교신저자：박용호, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 280-7697 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：parkyh@cnu.ac.kr

서     론

   두경부 및 비뇨생식기계 종양의 항암제로 널리 쓰이는 cisplatin은 단독 또는 병용요법으로 투여되어 환자들의 생존율의 증가를 가져왔으며, 특히 난소암과 대장암의 경우는 고용량의 cisplatin이 저용량으로 투여할 경우보다 항암 효과가 우수한 것으로 알려져 있다.^1,2) 그러나 투여 용량이 증가할수록 cisplatin에 의한 이독성, 신독성, 골수억제, 말초신경병증 등의 일시적 또는 영구적 부작용의 발생이 증가하여 항암 치료를 위한 투여 용량에 제한을 받고 있다. 
   이러한 이유로 cisplatin의 부작용을 줄이기 위한 연구들로 mannitol,³⁾ furosemide,⁴⁾ hypertonic saline,⁵⁾ sodium thiosulfate⁶⁾ 등의 약물들을 병용 투여하는 연구들이 진행되고 있다. 그 중 최근 Fenoglio 등⁷⁾은 국소 마취 용제인 procaine hydrochloride를 이용하여 고용량으로 투여된 cisplatin에 의한 신독성을 줄일 수 있음을 발표하였으며, Viale 등⁸⁾은 procaine hydrochloride를 cisplatin과 같이 투여하여 마우스에서 항암 효과를 증가시킬 수 있음을 발표한 바 있다. 
   저자들은 cisplatin으로 유도된 이독성의 실험동물 모델에서 procaine hydrochloride의 예방적 효과에 대해 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험군의 분류 및 약물투여
   이경 검사에서 정상 고막을 가지고 있고 정상 이개 반사를 보이는 체중 350~400 gm의 Dunkin-Hartley albino 기니픽 20마리를 대상으로 실험하였다. 실험군은 각각 5마리씩 정상 대조군(group 1), cisplatin(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 2 mg/ml 농도로 생리 식염수에 용해하여 kg당 14 mg을 복강 내 투여한 군(group 2), cisplatin 투여 30분 전에 kg당 50 mg의 procaine hydrochloride(Sigma, St. Louis, USA)를 증류수에 용해하여 복강 내 투여한 군(group 3), procaine hydrochloride만 투여한 군(group 4)으로 나누었다. Group 1에서는 cisplatin 투여군과 동량의 생리 식염수를, group 4에서는 동량의 procaine hydrochloride만을 투여하였다. 

청성뇌간반응검사
   실험동물은 xylazine(10 mg/kg)과 ketamine(40 mg/kg) 혼합액의 복강 내 투여로 마취하고 방음실에서 청성뇌간반응검사기(MCU-80, ICS medical corporation, Il)를 이용하여 클릭음, 2 kHz, 4 kHz 그리고 8 kHz tone pips의 자극음에서 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 삽입형 ear tip(3.5 mm, Nicolet Biomedical, Inc.)을 외이도에 위치시킨 후 전극을 두정부와 양측 유양 돌기 부위의 피부에 위치시켰다. 자극음은 100 μs의 click과 1 ms의 rise- fall time을 갖는 15 ms의 tone burst를 21.1/s로 주었으며, 청성뇌간반응의 측정은 1,024 tone presentation을 평균하였고 2, 4, 8 kHz에서 역치를 측정하였다. 역치근방에서 음의강도는 5 dB간격으로 측정하였으며 청력 역치는 제 5 파형이 나타나는 최소 자극 강도로 정하였다. 모든 군에서 각각 약물 투여 전, 투여 5일 그리고 10일 후 청성뇌간반응을 측정하여 역치변화를 관찰하였다. 

조직학적 관찰

조직의 준비
   실험동물은 약물투여 10일 후에 ketamine과 xylazine으로 깊게 마취하고 양측 측두골을 채취하였다. 해부 현미경 하에서 와우의 첨부 일부와 등골을 제거하고 pH 7.4의 3% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 12시간 동안 와우 내 고정하였다.
   Phalloidin 염색을 위해 채취된 와우는 해부 현미경 하에기저부에서 첨단부까지 골와우각, 혈관조, Reissner 막, 개막의 순서로 제거한 후 와우 기저부부터 첨부까지 전체의 코르티기를 분리하였다.
   면역조직화학염색을 위해 채취된 와우는 pH 7.4의 3% paraformaldehyde in 0.1 M PBS로 실온에서 12시간 동안 고정 후 hydrochloric acid와 EDTA(Calci-Clear Rapid, National diagnostics^TM, Georgia, USA)를 이용하여 약 1주일간 탈회하였으며, 파라핀에 포매한 다음 8 μm 두께로 절편을 제작하였다.

유모세포의 손상확인
   손상된 유모세포를 확인하기 위한 phalloidin 염색을 위해 분리된 코르티 기관을 pH 7.4 phosphated buffered solution으로 세척하고 0.3% Triton-X로 처리한 뒤 tetramethyl-rhodamine isothiocyanate(TRITC)로 표지된 ph-alloidin(1：50；Sigma, St. Louis, MO)으로 30분간 반응시킨 후 다시 PBS로 세척하고 수용성 마운트로 포매하여 형광 현미경(BX51TRF, Olympus, Tokyo, Japan)하에서 관찰하였다.

Single-stranded DNA 면역조직화학염색
   Cisplatin에 의한 intrastrand cross-link의 손상으로 발생되는 single-stranded DNA(ssDNA)의 발현을 알아보기 위하여 항 ssDNA 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 준비된 슬라이드를 ethanol에서 탈파라핀화 과정을 거친 후 3% H₂O₂에서 10분간 반응시키고 0.25%(v/v) Triton-X로 10분간 처리하였다. 일차항체로 anti-ssDNA antibody(1：800, rabbit polyclonal antibody, Dako, A4506, Lot No. 0A003A, Glostrup, Denmark) 로 처리하여 4℃에서 overnight 동안 반응시킨 후 pH 7.4인 0.1%(w/v) Tris-PBS solution으로 세정하고 3%(v/v) normal goat serum에 처리하였다. PBS로 세정 후 이차 항체로는 fluorescein conjugated sheep anti-rabbit secondary antibody(20 μg/mL, Chemicon, Temecula, USA)에 30분간 반응시키고 수용성 마운트(Dakocytomation, Glostrup, Denmark)를 이용하여 마운트한 후 형광 현미경(BX51TRF, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling(TUNEL) 염색
   세포자멸사를 확인하기 위하여 준비한 파라핀 절편에 TUNEL staining Kit(ApopTag Peroxidase in situ Apoptosis Detection Kt, Serologicals, USA)를 이용하였다. 조직절편은 xylene으로 5분간 3회 탈파라핀을 시행하고 99%, 95%, 70%의 alcohol로 처리하였으며 20 μg/ml의 Proteinase K로 실온에서 약 15분간 반응시킨 후 내인성 peroxidase의 활성을 저지하기 위하여 3% H2O2(Sigma, St. Louis, MO) in PBS로 처리하였다. Equilibration buffer로 약 10초간 처리한 뒤 working strength TdT enzyme으로 37℃ Chamber에서 1시간 반응 시키고 working strength stop/wash buffer로 약 10분간 처리하였다. PBS로 세정한 뒤 anti-digoxigenin conjugate로 실온에서 30분간 처리하고 PBS로 세정한 뒤 peroxidase substrate는 diaminobenzidine(DAB)로 발색하였고 대조염색으로는 hematoxylin을 사용하여 약 10분간 시행하였고 증류수에 세정하고 마운트하여 광학 현미경(BX50W/PH20, Olympus, Tokyo, Japan)하에 관찰하였다.

통계학적 검정
   통계학적 검정은 SPSS(Version 13.0)를 이용하였다. 각 군 간의 시간대별 청성뇌간반응의 역치변화 차이는 Student t- test를 이용하였고, 각 군 내의 시간의 변화에 따른 청성뇌간반응의 역치변화는 One way ANOVA를 이용하여 p값이 0.01보다 작은 경우를 통계학적으로 유의하다고 하였다.

결     과

청성뇌간반응의 역치변화
   실험동물 각각의 약물을 투여하기 전 청력은 유사하였으며, 약물투여 5일, 10일 후 각 군별로 청성뇌간반응의 역치변화를 측정하였다. 
   생리 식염수를 투여한 group 1과 procaine hydrochloride만 투여한 group 4에서는 시간의 경과에 따라 청성뇌간반응의 역치변화는 관찰되지 않았다. Cisplatin만을 투여한 group 2와 procaine hydrochloride 전처치 후 cisplatin을 투여한 group 3에서는 약물투여 5일 후와 10일 후에 측정한 청성뇌간반응의 역치변화 차이는 없었으며, group 2에서는 약물투여 10일 후에 click, 2 kHz, 4 kHz와 8kHz에서 측정한 청성뇌간반응의 역치변화는 각각 7.5±3.53, 14.0±6.58, 11±2.1 그리고 24.5±6.40 dB SPL이었고, group 3에서는 약물투여 10일 후에 click, 2 kHz, 4 kHz와 8 kHz에서 측정한 청성뇌간반응의 역치변화는 3.33±2.41, 3.33±2.1, 3.33±2.1, 6.67±2.58 dB SPL으로 group 2에 비하여 각각 통계학적으로 유의하게 역치상승 정도의 감소를 보였다(p<0.01)(Fig. 1). 

유모세포의 손상정도
   유모세포의 손상정도를 확인하기 위하여 약물투여 후 10일째 시행한 phalloidin 염색에서 생리 식염수를 투여한 group 1은 와우첨부에서 기저부까지 유모세포의 손상이 없었으며(Fig. 2A, D and G), cisplatin만을 투여한 group 2와 procaine hydrochloride 전처치 후 cisplatin을 투여한 group 3에서는 모두 외유모세포의 손상을 관찰할 수 있었다. Group 2에서 유모세포의 손상은 와우 중간부위부터 관찰되었으며 기저부로 갈수록 손상의 정도는 심하였다(Fig. 2B, E and H). 반면 Group 3의 경우 중간 회전 이후부터 미약한 유모세포의 손상이 관찰되었으며, 주로 기저부의 유모세포에서 부분적으로 유모세포의 손상을 관찰할 수 있었으나 cisplatin 치료군에 비해 손상된 유모세포의 수가 적었다(Fig. 2C, F and I). 각각의 group별로 유모세포 손상의 정도를 와우 첨부, 중간부, 기저부로 분류한 결과 group 3에서 group 2보다 유모세포의 손상이 적었다(Fig. 3).

Single-stranded DNA 면역조직화학염색 및 TUNEL 염색
   Cisplatin만을 투여한 group 2와 procaine hydrochloride 전처치 후 cisplatin을 투여한 group 3에서 모두 코르티기 유모세포와 주변의 지지세포들에서 ssDNA에 대한 면역 염색 반응 및 세포의 자멸사가 관찰되었다. 각각의 염색에서 group 2에서 group 3보다 발현의 정도가 증가되어 있었다(Figs. 4 and 5).

고     찰

   주로 두경부 및 비뇨생식기계 종양의 항암 치료제인 cisplatin은 DNA에 비가역적으로 결합하여 염기 치환에 변이를 만들면서 빠른 intra-strand cross-linking에 손상을 주어 궁극적으로 세포의 자멸사를 유발하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 
   그러나 cisplatin은 투여 용량이 증가함에 따라 다양한 이독성, 신독성, 골수독성 등이 더욱 심각하게 발생하기 때문에, 고용량의 투여가 주로 필요한 난소암 등의 비뇨생식기 계통의 종양이나 대장암 등의 치료에 어려움이 있다. 따라서 용량에 비례하여 증가하는 cisplatin의 부작용 때문에 독성을 줄이면서도 고용량 투여를 가능하게 하기 위한 많은 연구들이 시행되고 있다.^{3,4,5,6,7,8,10,11)} 
   다양한 부작용 중 cisplatin 투여에 의해 발생하는 이독성은 주로 양측성, 고음역의 청력손실을 특징으로 하고 투여환자에서 일시적 또는 영구적인 감각신경성 난청이 발생한다고 보고되고 있다.^12,13,14) 이러한 현상은 일반적으로 Corti 기의 유모세포의 손상과 관계가 있고, 그 외의 연구들에서도 유모 세포의 손실과 함께 와우 혈관조, 와우 신경절 세포의 형태학적 기능적 변화와도 관련이 있는 것으로 알려져 있으며¹⁵⁾ 일부의 보고에서는 이독성의 원인은 cisplatin이 조직의 손상을 초래하는 산화질소(nitric oxide, NO)를 유도하는 산화질소 합성효소(inducible NO synthase, iNOS)의 활성화에 관여하여 발생하는 것으로 생각되고 있다.¹⁶⁾
   최근 국소 마취제인 procaine hydrochloride가 cisplatin 에 의해 유발된 신독성과 혈액독성을 감소시킬 수 있었으며, 항암 효과 또한 증진시킬 수 있다는 보고가 있었는데^7,8) procaine은 pseudocholinesterase에 의해 p-aminobenzoic acid(PABA)와 diethylaminoethanol로 대사되며,¹⁷⁾ 이러한 대사물들이 cisplatin의 독성과 항암효과에 영향을 줄 것이라고 생각되고 있다. Procaine hydrochloride의 예방 효과 기전에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않으나, 주로 약동학적 작용과 약력학적 작용에 영향을 주기 때문으로 생각되고 있는데 cisplatin에 의한 신독성에서는 procaine이 lipid peroxidation을 억제하고 자유 라디칼을 제거하는 효과를 가지며¹⁸⁾ platinum을 포함하는 물질과 단백질 혹은 다른 구핵성 물질과의 비가역적인 결합을 변화시켜 독성을 줄이는 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.⁸⁾ 
   본 연구에서는 실험동물에서 cisplatin으로 유도된 이독성에 대하여 procaine hydrochloride의 예방적 효과에 대하여 알아 보고자 하였다. 다른 보고와 마찬가지로 cisplatin투여 후에 유모세포의 광범위한 손상을 관찰할 수 있었으며 세포의 자멸사도 single strand DNA와 TUNEL 염색으로 확인이 가능하였다. 청성뇌간반응의 역치도 대조군에 비하여 cisplatin 투여 이후 유의한 역치상승을 보였다. 반면 proocaine hydrochloride로 전처치를 하고 cisplatin을 투여한 군에서는 cisplatin 단독 투여군에 비하여 유모세포의 손상과 세포 자멸사가 적게 관찰되었으며 청성뇌간반응의 역치상승도 유의하게 감소되어 있음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 procaine hydrochloride가 신독성을 감소시킨 것처럼 cisplatin에 의해 유도된 이독성에 대하여도 자유라디칼을 제거제 혹은 다른 역할로 작용하여 예방적 효과를 가지지 않을까 생각하며 그 기전에 대하여는 연구가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   본 연구에서는 procaine hydrochloride가 cisplatin에 의해 유발된 이독성에 대한 효과를 관찰하였다. procaine hydrochloride 전처치 후 cisplatin을 투여한 군에서는 cisplatin 투여군보다 상대적으로 유모세포의 손상과 청성뇌간반응 역치의 상승정도가 적었다. 이상의 결과로 cisplatin에 의해 발생한 이독성에서 procaine hydrochloride를 미리 투여하여 이독성을 감소시킬 수 있을 것이라 생각한다.

1. Levin L, Hryniuk WM. Dose intensity analysis of chemotherapy regimens in ovarian carcinoma. J Clin Oncol 1987;5(5):756-67. 

2. Ozols RF, Young RC. Chemotherapy of ovarian cancer. Semin Oncol 1984;11(3):251-63. 

3. Ross DA, Gale GR. Reduction of the renal toxicity of cis-dichlorodiammineplatinum(II) by probenecid. Cancer Treat Rep 1979;63(5):781-7.

4. Chary KK, Higby DJ, Henderson ES, Swinerton KD. Phase I study of high-dose cis-dichlorodiammineplatinum(II) with forced diuresis. Cancer Treat Rep 1977;61(3):367-70.

5. Litterst CL. Alterations in the toxicity of cis-dichlorodiammineplatinum-II and in tissue localization of platinum as a function of NaCl concentration in the vehicle of administration. Toxicol Appl Pharmacol 1981;61(1):99-108. 

6. Howell SB, Taetle R. Effect of sodium thiosulfate on cis-dichlorodiammineplatinum(II) toxicity and antitumor activity in L1210 leukemia. Cancer Treat Rep 1980;64(4-5):611-6. 

7. Fenoglio C, Boicelli CA, Ottone M, Addario C, Chiari P, Viale M. Protective effect of procaine hydrochloride on cisplatin-induced alterations in rat kidney. Anticancer Drugs 2002;13(10):1043-54. 

8. Viale M, Vannozzi MO, Mandys V, Esposito M. Time-dependent influence of procaine hydrochloride on cisplatin antitumor activity in P388 tumor bearing mice. Anticancer Res 2001;21(1A):485-7.

9. Tognella S. Pharmacological interventions to reduce platinum-induced toxicity. Cancer Treat Rev 1990;17(2-3):139-42.

10. Yuhas JM, Culo F. Selective inhibition of the nephrotoxicity of cisdiamminedichloroplatinum(II) by WR-2721 without altering its antitumor properties. Cancer Treat Rep 1980;64(1):57-64.

11. Ohtani I, Ohtsuki K, Aikawa T, Sato Y, Anzai T, Ouchi J. Mechanism of protective effect of fosfomycin against aminoglycoside ototoxicity. Auris Nasus Larynx 1984;11(3):119-24.

12. Piel IJ, Meyer D, Perlia CP, Wolfe VI. Effects of cis-diamminedichloroplatinum(NSC-119875) on hearing function in man. Cancer Chemother Rep 1974;58(6):871-5.

13. Boheim K, Bichler E. Cisplatin-induced ototoxicity: Audiometric findings and experimental cochlear pathology. Arch Otorhinolaryngol 1985;242(1):1-6.

14. Laurell G, Jungnelius U. High-dose cisplatin treatment: hearing loss and plasma concentrations. Laryngoscope 1990;100(7):724-34.

15. Hamers FP, Wijbenga J, Wolters FL, Klis SF, Sluyter S, Smoorenburg GF. Cisplatin ototoxicity involves organ of Corti, stria vascularis and spiral ganglion: Modulation by alphaMSH and ORG 2766. Audiol Neurootol 2003;8(6):305-15.

16. Watanabe K, Hess A, Michel O, Yagi T. Nitric oxide synthase inhibitor reduces the apoptotic change in the cisplatin-treated cochlea of guinea pigs. Anticancer Drugs 2000;11(9):731-5.

17. Brodie BB, Papper EM, Mark LC. Fate of procain in man and properties of its metabolite diethylaminoethanol. Curr Res Ansth Analg 1950;29(1):29-33.

18. Zhong LF, Zhang JG, Zhang M, Ma SL, Xia YX. Protection against cisplatin-induced lipid peroxidation and kidney damage by procaine in rats. Arch Toxicol 1990;64(7):599-600.