교신저자：노환중, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10번지  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(051) 240-7335 · 전송：(051) 246-8668 · E-mail：rohhj@pusan.ac.kr

서     론

   후각상피(olfactory epithelium)는 후각수용세포(olfactory receptor cell), 미세융모세포(microvilli cell), 지지세포(supporting cell or sustentacular cell), 기저세포(basal cell)로 구성되어 있다. 후각수용세포는 다른 신경세포와 달리 손상 후에도 재생되고, 세포고사의 작용으로 3~7주 간격으로 재생 과정이 계속된다.¹⁾ 이러한 재생 과정에서 기저세포가 후각수용세포로 분화된다고 알려져 있으며, 후각수용세포는 후각표지단백(olfactory marker protein, OMP)이라는 특징적인 표지자를 지니는데, 기저세포가 후각수용세포으로 분화되어 갈수록 OMP는 점점 더 강하게 표현된다.²⁾
   흡연과 후각 기능 감퇴와의 관계는 명확히 증명되어 있지는 않지만, 일부 역학 연구에서 그 관련성이 보고되고 있다.³⁾ 담배 연기에는 니코틴(nicotine), 타르(tar)를 비롯하여 아세톤(acetone), 포름알데하이드(formaldehyde), 일산화탄소, 암모니아 등 4,000가지의 화학물질이 포함되어 있다. 비흡연자에 비하여 흡연자는 2배 이상 후각 감퇴를 호소하며, 흡연량과 비례하는 가역적인 후각 감퇴가 나타난다고 보고되었다.⁴⁾ 흡연이 어떠한 기전으로 후각 감퇴나 후각 소실을 일으키는지에 대해서 조직학적으로 아직 명확히 밝혀지지는 않았지만, 담배 연기에서 발생되는 독성 물질이 후각 상피를 직접 손상시킨다고 추정되고 있다.⁵⁾ 동물 실험에서 담배 연기에 간접 노출된 후 후각수용세포의 파괴와 후각 상피의 두께 감소 등이 보고되었고,⁶⁾ 담배 연기나 알코올에 의한 olfactory sensory neurons(OSNs)의 세포고사(apoptosis)가 재생 과정에 의하여 적절히 보상되지 않는 경우 후각 감퇴를 가져온다는 보고가 있다.^1,6)
  본 연구에서는 백서를 담배 연기에 노출시킨 후 각 시기별로 후각점막의 손상과 변화 및 회복 정도를 조직학적으로 관찰하였고, OMP를 이용하여 후각수용세포가 발현되는 정도를 면역조직형광화학적 방법으로 분석하여 담배 연기가 후각상피에 직접적으로 미치는 영향에 대하여 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대 상
   생후 6~7주된 150~230 gram의 Sprague-Dawley 백서 36마리를 대상으로 하였다. 실험군 28마리와 대조군 8마리로 나누었고, 실험 전에 음식물 찾기 검사로 후각 기능의 장애가 없는 것을 확인하였다. 음식물 찾기 검사는 동물들의 후각 상태를 검사하기 위한 방법으로, 실험동물을 하룻밤 동안 먹이를 주지 않은 상태에서, 동물 사육조 안에 먹이를 깨끗한 대팻밥 안에 묻어 두어 먹이가 보이지 않는 상태로 동물들이 냄새로 이를 찾을 수 있는가를 보았으며, 이를 통하여 실험동물의 후각 상태를 간접적으로 평가하였다. 5분 이내 음식을 찾을 수 있는 36마리의 백서를 실험 대상으로 하였다.
   실험군 28마리는 4마리씩 7개 군으로 나누어, 담배 연기노출 5일, 11일, 3주, 4주, 5주, 6주, 9주에 각각 조직변화를 관찰하였고, 정상 대조군은 담배연기에 노출시키지 않고 실온(room air)에서 사육하였으며, 실험 시작 4주에 4마리, 9주에 4마리를 각각 희생시켰다.

방 법

담배 연기 노출
   담배 연기에의 노출은 특수 제작한 담배 연기 흡입장치(smoking apparatus, Fig. 1)를 이용하였다.⁷⁾ 흡입장치는 가로, 세로, 높이가 각각 33 cm, 24 cm, 28 cm인 아크릴 상자를 제작하고 상자내부의 높이 10 cm 되는 곳에 칸막이를 설치하여 상층에 실험동물을 두고 하층에 담배를 설치하였다. 흡입기를 통하여 흡입된 연기(주류연, main stream smoke)는 고무호스를 통하여 상층으로 주입하였고, 하층의 담배가 연소되면서 발생하는 부류연(side stream smoke)은 하층과 상층 사이 칸막이에 설치된 창을 통하여 상층으로 흘러가게 하였다. 국산 담배(This, Tar 7.0 mg, Nicotine 0.75 mg)를 1개피당 30분씩, 하루 평균 총 5개피의 담배연기에 2.5시간 동안 연속적으로 노출시켰다. 1개피의 담배는 5분 동안 연소시켰고, 25분간 담배연기가 남아 있는 흡입장치에서 실험동물을 연기에 노출시켰다. 5분 동안의 연소 기간 중, 흡입기는 5초간의 흡입으로 주류연을 흡입장치의 상층으로 배출하도록 하고, 25초간은 흡입기의 작동을 정지하여 주류연은 흡입장치 내로 배출되지 않은채 부류연만이 흡입장치 내로 흘러들도록 하여 1개피 노출당 총 10회의 흡입, 5분간의 연소가 이루어졌다. 실험 도중 window를 통하여 흡입장치 밖으로 공기의 일부가 배출될 수 있도록 하였다. 실험은 매일 같은 시각에 실시하여 노출과 노출 사이의 간격이 일정하게 하였고, 각 군별로 마지막 노출 1시간 후에 백서를 희생시켰다. 각 실험군별로 4마리의 백서를 한꺼번에 연기에 노출시켰고, 대조군은 같은 환경하에 위치시키면서 연기에 노출시키지 않았다.

조직 제작 및 광학현미경 관찰
   각 군별로 담배 연기에의 노출이 끝난 백서는 pentobarbital sodium 120 mg/kg을 복강 내로 주사하여 호흡정지를 유발하였고, 호흡정지가 일어나면 즉시 앙와위로 눕혀 고정한 후에 복강을 열고 횡격막을 절단하여 흉강으로 접근하였다. 심장을 확인한 후 좌심실에 23G 바늘을 삽입하고 동시에 우심실을 개방하여 0.1% 헤파린액 50~70 ml를 관류시켰다. 관류 후 단두하여, 백서의 머리(head) 부분을 두개(skull)와 아래턱(low jaw)으로부터 따로 떼어내서 10% 중성포르말린 용액에 24시간 고정시키고 EDTA 용액에서 6주간 탈석회화하였으며 조직을 비강의 비중격에 직각이 되도록 관상면(coronal plane)으로 절단하여 파라핀 블록으로 제작하였다. 파라핀 블록은 microtome(Leica RM 2135, Germany)을 사용하여 4 μm의 조직 절편을 만든 후, 비중격과 상악동(maxillary sinus)이 동시에 관찰 가능한 비강의 조직절편에서 비중격의 상부의 후각상피를 H-E 염색하여, 광학현미경 200배와 400배 시야에서 노출 기간에 따른 점막의 변화를 관찰하였다(Fig. 2).⁵⁾ 400배 시야에서는 15×15 μm²의 단위 면적 내의 후각세포의 숫자를 실험자 중 한 명이 세었으며, 각 군마다 서로 다른 10시야에서 측정한 수치의 평균을 구하였다.

면역조직형광화학 관찰
   면역조직형광화학염색을 위해서 OMP에 대한 항체인 goat anti-OMP antibodies와 FITC(Fluorescein isothiocyanate)-conjugated anti-goat secondary antiserum(Jackson Immunoresearch Laboratories. Inc., West Baltimore pike, PA, USA)를 사용하였다.
   먼저 15μm 두께의 조직절편을 슬라이드에 부착하여 건조시키고, xylene으로 파라핀을 제거, 알코올로 탈수시킨 후, dextrose water로 세척하였다. Goat anti-OMP antibodies를 0.05 M KPBS(potassium phosphate buffered saline), 0.5% Triton X-100, 2% bovine serum albumin에 1：20,000으로 희석시킨 다음 실온에서 12시간 반응시키고, 0.05M KPBS로 각각 5분, 10분 간격으로 3차례 세척하였다. 이후 조직을 1：500으로 희석한 FITC-conjugated anti-goat secondary antiserum에 1시간 반응시키고, 다시 0.05 M KPBS로 각각 5분, 10분 간격으로 3차례 세척하였다. 마지막으로 1：10,000으로 희석된 DAPl(4'-6-Diamidino-2-phenylindole-2HCl')를 이용하여 대조염색을 시행하여 공초점현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.

통계처리
   모든 자료는 평균±표준 오차로 표시하였으며, 통계 검정상 p<0.05를 유의한 것으로 간주하였고, 두 군 간의 세포수 분석은 SPSS V12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 paired t-test를 사용하였다.

결     과

담배 연기 노출 기간에 따른 후각상피의 광학현미경적 소견
   대조군의 광학현미경 소견은 4주군과 9주군 사이에 특별한 차이를 보이지 않아 주로 9주군을 대조군으로 분석하였다. 대조군의 정상 후각상피는 혈관 및 신경다발(nerve bundle)이 풍부한 고유층(lamina propria) 위에 미세융모세포, 지지세포, 후각수용세포, 기저세포가 8~10층의 위중층상피를 구성하고 있었다. 위중층상피의 가장 표면은 한 층의 미세융모세포가 위치하며, 그 아래로 여러 층의 후각수용세포와 지지세포가 있고, 상피층의 가장 아래의 기저판 위에 한 층의 기저세포가 위치한다(Fig. 3A).
   실험 5일군의 후각상피는 상피층에서 일부 세포들이 탈락되고, 탈락된 세포들은 비강의 내강으로 배출되는 소견이 관찰되었으며, 후각수용세포의 정렬은 무질서해지기 시작했다. 상피의 두께는 8~10층 정도로 변화가 없었다(Fig. 3B). 실험 11일군에서는 후각 상피의 두께가 5층 정도로 확연히 줄어든 소견이 관찰되었으며, 세포 사이사이로 상피의 손상을 보여주는 틈(crack)이 관찰되기 시작했다(Fig. 3C).
   실험 3주군에서는 상피의 두께가 2~3층 정도로 확연히 얇아졌다. 특히 상피세포층의 상당 부분을 차지하고 있던 지지세포와 후각수용세포가 많이 소실되었으며, 길죽한 타원형의 핵을 가지는 지지세포가 1~2층, 둥근 모양의 핵을 가진 기저세포와 후각수용세포가 1~2층에서 관찰되었다. 기저판에서 풍부하게 관찰되던 신경다발과 Bowman선의 감소도 두드러지게 나타났다(Fig. 3D).
   실험 6주군에서도 지속적인 후각상피의 두께 감소와 기저판의 파괴 소견이 관찰되었다(Fig. 3E). 실험 9주군에서는 상피층이 여전히 감소하였으며, 세포의 정렬이 거의 파괴되어 없어지는 소견이 관찰되었다. 세포질(cytoplasm)이 얇아지고 상방으로 향하는 곤봉 모양의 olfactory knob이 사라졌으며, 중간중간 핵도 위축되고 손상되는 모습도 관찰되었다(Fig. 3F).
   정상 대조군에서 후각상피세포의 개수는 단위 면적당 21.8 ±2.44였다. 실험 5일군의 후각상피세포 개수는 20.2±1.75로 정상 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으나(p=0.061), 실험 11일군과 실험 3주군에서는 각각 16.9±1.73, 9.4±0.84로 정상 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.005). 또한 실험 5일군과 실험 11일군, 실험 11일군과 실험 3주군 사이에서도 각각 후각상피세포의 개수가 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p=0.001)(Fig. 4).

OMP에 대한 면역조직형광화학적 소견
   대조군에서는 후각수용세포의 핵 주위 세포질, 세포질 돌기 및 기저판으로 향하는 신경다발 주위에서 OMP에 대한 면역형광 반응이 잘 나타나며, 바깥층의 지지세포나 아래쪽의 기저세포에서는 잘 관찰되지 않았다(Fig. 5A). 실험 11일군에서는 후각수용세포의 정열이 무질서해지고, 세포 사이의 틈이 나타나기 시작하지만 아직 여러 층의 후각상피 구조를 형성하는 소견이 관찰되었으나(Fig. 5B), 실험 4주군에서는 후각수용세포가 무질서해지고, 숫자도 감소하여 1~2층의 후각수용세포만 관찰되었으며, 기저판으로 향하는 신경다발의 감소도 보였다(Fig. 5C). 실험 6주군에서 후각수용세포에 대한 OMP의 면역형광반응이 현저히 감소하였다(Fig. 5D).

고     찰

   후각감퇴나 소실을 유발하는 화학물질은 다양하며, 대표적인 화학물질로서 zinc sulfate(ZnSO₄)나 sulfur dioxide (SO₂) 등에 의한 후각상피의 손상이 동물 실험을 통하여 연구되었다.^8,9) 담배 연기에는 약 4,000가지의 화학물질이 포함되어 있으므로 담배 연기에 포함된 어떤 성분이 후각상피의 손상에 결정적인 역할을 하는지 명확히 밝혀진 바는 없다. 하지만 역학 연구에서 비흡연자와 비교해 흡연자에 있어서 후각 감퇴율이 더 높게 나타나고, 동물 실험모델을 통해서 담배 연기에 지속적으로 노출될 경우 후각상피의 손상이 나타남이 증명되었다.⁵⁾
   사람과 생쥐 모두에서 후각상피를 구성하는 세포비율은 비슷하며, 정상적인 경우 후각수용세포가 70~80%, 지지세포가 15~25%, 기저세포가 5% 정도로 관찰된다.¹⁰⁾ 후각세포는 신경세포이지만 다른 신경세포와는 달리 유일하게 재생되는 신경세포로서,¹¹⁾ 직접적인 손상을 입거나 후각신경이 손상 받은 이후에도 기저세포에서 재생할 수 있는 능력을 가진다고 알려져 있다.⁵⁾ 사람과 설치류의 후각세포는 세포고사(apoptosis)의 작용으로 대략 3~7주 가량의 세포주기를 가지면서 지속적으로 재생된다.¹²⁾ 현재까지 실험적으로 약물이나 화학물질에 노출시킨 후에 설치류의 후각점막 변화를 관찰하여 후각세포의 재생 과정을 규명하려고 하였으며,^8,9,13) 그 중 Methyl bromide에 의해 손상된 후각점막이 형태적으로 회복되는 데에는 4주, 생화학적인 효소들까지 정상치로 회복되기까지는 8주가 걸린다는 보고가 있다.¹³⁾ 본 실험의 계획 과정에서 담배 연기에 의한 후각상피세포층의 손상 및 파괴는 노출 2주에 시작되어, 8주 이후에는 후각 상피의 재생 및 회복 소견이 일부 나타날 수 있을 것으로 예상하였다.^9,13) 하지만 실제 실험 결과는 담배연기에 노출된 지 5일에서 9주까지 이르는 실험기간 동안 후각세포가 재생되는 소견은 관찰되지 않았다. 노출 9주까지도 후각수용세포의 배열이 무질서해지면서 그 숫자도 적어졌고, 후각상피세포층의 지속적인 손상 및 파괴 소견만이 관찰되었다. 이러한 결과는 노화 과정에서 후각세포의 재생능력을 넘어서는 지속적인 OSNs(olfactory sensory neurons)의 파괴가 관찰된다는 연구 보고¹⁴⁾ 및 담배 연기에 대한 지속적인 노출은 후각수용세포의 파괴를 증가시키며, 후각수용세포의 파괴의 증가는 후각 세포의 재생 속도를 넘어서는 지속적인 세포고사를 가져온다는 연구 보고^5,6)와 연관 지을 수 있고, Vent 등은 이러한 동물 실험 결과를 바탕으로 흡연자에서의 후각 소실은 후각상피의 재생 능력을 넘어서는 후각수용세포의 손상에 의하여 유발된다고 주장하였다.⁵⁾ 본 실험에서도 담배 연기로 인한 후각상피의 손상이 후각세포의 재생능력을 넘어섰기 때문에 지속적인 상피 세포층의 파괴를 유발한 것으로 생각되며, 특히 담배 연기에 대한 노출 후 5일에서 3주 사이에 의미 있는 세포 숫자의 감소가 관찰되었다. 약물이나 화학물질을 이용한 다른 실험과 비교하여서는 담배 연기 자극의 강도 자체가 강했을 가능성도 생각해 볼 수 있지만, 담배 연기는 4,000가지 이상의 화학물질 혼합된 복합체라는 점, 또한 사람에서는 더 오랜 기간, 더 많은 양의 담배 연기 및 자극에 노출되는 경우도 많다는 점 등을 고려할 때, 사람에서 담배연기 자극으로 인한 후각 감퇴가 이러한 과정으로 실제 유발될 수 있을 가능성을 시사하였다.
   본 실험에서 특히 담배 연기 노출 3주가 지나면서 후각상피층의 세포열 두께 감소와 구조적 변화가 두드러지게 관찰되었다. 또한 세포열의 두께 감소와 더불어 나타나는 구조의 무질서화가 특징적으로 관찰되었으며, 후각수용세포 자체에서도 상방으로 향하는 수상돌기와 olfactory knob이 사라지면서, 세포질이 얇아지고, 핵도 위축되고 손상을 일어나는 소견이 관찰되었다. 담배 연기 자극에 대하여 후각상피층은 조직학적 구조의 전반적인 변화뿐만 아니라 후각수용세포 자체의 변성 및 파괴가 나타나는 것으로 생각되며, 이러한 변화가 지속적인 담배 연기에의 노출이 후각기능의 감퇴와 소실의 원인일 가능성을 제시하였다. 노출 4주, 5주, 6주, 9주군에서는 노출 3주군과 비교하여 후각상피세포의 개수가 통계적으로 의미있게 감소하지 않았고, 면역조직화학적 소견에서도 각 군간에 유의한 차이를 보이지 않았는데, 이러한 결과는 후각상피세포층의 파괴가 담배 연기 노출 3주째에 두드러지게 나타났기 때문으로 생각되었다.
   또한 본 실험의 결과에서는 담배 연기 노출 3주와 6주를 지나면서 후각상피층의 세포 감소 외에도 후각 상피의 고유층에서 관찰되던 후각 신경다발이 확연하게 줄어들며 사라진 소견이 특징적으로 나타났다. 고유층에서 관찰되는 후각 신경다발은 비강 상부에 주로 위치하는 후각상피와 비강 상부 이외의 대부분 점막을 구성하는 호흡 상피를 조직학적으로 구분해주는 중요한 특징이 되었는데, 상피의 고유층에서 나타나는 이러한 조직학적 변화는 백서에서 채취한 점막 조직이 후각 상피인지 호흡 상피인지 판단하는데 어려움을 주었다. 그러나 실험 군 전체에서 백서의 비강 상부 일정한 부위에서 점막을 얻어 실험하였고(Fig. 2), 각 실험군 당 4마리씩의 백서를 대상으로 실험하여 각 개체에서 비슷한 결과를 보였으므로, 고유층의 신경다발이 소실되는 소견은 담배 연기에 지속적으로 노출됨에 따라서 후각 상피의 고유층에서도 손상 과정이 나타나는 것으로 생각되었다.
   담배 연기 노출 3주가 지나면서 후각상피를 구성하는 세포들 중, 지지세포와 후각수용세포가 기저세포보다 더욱 심한 손상을 받고, 그 숫자도 두드러지게 줄어들었는데, 노출 3주 이후부터는 기저세포의 손상 역시 가속화되는 소견이 관찰되었다. 이러한 지지세포와 후각수용세포의 손상 정도는 기저세포의 후각 상피의 재생 능력을 간접적으로 판단할 수 있는 척도가 될 수 있음을 의미한다. 특히 지지세포는 후각수용세포를 둘러싸는 보호세포의 기능 이외에도 후각상피에 유입된 물질을 대사시키는 효소가 있어서 후각상피의 독성을 제거하는 기능도 가지고 있으므로,¹⁵⁾ 지지세포의 이러한 기능 소실과 담배 연기에 의한 후각상피의 손상 과정을 연관지어 생각해 볼 수도 있었다. 하지만 본 연구에서는 후각상피세포층 내에 존재하는 후각수용세포와 지지세포를 단순히 광학현미경하에서 H-E 염색의 병리 소견만으로 구별했기 때문에, 후각수용세포와 지지세포의 정확한 구분이 쉽지 않았다. 따라서 본 연구에서 담배 연기에 노출되었던 각각의 실험군별로 세포의 개수를 비교할 때도 후각수용세포와 지지세포를 구분하지 않고, 후각상피세포층 내의 모든 세포의 수로 계수, 비교하였기 때문에 후각수용세포만의 변화 정도를 정확히 나타내지는 못했다. 향후 후각상피세포층을 관찰할 경우에 S-100 등의 특수 염색을 이용하여 후각수용세포와 지지세포를 정확히 구별한다면, 후각수용세포 자체의 손상을 분석하거나 후각상피 손상 과정 중의 지지세포 역할을 더 잘 이해할 수 있을 것으로 생각되었다.
   후각표지단백(OMP)은 후각수용세포에서 특징적으로 나타나는 표지자로서,¹⁶⁾ 후각상피에서는 기저세포에서 후각수용세포로 분화되어 갈수록 더 강하게 표현된다.²⁾ 후각수용세포의 고사(apoptosis)는 후각 소실 전반에 걸쳐 결정적인 역할을 하며, 후각 소실의 치료적 접근에 중요한 역할을 제공한다.¹⁴⁾ 본 실험에서는 담배 연기에 노출된 지 5일째부터 후각수용세포의 배열과 분포가 약간씩 무질서해지는 소견이 관찰되었으며, 노출 3주가 지나면서 전체적으로 후각수용세포의 배열 질서가 없어지면서, 밀도가 낮아지는 소견이 관찰되었다. 특히 4주 이상 담배 연기에 노출되면서 OMP를 표현하는 후각수용세포의 숫자가 크게 감소되었고, 후각상피에서 여러 층을 이루던 후각수용세포층들이 1~2층으로만 관찰되었으며, 기저판으로 향하는 신경다발의 감소도 특징적으로 관찰되었다. 담배연기에 4주 이상 지속적으로 노출되면서 후각수용세포의 구조적 파괴와 숫자의 감퇴도 두드러지게 관찰되었고, 이는 담배연기에 대한 지속적인 노출이 후각기능의 소실을 유발한다는 것을 뒷받침해 준다.
   세포의 파괴 과정은 형태학적, 분자학적으로 세포 괴사(necrosis)와 세포 고사(apoptosis)로 구분된다. 화학물질 등에 의해 손상 받을 경우 후각상피세포는 괴사가 일어나고 이러한 괴사과정을 거친 이후에 손상과 재생 과정이 나타난다고 알려져 왔었지만,¹⁷⁾ 최근의 연구에 의하면 담배연기나 공업용 본드가스에 노출되어 후각점막의 파괴가 발생하는 경우 외상, 노화, 비부비동염 등에 의한 경우와 유사하게 후각상피의 고사(apoptosis)가 유도된다고 보고되며, 이러한 소견이 조직학적으로 실제 증명되고 있다.^5,14,18) 본 실험에서는 담배연기에 노출된 후각상피에서 염증세포들이 후각상피로 침투하는 소견이나 두드러진 염증 소견은 관찰되지 않았고, 후각수용상피에서 세포의 크기가 줄어들면서 탈락되며, 세포질의 감소가 관찰되는 등, 괴사보다는 고사에 가까운 조직 형태를 나타내었다. 하지만 고사체(apoptotic body)가 명확하게 관찰되지 않았고, 세포고사에서 특이적으로 발현되는 효소반응인 caspase-3 반응 등을 통하여 그 여부를 확인하지는 못하였으므로 향후 세포 파괴 과정에 대한 다양한 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 총 9주간의 실험 기간 이후에 변화할 수 있는 후각 상피의 상태 및 재생 여부는 관찰하지 못하였으므로 좀 더 장기적인 연구가 필요하다고 사료되었다.

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