하는데, Alternaria의 경우는 serine protease가 비강 상피세포의 활성화에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 본 연구에서도 Alternaria에 의해 하기도 상피세포의 사이토카인 생성이 증가되는 것으로 보아 진균의 단백질분해효소가 이 과정에 관여했을 것으로 추측할 수 있다.
   PBMCs는 림프구, 단핵구, 수상세포 등을 포함하는 인체 감염과 면역반응 등의 생리적 기능을 유지해 주는 중요한 세포들로 구성되어 있다. 지금까지 알레르기 및 감염성 염증반응의 연구에 PBMCs가 사용되어 왔으나 PBMCs는 다양한 면역세포로 구성되어 있어 면역반응 기전에 직접 관여하거나 활성화되는 세포가 무엇인지에 대한 논란이 지속되어왔다. 이에 본 연구에서는 PBMCs 뿐 아니라 PBMCs를 구성하는 CD4⁺ 림프구, NK 세포, 단핵구 등을 분리하여 실험을 시행함으로써 면역세포들의 상호 작용을 보다 정확히 알아보고자 하였다. 림프구는 인체면역 반응에 중요한 역할을 담당하고 있으며 large granular lymphocyte인 NK 세포와 small granular lymphocyte인 T와 B림프구로 구성되어 있다. 단핵구는 다양한 사이토카인과 성장인자, oxygen radical, 단백분해효소 등을 생성하여 염증반응을 조절하는 기능을 가지고 있다.^15,16) PBMCs에 포함된 면역세포들이 활성화되는 경우 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, INF-γ, TNF-α 등을 생성하게 된다. 본 연구에서는 상피세포와 CD4⁺ 림프구의 합동배양시 IL-4, IL-5, INF-γ를 측정하였고, 단핵구와 NK 세포는 IL-1β, IL-6, TNF-α, GM-CSF를 측정하였다. PBMCs의 경우 TNF-α는 Alternaria로 전처리한 상피세포와 합동배양한 경우 많이 생성되었으나 타 화학매개물질의 경우는 상피세포의 활성화를 유도한 군과 하지 않은 군 간에 차이를 보이지 않았다. 호흡상피세포에서 만들어지는 IL-6는 Alternaria 10, 25, 50, 100 μg/mL로 활성화를 유도한 경우 641.31±482.08 pg/mL, 780.04±691.46 pg/mL, 829.47±879.43 pg/mL, 939.44±934.36 pg/mL로 PBMCs와 상피세포를 합동배양하였을때 64,677.01±97,898.79 pg/mL, 56,724.72±86,301.92 pg/mL, 54,863.90±79,043.18 pg/mL, 61,396.08±96,159.46 pg/mL로 유의하게 생성이 증가되었다. 이는 진균으로 상피세포를 전처리한 경우 상피세포가 PBMCs와 상호작용하여 보다 활발하게 면역반응 혹은 염증반응에 관여하게 됨을 의미하는 것이다. 그러나 진균의 농도의 변화는 상피세포와 PBMCs 상호작용에 영향을 미치지는 않았다. 
   PBMCs를 0.4 μm의 구멍으로 이루어진 막으로 상피세포와의 물리적 접촉을 막은 경우 화학매개물질의 생성이 현저히 감소하였다. 이는 상피세포의 intercellualr adhesion molecule-1, LEEP-CAM 등의 접착분자를 통해 PBMCs와 물리적 접촉이 있을 때 화학매개물질이 생성되는 것으로 판단되며, 장내 상피세포의 경우 조직내 존재하는 T-림프구는 integrin인 α₄β₇을 발현하고 상피세포의 mucosal-addressin cell-adhesion molecule-1과 결합할 수 있다는 기존의 보고와 일치하는 결과이다.^7,17) 
   NK 세포는 바이러스감염, 종양 발생, 골수이식 등에서 나타나는 선천성 면역반응에 관여하며, NK 세포의 기능을 조절하는 촉진인자나 억제인자에 이상이 생기는 경우 자가면역질환이 발생하게 된다.¹⁸⁾ 호흡상피세포는 공기 중 존재하는 각종 화학물질, 항원, 병원균 등으로 인해 지속적인 자극을 받고 손상을 받게 된다. 이러한 손상된 세포들은 회복되거나 제거되어야 하며 이 과정에 NK 세포가 관여한다. 상피세포와 NK 세포의 수용체-배위자 상호작용에 대한 연구는 초기단계로 호흡상피세포의 경우 NKG2D 수용체에 결합하는 MHC class I chain related(MIC) molecule인 MICA, MICB 그리고 UL-16 binding protein(ULBP)의 발현이 증가되는 경우 NK 세포에 의해 상피세포의 탐식작용이 일어나는 것으로 알려져 있다.^19,20) 본 연구에서는 상피세포와 NK 및 non-NK 세포를 합동배양한 경우 NK 세포군에서 현저하게 많은 양의 화학매개물질이 생성되었으며, 광학현미경 검사에서 상피세포와 NK 세포의 물리적인 접촉을 확인할 수 있었다(data not shown).
   이상의 결과를 종합해 보면 진균, 특히 Alternaria에 의해 호흡상피세포인 BEAS-2B의 활성화가 이루어졌으며, 이들 상피세포와 말초혈액 면역세포와의 합동배양시 PBMCs는 TNF-α, NK 세포의 경우는 각종 화학매개물질의 생성이 유의하게 증가되었다. 상피세포와 PBMCs간에는 물리적 접촉을 통해 상호작용이 발생함을 알 수 있었다. 상피세포의 활성화를 유도한 진균의 농도는 말초혈액 면역세포와 상피세포의 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 이는 진균의 초회항원자극효과에 의한 결과이거나 혹은 진균이 상피세포의 접착분자 발현을 유도하여 각종 면역세포와 상호작용을 타나내는 것으로 추정할 수 있다. 

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