교신저자：유태현, 602-702 부산광역시 서구 암남동 34번지  고신대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론 

   바퀴는 많은 종이 세계적으로 널리 분포하며, 여러 가지 감염성 질환의 매개체가 될 뿐만 아니라 천식 등의 알레르기성 질환의 중요한 유발인자의 하나로 잘 알려져 있다.^1,2) 바퀴가 많이 서식하고 있는 지역에서는 아토피 환자의 20~55%, 천식 환자의 49~60%가 바퀴항원에 대해 과민반응을 보이는 것으로 밝혀지고 있다.³⁾ 우리나라에는 2과 8속 9종의 바퀴가 분포하는 것으로 기록되어 있으며, 그 중 바퀴(Blattella germanica), 이질바퀴(Periplaneta americana), 집바퀴(Blatta orientalis) 등이 옥내에서 흔히 발견되며 기관지 천식, 알레르기성 비염 등의 알레르겐으로 주목받고 있다. 이 가운데 바퀴는 분포범위가 가장 넓고 서식밀도가 높아 이들이 실내 환경을 오염시키는 정도는 심각한 것으로 알려지고 있다. 뿐만 아니라 여러 가지 살충제에 대한 저항력이 매우 크고 계절의 변화나 주거 형태 등에 무관하게 고루 분포함으로써 중요한 흡입 알레르겐으로 대두되고 있다.⁴⁾
   가장 흔한 흡입 알레르겐으로 알려진 집먼지 진드기 알레르겐 가운데 Der p 3, Der p 6, Der p 9 등은 각각 트립신, 키모트립신 및 세린계 단백분해효소이며, 이외에도 집먼지 진드기 제3군(group III)과 제6군과는 면역화학적 성상을 달리하는 3종의 세린계 단백분해효소가 더 존재하는 것으로 밝혀졌다.⁵⁾ 집먼지진드기의 일종인 주름먼지진드기(Euroglyphus maynei) 제3군 알레르겐도 세린계 단백분해효소로 보고되어 있으며, 지연형 과민반응을 유발하는 것으로 알려진 Trichophyton antigen(Tri r 2)도 세린계 단백분해효소와 여러 면에서 높은 상등성을 보이고 있다.⁶⁾ 최근에는 바퀴에서 분리된 단백분해효소의 특징을 보이는 물질이 폐섬유아세포에서 PAR-2(protein-activated receptor 2) 의존성으로 칼슘 이동 및 ERK 인산화를 유도하는 것이 확인되어 바퀴의 세린계 단백분해효소가 알레르겐으로써의 가능성뿐만 아니라 PAR-2 활성제로써의 역할도 제기되고 있다.^7,8) PAR-2는 G 단백 연관수용체(G-protein coupled receptor)로써 트립신과 같은 세린계 단백분해효소에 의해 활성화될 수 있다. 본 실험에서는 바퀴에서 발현되는 세린계 단백분해효소 유전자들을 확인하기 위하여 성충을 대상으로 cDNA library에서 얻은 클론들의 염기서열을 분석하여 세린계 단백분해효소 유전자를 선별하고 이들을 곤충류 세린계 단백분해효소 및 집먼지진드기의 세린계 알레르겐과 유전자 서열을 비교하여 알레르겐으로서의 가능성을 추정하여 보고자 하였다.

재료 및 방법

바퀴의 사육
   바퀴 사육용으로 특수하게 제작한 유리통 속에 격자모양의 골판지를 깔아 숨을 곳을 마련하고 24℃ 배양기 내에서 물과 마우스용 사료를 자유롭게 먹도록 하며 사육하였다. 사육된 바퀴 중 성충을 모아서 실험에 사용하였다.

cDNA library의 제작
   Uni-ZAP^TM XR expression vector(Stratagene, California, USA)를 이용하여 바퀴의 cDNA library를 만들었다. 즉, 바퀴의 소화기 5 gm에서 total RNA를 분리한 다음 Stratagene Poly(A⁺) Quick mRNA Isolation Kit(Stratagene, California, USA)을 사용하여 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성에 사용하였다.

세린계 단백분해효소 유전자의 PCR 증폭 및 DNA 분리
   제작된 cDNA library와 degenerate oligonucleotide sequences 및 87, 88 primer(Table 1)를 사용하여 Takara PCR kit(TaKaRa, Shuzo, co., LTD)으로 PCR을 시행하였다(95℃ 1 min, 42℃ 1 min, 72℃ 3 min 30 cycle, 72℃ 7 min extension). 1% agarose 겔에 전기영동하여 얻은 PCR 산물을 Jet-sorb gel extraction Kit(Genomed St. Louis, USA)을 사용하여 DNA를 추출하였다.

묶기(Ligation) 및 형질전환(Transformation)
   PCR product를 pGEX T-easy vector(Clonetec, USA)에 묶은(ligation) 다음 c-cell(JM109 및 DH5-a)과 반응시킨 후 X-gel과 IPTG가 첨가된 AP-plate에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양하여 흰색 집락(white colony)을 확인하였다.

플라스미드 분리
   흰색 집락을 5 ml의 LB 배지(ampicillin 포함) 튜브에 넣고 37℃에서 15시간 배양한 다음 DNA purification kit (Wizard plus sv minipreps, Promega, USA)을 사용하여 플라스미드를 분리하였다.

염기서열 분석 및 유사성 검색
   분리된 플라스미드를 EcoR I, Xho I으로 처리하여 크기를 확인한 후 염기서열을 분석하였다(DNA sequencing service, Macrogen, Korea). 염기서열이 밝혀진 클론들은 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)을 사용하여 핵산과 아미노산서열을 비교함으로써 유전자의 특성을 알아보았다. 핵산의 염기서열 비교에 사용된 데이타베이스는 GenBank, GenBank updates, EMBL, EMBL updates, Database of Japan(DBJ)를 사용하였고, 아미노산서열 비교에는 Swissprot(SP), GenPept, GenPept updates, Protein database(PDB), Protein Information Resources(PIR) 등의 데이타베이스를 사용하여 기존에 알려진 유전자 및 단백질들과의 유사성을 검색하였다.

Northern blot 분석
   cDNA library를 만들 때 사용하였던 것과 동일한 방법으로 Total RNA를 분리하여 1% agarose 겔(denaturated, 6.7% formaldehyde)에 전기영동한 후 Hybond-N⁺ nylon membrane(Amersham Pharmacia Biotech.)에 이적하였다. 염기서열 분석으로 세린계 단백분해효소로 밝혀진 클론들을 대상으로 Random Primed DNA labelling Kit(Boehringer, Mannheim, Germany)을 사용하여 탐침자를 제작하고 일반적인 Northern hybridization 방법에 따라 실험을 진행하였다.

Southern blot 분석
   Northern blot으로 발현된 클론들을 대상으로 Southern blot을 수행하였다. 10 g의 바퀴 소화기로부터 분리한 10 μg의 genomic DNA를 EcoR I, Xho I 및 Hind III 5 unit로 소화시킨 후 0.8% agarose 겔에 전개하고 Hybond-N⁺ nylon membrane(Amersham, Pharmacia Biotech.)로 이적한 후 [³²P] labeled-cDNA probe(Random Primed DNA labelling Kit, Boehringer, Mannheim, Germany)로 혼성화(hybridization)하였다.

결     과

DNA 염기서열 분석
   클론 Bg3, Bg5 및 Bg6의 DNA 염기서열을 분석하여 얻은 아미노산서열은 Swissprot 등을 이용한 유사성 검색에서 절지동물의 트립신 계열의 세린계 단백분해효소와 높은 상동성을 보였다(Accession No. AAZ78212 trypsin, Blattella germanica；AAX33734 MPA3 allergen, Periplaneta americana；Accession No. AAM96942 trypsin 3, Phlebotomus papatasi；Accession No. ABC88732 putative trypsin-like proteinase, Tenebrio molitor). 
   세 유전자 상호간의 상동성은 DNA level에서 42~100% 였다. 그 중 유전자 Bg3과 Bg5는 부분별로 77~99%, Bg3 과 Bg6은 90~100%, Bg5와 Bg6은 83~100%의 상동성을 보였다.
   Bg3 유전자는 396 bp 및 131 아미노산서열로 구성되어 있었다(Fig. 1). 고양이벼룩(Ctenocephalides felis, trypsin-like serine protease Accession No. AF053921), 초파리(Drosophila melanogaster serine protease Accession No. AA264426 and AA201347), 갬비아모기(Anopheles gambiae serine protease Accession No. AAD38 334 and AAB62929), 검정파리(Lucilia cuprina, chymotrypsinogen Accession No. U03760) 등의 세린계 단백분해효소 아미노산서열과 다중정렬(multiple alignment)을 시행한 결과, 각각 43%, 54%, 49%, 41%의 상동성을 나타내었다.
   클론 Bg5의 DNA 및 아미노산서열은 Fig. 2에 나타난 바와 같이 513 bp, 170 아미노산으로 구성되어 있었다. 이 클론의 아미노산서열을 고양이벼룩, 초파리, 갬비아모기, 검정파리 등의 세린계 단백분해효소 아미노산서열과 37~44%의 상동성을 보였다. 클론 Bg5의 바퀴 알레르겐으로서의 가능성을 알아보기 위해 아미노산서열을 집먼지진드기 세 종 즉, 큰다리먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus), 세로무늬먼지진드기(D. farinae), 및 주름먼지진드기의 세린계 단백분해효소의 아미노산서열과 다중정렬을 시행한 결과, 큰다리먼지진드기가 41%, 세로무늬먼지진드기가 36%, 주름먼지진드기가 35%의 상동성을 보였다(Fig. 2).
   클론 Bg6는 410 bp, 136개의 아미노산으로 구성되어 있었으며, 곤충류의 세린계 단백분해효소(38~39%) 및 알레르겐과도 34~37%의 상동성을 보였다(Fig. 3).

Northern blot 분석
   클론 Bg5와 Bg6를 대상으로 Northern blot을 시행하였다(Fig. 4). 바퀴의 소화기로부터 total RNA를 분리한 후, formaldehyde 겔에서 전기영동하고, 나일론 막(nylon membrane)으로 이적하였다. 두 클론의 플라스미드 DNA로부터 삽입체를 분리한 다음, random primed DNA labelling kit을 사용하여 탐침자를 제작하였다. 이 탐침자를 total RNA를 이적한 막에 혼성화시킨 결과 전사체의 크기는 각각 0.7 kb로 확인되었다.

Southern blot 분석
   바퀴의 소화관에서 genomic DNA를 분리하여 EcoR I, Xho I 및 Hind III로 소화시킨 후, 막에 이적시킨 다음 클론 Bg5의 cDNA를 탐침자로 사용하여 혼성화한 결과, 유전체내에서 multicopy로 존재함을 확인할 수 있었다(Fig. 5).

바퀴 세린계 단백분해효소 유전자의 계통학적 분석
   바퀴에서 찾은 세린계 단백분해효소의 유전자와 다중정렬에 사용한 3종의 집먼지 진드기 및 10종의 곤충류 세린계 단백분해효소의 아미노산 서열과의 계통학적 관계를 알아보기 위하여 ExPASy web site(http://www.expasy.org) 상의 Clustal W(ver. 1.83)를 이용하여 rooted tree를 작성하였다(Fig. 6). 이번 실험에서 확인된 Bg3, Bg5 및 Bg6 유전자는 큰다리먼지진드기 group III 알레르겐과는 매우 높은 유전적 상관관계를 형성하고 있었다.

고     찰

   바퀴에 의한 알레르기 질환의 질병 양상을 파악하고 치료효과를 높이기 위해서는 바퀴 알레르겐에 관한 연구가 우선되어야 할 것이다. 알레르겐은 많은 종이 알려져 있으나 세계적으로 가장 흔한 집먼지진드기에서는 세린계 단백분해효소들이 중요한 흡입 알레르겐의 일군으로 작용한다는 것은 잘 알려진 일이다. 최근 바퀴류에서도 세린계 단백분해효소가 알레르겐으로 작용할 가능성이 높은 것으로 보고되고 있어 바퀴에서의 세린계 단백분해효소군의 유전자 확인 및 클로닝, 나아가 알레르겐으로서의 가능성을 유전자 염기서열 및 아미노산서열상의 상동성으로 추정해보고자 하였다.
   바퀴의 장에서 분리한 mRNA로부터 cDNA library를 제작한 다음 이를 주형으로 세린계 단백분해효소의 활성부위를 근거로 제작한 degenerate oligonucleotide primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. 시동체의 조합에 따라 많은 종류의 밴드를 겔상에서 확인할 수 있었는데 이는 소화, 발생, 혈액응고, 수정, 면역반응 등 여러 가지 기능을 담당하는 세린계 단백분해효소의 특성상 의미 있는 결과로 생각된다.^9,10,11,12) 이 가운데 3개의 클론 Bg3, Bg5 및 Bg6는 BLAST search 결과 여러 종의 곤충류에 세린계 단백분해효소와 높은 상동성을 보였으며, 세 클론들 상호 간의 상동성은 염기서열 수준에서 구간별로 42~100%였다. 그 중 클론 Bg3과 Bg5는 각 구간별로 77~99%, Bg3과 Bg6은 90~100%, Bg5와 Bg6은 83~100%의 상동성을 보였다. 세린계 단백분해효소군의 이러한 높은 상동성은 유전자 중복과 돌연변이의 결과로 해석되고 있다.¹³⁾ 클론 Bg5 및 Bg6은 활성부위인 AAHC가 잘 보존되어 있었으나 클론 Bg3은 AAHC가 PEHA로 변형되어 있었으며, Bg5와 Bg6은 Northern blot 상에서 크기가 각각 0.7 kb 정도인 것으로 나타났다.¹⁴⁾ 검정파리의 경우, 트립신 유사 세린계 단백분해효소 유전자는 4개의 유사한 그룹(homologous member)으로 구성되어 있으며, 같은 방향으로 전사된다.¹⁵⁾ 바퀴의 세린계 단백분해효소 유전자군에 대한 정보는 알려진 바 없으나, 유사한 구성으로 이루어져 있을 가능성은 매우 높다. 이는 유전자 Bg5가 Southern blot 분석에서 복수로 존재하는 유전자(multicopy gene)로 나타난 것과도 잘 일치하고 있다.
   클론 Bg3은 396 bp의 DNA와 131개의 아미노산으로 구성되어 있었다. 이 클론의 아미노산서열은 고양이벼룩을 비롯한 여러 종의 곤충류 세린계 단백분해효소와는 높은 상동성(41~54%)을 보였으나,^16,17,18,19) 알레르겐으로 작용하는 큰다리먼지진드기, 세로무늬먼지진드기, 주름먼지진드기와는 22~15% 정도의 낮은 상동성을 보여 바퀴의 장에서 소화작용에 관여할 가능성이 보다 높을 것으로 추정되었다.^20,21)
   클론 Bg5는 513 bp의 핵산 및 170개의 아미노산으로 구성되어 있었다. 유전자 Bg5의 아미노산서열은 집먼지 진드기 3종의 세린계 group III 알레르겐의 아미노산서열과 큰다리먼지진드기 41%, 세로무늬먼지진드기 36%, 주름먼지진드기 35%의 상동성을 보여, 이번 실험에서 밝혀진 세 클론 가운데 염기서열상으로는 알레르겐으로써의 가능성이 가장 높아보였다. 클론 Bg6는 410 bp의 염기 및 136개의 아미노산으로 구성되어 있었다. 이 클론의 아미노산서열은 Bg5와는 달리 주름먼지진드기 제3군 알레르겐의 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 나타내었다.
   클론 Bg3, Bg5, Bg6의 아미노산서열과 초파리를 비롯한 10종의 곤충류 및 집먼지진드기 세린계 단백분해효소의 아미노산서열을 대상으로 계통학적 관계를 살펴보면, 바퀴에서 밝혀진 3종의 유전자 단편들은 큰다리먼지진드기에서 발현되는 group III 알레르겐과 매우 높은 연관 관계를 보이고 있다. 최근 알레르기 반응에 관여하는 PAR-2 수용체의 역할에 대한 연구가 증가하고 있다. 세린계 단백분해효소 계열의 집먼지진드기 알레르겐이 폐상피세포의 PAR-2 활성제로 작용하여 염증성 사이토카인의 분비를 유도할 뿐만 아니라 PAR-2에 직접 작용하여 전형적인 알레르기 반응과는 다른 방법으로 기관지 상피세포를 자극하는 것으로 알려지고 있다.^22,23,24) 바퀴의 세린계 가수분해효소들도 직접적인 알레르겐으로서 뿐만 아니라 PAR-2 활성제로 작용하여 천식과 같은 알레르기성 질환의 개시 및 진행에 관여할 가능성이 매우 높아 보인다. 그러므로 본 실험에서 확인된 세 유전자들에 대하여 알레르겐으로서의 가능성뿐만 아니라 이들 단백분해효소들의 알레르기 반응에 대한 두 가지 역할(알레르겐 및 PAR-2 활성제)에 관해서 보다 상세한 연구가 뒤따라야 할 것으로 여겨진다.

결     론

   바퀴의 소화관에서 분리한 mRNA로 cDNA library를 만들어 이를 주형으로 하고, degenerate oligonucleotide primer를 사용하여 PCR을 시행하여 세 종의 세린계 단백분해효소 Bg3, Bg5 및 Bg6 유전자를 확인하였다. 여러 종의 곤충류 세린계 단백분해효소 유전자들과 집먼지진드기 제3군 알레르겐들과의 계통학적 분석에서도 큰다리먼지진드기 유전자와 상당한 유전적 근연관계를 보이므로 이들 단백분해효소들의 역할에 관해서는 알레르겐으로써의 기능뿐만 아니라 PAR-2 활성제로서의 가능성에 대해서도 확인할 필요가 있을 것으로 사료된다.

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