교신저자：박용호, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 280-7697 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：parkyh@cnu.ac.kr

서     론

   감각신경성 난청은 유전질환, 감염, 이독성 약물, 소음 등의 여러 가지 원인에 의해서 발생할 수 있다. 그 중 소음은 문명사회에서 감각신경성 난청의 중요한 원인이며, 과도한 소음에 노출될 경우 Corti기 유모세포의 손상을 초래할 수 있다. 소음에 의한 유모세포의 손상은 직접적인 기계적 영향 및 와우의 혈액량 감소에 따른 대사의 변화가 원인으로 생각되고 있는데 최근 소음노출 후 와우의 혈액량이 감소할 경우 내이에서는 vascular endothelial growth factor 등이 증가하여 혈액공급의 항상성을 유지하려 한다는 보고가 있다.¹⁾
   이와 유사하게 최근 내이에는 erythropoietin(EPO)과 erhtyopoietin receptor(EPO-R)가 존재하고 내이의 항상성 유지에 역할을 할 것이라고 생각되고 있다.²⁾ EPO는 태생기의 간이나 성인의 신장에서 분비되는 호르몬으로 EPO-R에 결합하면서 적혈구 전구세포의 성장, 증식 및 분화를 증진시키고 세포자연사를 억제하는 것으로 알려져 있다.³⁾ 또한 EPO는 중추신경계, 망막, 위장관, 폐, 심장 및 신장 등에도 존재하여 적혈구 생성 이외에도 향신경 및 신경보호 작용, 세포내 괴사를 억제하는 요소 분비, 염증 반응의 억제, 항산화 작용 및 산화질소와 연관된 독성 해독 등의 다양한 기능을 하는 것으로 생각되고 있다.^4,5,6,7,8) 
   본 연구에서는 소음에 의해 유발된 와우 손상의 동물모델의 내이에서 EPO와 EPO-R의 발현 양상을 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물과 소음의 노출

실험동물
   실험동물은 이경 검사에서 정상고막을 가지고 있고 Preyer's reflex가 양성인 체중이 300~350 g 정도의 수컷 Hartley albino 기니픽 24마리를 사용하였다. 방음 처리된 박스형으로 만들어진 100×80×60 cm의 동물우리 속에 기니픽을 넣고 120 dB SPL, 125 Hz~12 kHz의 광대역 소음에 1시간 노출시켰다. 소음원은 Goldwave(ver 5.09, Goldwave Inc.) 프로그램을 이용하여 증폭기와 두 개의 스피커를 연결하여 사용하였다.

실험군의 분류
   실험군은 소음에 노출되지 않은 대조군(Group A) 4마리와 20마리의 소음 노출군으로 분류하였다. 소음 노출군은 각각 소음 노출 1시간 후에 희생한 군(Group B) 10마리, 소음 노출 7일 후에 희생한 군(Group C) 10마리로 분류하였다. 

청성뇌간반응의 측정
   청성뇌간반응의 측정을 위해 실험동물은 xylazine(10 mg/kg)와 ketamine(40 mg/kg)의 혼합액으로 근육마취를 시행하고 직장체온은 37℃ 이상, 심박동수는 210~270회/분으로 유지하였으며 방음실에서 ICS사의 MCU-80을 사용하여 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 삽입형 ear tip(3.5 mm, Nicolet Biomedical, Inc.)을 외이도에 위치시키고 전극은 활동전극을 두정부에, 기준전극은 측정할 귀의 후외부에, 접지전극은 반대측 귀의 후외부에 위치하였다. 자극음은 100 μs의 click과 15 ms의 tone burst로 주었으며, 청성뇌간반응의 측정은 파형을 얻기 위하여 1024tone presentation을 평균하였고 click, 2, 4, 8 kHz에서 역치를 측정하였다. 역치의 근방에서 음의 강도는 5 dB 간격으로 측정하였으며 청성뇌간반응의 역치는 제5파형이 나타나는 최소의 자극강도로 정의하였다. 모든 실험군에서 소음 노출 전에 청성뇌간반응을 측정하여 기준점으로 정하였다. Group B는 소음 노출 1시간 후에 청성뇌간반응을 측정하였고, Group C는 소음 노출 1시간 후와 7일 후에 청성뇌간반응을 측정하였다.

조직학적 관찰

조직의 준비
   실험군과 대조군에서 각각 동물의 측두골을 채취하여 해부현미경하에서 와우의 첨부와 등골을 제거하고 pH 7.4의 3% paraformaldehyde 0.1 M PBS로 12시간 동안 와우내 고정하였다. Phalloidin 염색을 위해 채취된 와우는 해부현미경하에서 기저부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner 막, 개막의 순서로 제거하여 와우 첨부로부터 기저부까지 전체의 Corti기를 분리하였다. EPO 및 EPO-R의 면역형광염색을 위해 채취된 와우는 pH 7.4의 3% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 실온에서 12시간 동안 고정한 후 hydrochloric acid와 EDTA(Calci-Clear Rapid, National diagnostics^TM, Georgia, USA)를 이용하여 1주일간 탈회하였으며 파라핀에 포매한 다음 8 μm 두께로 절편을 만들었다. 

유모세포의 손상여부확인
   손상된 유모세포를 확인하기 위하여 분리된 조직은 pH 7.4 phosphated buffered solution으로 세척하고 0.3% Triton-X로 처리한 뒤 tetramethyl-rhodamine isothiocyanate(TRITC)로 표지된 phalloidin(1：50；sigma, St. Louis, MO)으로 30분간 반응시킨 후 다시 PBS로 세척하고 수용성 마운트로 포매하여 형광현미경(BX51TRF, Olympus, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다. 

EPO 및 EPO-R의 면역형광염색 
   준비된 슬라이드를 xylene으로 탈파라핀화한 후 에탄올의 농도를 낮추기 위해서 재수분화하였다. 10분간 TBS에서 세정 후 H₂O₂ 3%에서 5분간 endogenous peroxidase를 억제한 후 PBS로 다시 세정하였다. Sodium-azide BSA를 농도가 1%가 되게 PBS에 혼합한 뒤 절편과 함께 10분간 pre-incubation을 시행했다. 일차항체인 rabbit anti-EPO-R IgG(M20, sc-697, Lott #G1403)와 rabbit anti-EPO IgG(H-162, sc-7956, Lott #D0803, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 sodium-azide BSA와 PBS가 섞인 용액에 각각 1：500과 1：200으로 희석하여 30분간 반응시켰다. 반응 후 PBS에 세정하고, 이차항체(fluorescence conjugated sheep anti-rabbit secondary antibody, Chemicon, Temecula, USA)에 20분간 반응시켰다. PBS에 5분간 세정한 뒤 수용성 마운트로 포매하여 형광현미경(BX51TRF, Olympus, Tokyo, Japan)에서 관찰하였다.
   EPO의 음성대조를 위하여 절편을 일차항체 대신 TBS/BSA와 Anti-CD3 항체(A0452, DAKO, Copenhagen, Denmark)로 반응시키고 동일한 방법으로 염색을 시행하였다. 
   EPO-R의 음성대조를 위하여 EPO-R 일차항체를 specific blocking peptide(M20-P, sc-697-P, Lott#G1403, Santa cruz Biotechnology, CA, USA)에 24시간 동안 반응시켜 일차항체를 흡수시킨 뒤 동일한 방법으로 염색을 시행하였다.

통계학적 검증
   통계학적 검증은 SPSS for window version 12.0(SPSS Inc., Chicago, Ill)을 이용하였다. 청성뇌간반응의 역치변화를 소음 노출 전, 소음 노출 1시간 후와 1주일 후에 비교하였다. 실험군의 소음 노출 전과 소음 노출 후의 청성뇌간반응의 역치변화는 One way ANOVA를 이용하여 p<0.05를 통계학적으로 의미 있다고 하였다.

결     과

청성뇌간반응의 역치변화
   실험동물 각각의 소음 노출 전 기준점 청력은 유사하였다. 소음 노출군인 Group B와 Group C는 각각 소음 노출 전과 소음 노출 1시간 후에 청성뇌간반응을 측정하였으며, Group C는 소음노출 1주일 후에 다시 청성뇌간반응을 측정하였다. 
   소음 노출 1시간 후에 측정한 Group B와 Group C의 청성뇌간반응의 역치변화는 기준점에 비하여 Click, 2 kHz, 4 kHz 및 8 kHz에서 각각 17.2±6.2, 22.5±8.1, 31.1±8.3 그리고 40.8±6.9 dB SPL였다. 소음 노출 1주일 후에 측정한 Group C의 청성뇌간반응의 역치변화는 기준점에 비하여 Click, 2 kHz, 4 kHz 및 8 kHz에서 각각 1.3±2.31, 1.88±0, 3.1±2.58 그리고 3.1±3.7 dB SPL이었다(Fig. 1).

유모세포의 손상확인
   유모세포의 손상을 확인하기 위하여 시행한 phalloidin 염색에서 소음 노출 1주일 후에 희생한 Group C에서 와우의 기저부에서 미약한 유모세포의 손상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2). 

EPO와 EOP-R의 면역형광염색
   EPO는 나선신경절세포에서 대조군, 소음노출군인 Group B, Group C 모두 발현되었다(Fig. 3).
   EPO-R은 나선신경절세포의 대조군에서는 발현이 되지 않았고 소음 노출군인 Group B, Group C에서는 발현되었다(Fig. 4). 소음 노출에 따른 EPO와 EPO-R의 발현양상은 소음 노출 1시간 후와 1주일 후에는 정상 대조군에 비하여 증가하는 양상을 보였으며 소음 노출 1주일 후에는 소음 노출 1시간 후에 비하여 발현의 정도가 약간 감소하는 양상을 보였다.

고     찰

   소음성 난청의 기전에 대하여는 많은 연구가 이루어지고 있는데 과도한 소음에 노출되면 Corti기 전반에 걸쳐 유모세포의 세포사가 관찰되고 그 기전은 Corti기의 직접적인 기계적 외상과 내이 산화 대사의 증가를 통한 대사성 피로로 알려져 있다. 그 중 내이내 대사변화는 와우내 이온통로의 형태학적 파괴, 신경연접부의 피로, 혈관조나 유모세포의 대사성 피로 및 와우 혈액량의 변화 등으로 생각된다.⁹⁾ 와우내 이온통로의 기능 저하는 소음에 의한 대사 변화와 이로 인해 생기는 산화질소로 인해 발생할 수도 있는데 와우 기능을 유지하는데 중요한 기능을 하는 아데노신 삼인산 분해 나트륨-칼륨 이온 교환 채널(Na⁺, K⁺-ATPase exchange channel)은 산화 질소의 농도가 낮을 때 활성화가 된다. 즉 소음에 의해 산화 질소가 증가하면 아데노신 삼인산 분해 나트륨이온-칼륨이온 교환 채널은 억제되며 이는 내이에서 나트륨이온과 칼륨이온의 능동적 수송 장애를 초래한다.¹⁰⁾ 
   혈관조나 유모세포의 대사성 피로는 와우 혈액량 변화로 설명할 수 있다. 소음에 노출되면 기저막, 나선인대 및 혈관조 등에서 혈관의 수축, 투과성 증가 등이 일어나고 이는 와우 혈액순환의 국소적 정체를 야기한다. 이는 와우의 저산소증, 허혈 및 산성화를 야기시킨다.^9,11) 이러한 와우의 상태는 산화질소, 자유라디칼 등을 발생시켜 조직의 손상을 더욱 가속화시킨다.^9,11,12,13) EPO는 주로 신장에서 생성되어 적혈구생성에 중요한 역할을 수행한다.³⁾ 또한 적혈구생성 이외에도 최근 연구에서는 EPO가 중추신경계와 각막에서 허혈에 의한 세포자멸사를 억제하는 등 향신경성 작용 및 신경보호 기능을 한다고 밝혀졌으며, EPO는 산화 질소를 통한 손상, 산성화 방지, 혈관 이완 및 혈관신생성을 촉진시키는 것으로 보고되었다.^4,5,6)
   최근 내이내에서 EPO, EPO-R의 발현이 관찰되었는데 정상 기니픽 내이에서 EPO-R은 Corti기의 지지세포뿐만 아니라 수지세포, 내구세포에서 발현되고 또한 나선인대의 섬유세포, 혈관조의 중간세포, 내피세포에서도 발현되나 EPO는 주로 나선신경절에서 발현되었다.²⁾ 다른 문헌보고에 따르면 신생 백서에서는 EPO mRNA는 Corti기, 나선신경절 신경원과 혈관조에서도 관찰되었다는 보고도 있어서 EPO를 투여함으로써 내이 내의 국소적인 효과를 기대할 수도 있다고 하였다.¹⁴⁾ 
   EPO, EPO-R은 인간의 뇌에서 수정 5주 후부터 발현되고, 성장 및 발달함에 따라 분포가 바뀌어 특별한 뇌조직에서 관찰된다.¹⁵⁾ EPO가 대뇌의 성상세포에서 생성되어 주변 신경원의 EPO-R에 결합하는 것을 고려했을 때 내이에서 분비되는 EPO는 신장에서 분비되는 내분비계의 EPO와는 독립적으로, 국소적인 측분비계로서 내이에서 기능을 수행하는 것으로 생각된다. 뇌-혈액 장벽이 신장에서 분비되는 EPO의 뇌내로의 순환을 억제한다는 점,⁶⁾ in vitro의 실험에서 신장에서 분비되는 EPO보다 뇌에서 분비되는 EPO가 크기가 더 작으며 보다 활성화되어 있다는 점,¹⁶⁾ 혈액-외림프 장벽이 전신에 순환하는 EPO가 내이로 들어오는 것을 막을 수 있는 점 등이 위 가설을 뒷받침한다.
   본 연구에서도 이전 문헌보고와 같이 EPO의 발현은 주로 나선신경절에서 관찰되었다. EPO-R은 와우내에서 주로 유모세포 주변의 지절골세포(phalangeal cell)와 내구세포 그리고 Corti기의 지지세포에서 주로 발현되며 나선신경절에는 거의 발현되지 않는 것으로 알려져 있는데²⁾ 본 연구에서도 EPO-R의 발현은 정상 대조군에서 나선신경절세포에 발현되지 않았으나 소음 노출 1시간 후, 소음 노출 1주일 후에는 나선신경절에서 발현되었다. 소음 노출에 따른 EPO와 EPO-R의 발현양상은 소음 노출 1시간 후와 1주일 후에는 정상 대조군에 비하여 증가하는 양상을 보였으며 소음 노출 1주일 후에는 발현의 정도가 약간 감소하는 양상이었으나 그 증감을 정량적으로 분석하지는 못하였다. 또한 청성뇌간반응의 역치변화에 따른 EPO와 EPO-R의 발현양상은 소음 노출 직후에 청성뇌간반응의 역치가 증가함에 따라 그 발현의 정도가 증가하였으나 역치가 회복된 1주일 후에도 그 발현의 정도는 정상에 비하여 증가되어 있는 양상을 보였다. 나선신경절 이외에도 와우의 측벽과 코티기에서도 발현양상의 변화를 관찰하였으나 그 변화가 미미하여 결과분석에는 사용하지 않았다.
   이상의 결과는 소음에 의한 와우내 대사변화와 EPO 및 EPO-R의 발현이 어떠한 관계가 있음을 추측하게 한다. 하지만 발현의 정도를 정량적으로 분석하지 못하여 각 군간의 EPO와 EPO-R의 발현에 대한 시간대별 정량적 분석이 필요할 것으로 생각된다. 또한 최근의 문헌에서 EPO의 투여가 와우내 혈류량을 변화시켜 소음에 의한 와우손상을 가중시킨다는 보고도 있어¹⁷⁾ 이러한 발현양상이 어떠한 역할을 하는 것인지는 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.

결     론

   저자들은 소음 노출 전과 소음 노출 후 나선신경절에서 EPO와 EPO-R의 발현변화를 비교하고자 하였다. EPO는 나선신경절세포에서 소음 노출 후 발현이 증가되었고, 소음 노출 1시간 후가 소음 노출 1주일 후보다 발현이 증가되었다. EPO-R은 나선신경절세포의 정상군에서는 발현되지 않았으나 소음 노출 후 발현되었다. 위 결과로 볼 때 소음 노출 후 내이에서 EPO와 EPO-R의 발현이 내이의 항상성에 어떠한 관계가 있지 않을까 생각한다.

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