교신저자：정재윤, 330-715 충남 천안시 안서동 산16번지 311호  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(041) 550-3974 · 전송：(041) 550-1090 · E-mail：jjking@dankook.ac.kr

서     론

   칼슘은 세포 내에서 매우 중요한 역할을 하는 신호 분자이고 세포질 내 자유 칼슘은 세포 내 많은 기능을 직접 혹은 간접적으로 조절하며 세포질 내 칼슘 이온의 증가는 세포 내 칼슘 저장소에서 방출되거나, 칼슘이 원형질 막을 통과하여 세포 내로 들어오는 기전 각각의 작용 혹은 조합으로 이루어진다.¹⁾ 세포 내 저장소에서 칼슘이 방출되는 데에는 inositol 1,4,5-trisphosphate(IP3) 수용체의 작용이 거의 모든 세포에서 중요한 경로로 작용하고,²⁾ 세포고사 기전의 시작은 세포 내 칼슘의 지속적인 증가로 인한 endonucleases, phosphatases나 다른 칼슘 의존성 proteases 활성을 통해 일어난다고 생각되고 있다.³⁾ 기존 연구에 의해 aminoglycoside 항생제를 in vitro에서 처리했을 때 초기에 유모세포 내에 비가역적인 칼슘의 변화가 나타나는 것이 알려져 있으며,³⁾ 2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)는 기존에 알려진 xestospongins이나 heparin보다 IP3 수용체 길항작용이 더 크고 세포막에 빠른 투과성을 보이는 특징이 있다.^4,18) 본 연구에서는 House Ear Institute-Organ of Corti 1세포에 gentamicin을 처리하여 세포독성을 유발시킨 후 2- aminoethoxydiphenyl borate를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포와의 세포 내 칼슘 농도 변화의 차이와 caspase-3 활성을 통해 세포고사 정도의 차이를 간접적으로 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

HEI-OC1(House Ear Institute-Organ of Corti 1) 세포배양
   House Ear Institute에서 분양 받은 와우유모세포를 culture flask(Nunc, USA)에서 DMEM(Gibco BRL, USA) 배양액 500 ml에 우태혈청(Gibco, BRL, 10% FBS) 50 ml를 섞은 세포배양액으로 10% CO2, 33℃ 배양기 내에서 배양하였다.

CaspACE assay^TM(Promega, USA)
   CaspACE assay^TM kit(Promega, UAS)를 이용하여 대조군과 gentamicin과 2-APB를 농도별로 처리한 실험군에 caspase activity를 측정하였다.
   초대배양이나 계대배양하여 세포가 배양용기의 바닥에 포화(confluence)되면, 배지를 제거한 후 trypsin을 이용하여 세포를 harvest하여 5℃ 1,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 60 mm dish에 5×10⁵ cells/ml씩 4 ml로 세포를 분주하여 24시간 동안 10% CO₂, 33℃ 배양기 내에서 배양하였다.
   24시간 후 FBS 배지가 포함된 DMEM 배지로 교환해 주고 2-APB를 처리한 다음 30분 후에 gentamicin을 처리하였다. 16시간 후 trypsin을 이용하여 harvest하여 4℃ 1,400 rpm으로 10분간 원심분리한 후 10⁸ cells/ml로 cell lysis buffer를 넣고 얼음에 15분간 얼리고 5분간 warm bath에 녹이는 과정을 2차례 반복한 후 4℃ 1,500 rpm으로 20분간 원심분리함으로써 분리하였다. 세포 추출액에 chromophore인 p-nitroaniline(pNA) 기질을 넣고 33℃에서 4시간 결합하였다. 405 nm에서 caspase 활성을 ELISA reader를 이용하여 측정하였다.

MTT assay
   Tetrazolium-based colorimetric(MTT)검색을 이용하여 2-APB 농도에 따른 세포 생존율의 차이를 조사하였다. 초대배양이나 계대배양하여 세포가 배양용기의 바닥에 포화(confluence)되면, 세포를 2×10⁵ cells/ml로 배양액을 이용하여 희석한 후 flat bottom 96well plate에 각 well 당 100 μl씩(2×10⁴ cells/well) 분주하여 24시간을 10% CO₂가 유지되는 항온항습기에서 배양하였다. 2-APB를 10 mM을 단계별로 2배씩 희석하였고 대조군의 배지에는 아무 처리도 하지 않았다. 48시간 후 각 well에 50 μl pH 7.3의 PBS에 녹인 MTT용액(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dihenyltetrazolium bromide)을 50 μl씩 첨가하고 33℃ CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다.
   Formazan이 형성되면 각 well의 배지를 모두 제거하고 150 μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가한 후 microplate mixer로 잘 흔들어 주었으며 ELISA reader(BIO_ RED 450, USA)로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도는 살아있는 세포의 수와 직접 비례하는데 2-APB를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 세포 생존율(cell viability)을 아래와 같은 공식을 이용하여 계산하였다.
   Cell viability(%)=   Mean optical density in test well
   Cell viability(%)=--------------------- ×100
   Cell viability(%)= Mean optical density in control well
   모든 실험은 2-APB를 투여한 4개의 well에 평균 흡광도를 계산하여 세포 생존율을 구하였다.

Calcium imaging by confocal microscopy
   Confocal laser scanning microscopy(Carl Zeiss LSM 510 META)를 이용하여 세포질 내 칼슘 농도의 증가를 알아보았다. Gelatin 코팅을 한 2 cc glass bottom dish에 2×10⁵ cells을 접종한 다음 48시간 후에 배지를 칼슘이 들어있지 않은 HBSS 배지로 교환한 후 각 실험군에 Gentamicin과 2-APB를 농도별로 처리하고 3시간과 5시간 동안 10% CO₂, 33℃ 배양기 내에서 배양하였다.
   Calcium green-1(5μM) 시약을 1시간 동안 처리한 후 Argon laser를 이용하여 488 nm로 excitation 시키고, 505 nm 이상 emission에서 ×400 영상으로 관찰하였다.¹⁷⁾

Live cell imaging
   Fluorescence video-time lapse system을 이용하여 시간 경과에 따른 세포 내 칼슘 농도의 증가와 세포의 형태학적 변화를 알아보았다. 6well plate에 각 well 당 2×10⁵ cells 분주하여 24시간을 10% CO₂, 33℃ 배양기에서 배양하였다. 대조군과 실험군에 gentamicin, 2-APB와 calcium green-1 시약을 동시에 처리한 후 3분 간격으로 5시간 동안 environmental chamber에서 green GFP 필터를 이용하여 사진 촬영하였고 이것을 Axiovision software를 사용해 동영상을 만들었다. 그리고 densitometric mean green(40,000 μm² fields) 프로그램을 이용하여 각 군 간에 시간에 따른 세포 내 칼슘 농도 변화를 형광의 상대적 세기를 이용하여 비교하였다.

통계분석
   SPSS(version 10.0) 통계프로그램을 이용하여 대조군과 gentamicin과 2-APB를 농도별로 처리한 실험군의 caspase-3의 활성도를 측정해 그 차이를 Mann-Whitney test로 정량적으로 분석하여 95％ 유의수준에서 검증하였다.

결     과

CaspACE assay
   gentamicin 100 μM을 처리한 실험군에서 caspase-3 흡광도 0.394±0.03가 대조군의 caspase-3 흡광도 0.298±0.035보다 통계학적으로 유의하게(p<0.05) 높게 나타났다(Fig. 1). Gentamicin을 투여하기 전에 2-APB를 농도별로 30분 먼저 처리한 군에서는 2-APB 농도가 10 μM에서는 0.386±0.034으로 gentamicin만 처리한 군과 별 차이가 없었지만 농도가 25, 50 μM 올라가면서 0.233±0.036, 0.146±0.033으로 흡광도가 낮아지는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 75, 100 μM로 농도로 증가하면서 흡광도가 0.265±0.037, 0.373±0.029로 다시 올라가는 것을 알 수 있었고 25, 50, 75 μM 농도에서 gentamicin만 처리한 군과 비교할 때 p<0.05로 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(Fig. 2).

MTT assay
   실험에 사용한 2-APB 시약에 세포 독성능을 알아본 결과 100 μM 이하의 농도에서는 세포에 유의하게 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 

Calcium uptake measuerment by confocal microscopy
   대조군에서 보이는 영상을 기준으로 2-APB 50 μM과 gentamicin 100 μM을 처리한 군과 gentamicin 100 μM만 처리한 군을 상대적으로 비교해 본 결과 gentamicin을 처리한 군에서는 대조군보다 녹색 형광이 더 강하게 나타났고 2-APB를 gentamicin과 같이 처리한 군과 2-APB만 처리한 군에서는 대조군과 비슷한 정도에 형광을 나타내어 Gentamicin이 세포 내 칼슘농도를 증가시키고 2-APB가 이것을 억제하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig. 4).

Live cell imaging
   Fluorescence video-time lapse system을 이용하여 시간 경과에 따른 세포 내 칼슘 농도의 증가와 세포의 형태학적 변화는 gentamicin 100 μM을 처리한 군이 2-APB 50 μM을 같이 처리한 군보다 시간이 경과함에 따라 세포고사가 좀더 빨리 진행하고 5시간 경과 후 비교해 보았을 때 살아있는 세포의 수가 적었다. 그리고 두 실험군과 대조군 모두에서 시간이 경과함에 따라 녹색 형광이 증가하였다. gentamicin과 2-APB를 같이 처리한 군에서 대조군보다는 높은 형광을 보였으나 gentamicin만 처리한 군보다는 낮은 형광을 나타내었다(Fig. 5).

고     찰

   칼슘은 apoptosis, protein phosphorylation, exocytosis (neurotran-smitter release), motility, cell proliferation, cytoskeleton assembly and gene transcription 같은 여러 가지 세포 내 복잡한 신호 기전에 관여하며 다양한 세포 내 기능을 조절하는 역할을 한다.⁵⁾
   안정된 세포에서 세포질의 칼슘농도는 100 nM 이하로 낮은 수준을 유지하지만 IP3와 IP3 수용체가 활성화되면 상승작용에 의해 세포질 내 칼슘 농도가 500 nM 이상 올라가게 된다. 세포질 내 칼슘 농도가 증가하게 되면 IP3 수용체의 억제를 통해 세포 내 항상성을 조절하게 된다. 그러나 세포에 손상을 주는 자극이 오면 세포질 내 칼슘이 증가하면서 미토콘드리아의 구조가 변하고 여러 protease와 칼슘 의존성 enzyme들이 활성화되게 된다.³⁾ 그리고 caspase-3가 활성화되면서 IP3 수용체의 조절 영역을 절단하게 되고 이로 인해 IP3 수용체가 활성화되어 지속적인 세포질 내 칼슘 농도의 증가가 나타나게 된다.⁶⁾ 또한 caspase-3를 억제하는 기질을 방해하여 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 작용을 한다.⁷⁾ 많은 연구에 의해 IP3 수용체의 발현을 억제하였을 경우 apoptosis가 억제되는 것으로 알려져 있다.^8,9)
   본 실험에서 와우유모세포에 이독성을 유발하는데 사용한 aminoglycoside 항생제인 gentamicin은 apoptosis 과정을 통해 세포 손상을 주게 된다.¹⁰⁾ IP3 수용체 억제제로 사용한 2-aminoethoxydiphenyl borate(2-APB)는 막 투과를 통해 미토콘드리아 이외의 칼슘저장소 막 안에 있는 IP3 수용체를 억제하는 작용을 한다.^4,11) HeLa 세포에서 100μM 농도의 2-APB는 미토콘드리아의 가역적인 종창과 구조에 변화를 준다. 미토콘드리아를 탈분극시키지는 않지만 미토콘드리아 기질 내의 칼슘 흡수를 억제하는 작용을 한다.¹²⁾
   본 연구에서는 우선 MTT assay를 통해 실험에 사용한 2-APB 농도에서는 세포독성이 없는 것을 확인하였고 2- APB가 gentamicin에 의한 세포의 변화에 미치는 영향을 알아 보았다. 대조군과 비교해 보았을 때 gentamicin 100μM을 처리한 경우 세포 내 칼슘 농도가 증가하였고 2-APB 50 μM를 전처리함으로써 gentamicin에 의한 세포 내 칼슘농도의 증가가 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 gentamicin 100 μM를 처리한 군에서 caspase-3 활성도가 올라가는 것을 볼 수 있었고 2-APB를 전처리 했을 때, 2-APB 농도가 10 μM에서는 gentamicin만 처리한 군과 별 차이가 없었지만 농도가 25, 50 μM 올라가면서 caspase- 3 활성도가 낮아지는 관찰할 수 있었다. 본 실험에서 2-APB가 50 μM 농도일 때 caspase-3 활성도가 최고로 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 75, 100 μM로 농도로 가면서 활성도가 다시 올라가는 현상을 보였다.
   2-APB 100 μM 이상의 고농도에서는 비특이적으로 세포 내 칼슘 유리가 나타나는데 이런 현상은 세포 내 칼슘 저장소 막에 파묻혀 있는 칼슘 펌프와 IP3 수용체의 영역(domain)과 2-APB의 비특이적 비수용성 반응에 의해 나타난다고 알려져 있다.¹⁴⁾ Xestospongin C를 이용한 실험에서도 비슷한 결과가 나왔다. 또한 sarco-endoplasmic reticulum Ca²⁺ATPase를 억제하여 칼슘저장소에서 칼슘이 단계적으로 방출된다고 알려져 있다.^14,15)
   본 실험에서는 2-APB가 50 μM일 때 caspase-3 활성도가 최고로 억제되는 것으로 보아 이 농도에서 HEI-OC1 세포에 세포 내 칼슘증가를 최대로 억제하는 효과를 보일 것이라 생각된다. 기존에 발표된 A7r5 세포를 이용한 실험에서는 IP3에 의한 세포 내 칼슘 농도 증가가 2-APB의 농도가 36 μM일 때 half-maximal 억제효과를 보였고¹⁴⁾ 세포 종류 간에 따라 같은 농도에 2-APB에서 세포 내 칼슘 증가를 억제하는 효과에 차이가 있다고 알려져 있다.¹³⁾
   이전에 보고된 문헌상에는 gentamicin 50 μM에서 최대 caspase-3 활성도를 보였고 대조군과의 caspase-3 활성도가 6~8배 정도 차이가 나는 것으로 되어있다.¹⁶⁾ 본 실험에서는 CaspACE assay를 통해 caspases-3 활성도가 가장 크게 나타난 gentamicin 100 μM 농도를 사용하였는데 caspase-3 활성도가 대조군과 비교해 보았을 때 크게 차이가 나지 않았다. gentamicin에 대해 MTT assay도 시행해 보았지만 세포 독성이 높은 농도에서만 나타나는 것을 보였다. 기존 문헌과는 달리 HEI-OC1 세포가 gentamicin에 어느 정도 저항성을 보인 것일 수도 있고 caspase- 3 단계를 거치지 않는 다른 방식의 apoptosis에 의해 세포사가 일어나서 이런 결과가 나타난 것일 수 있겠다.
   세포의 시간에 따른 형태학적 변화와 칼슘 농도의 변화를 보기 위해 live cell imaging을 시행하였다. gentamicin을 처리한 군에서 형태학적으로 세포사가 빨리 일어나는 것을 알 수 있었고 2-APB가 어느 정도 이것을 억제하는 작용을 보였다. 대조군과 gentamicin, 2-APB를 처리한 군 간에 칼슘 농도의 차이는 있었지만 시간이 경과함에 따라 세포 내 칼슘 농도의 증가 양상은 비슷한 모습을 보였다. gentamicin에 2-APB를 같이 처리함으로써 세포 내 칼슘 증가와 세포사를 억제하는 것을 관찰할 수 있었다.

결     론

   gentamicin으로 처리한 와우유모세포에서 2-APB에 의한 caspase-3의 활성도 감소와 세포고사의 저하를 확인하였다. 이는 gentamicin에 의한 세포 내 칼슘농도 증가의 억제와 동반되었으며, 따라서 IP3 수용체와 세포 내 칼슘농도의 변화가 apoptosis 기전에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

1. Bootman MD, Berridge MJ, Roderick HL. Calcium signalling: More messengers, more channels, more complexity. Curr Biol 2002;12(16):563-5.

2. Halet G, Marangos P, Fitzharris G, Carroll J. Ca²⁺ oscillations at fertilization in mammals. Biochem Soc Trans 2003;31(pt 5):907-11.

3. Hirose K, Westrum LE, Stone JS, Zirpel L, Rubel EW. Dynamic studies of ototoxicity in mature avian auditory epithelium. Ann NY Acad Sci 1999;884:389-409.

4. Maruyama T, Kanaji T, Nakade S, Kanno T, Mikoshiba K. 2APB, 2-Aminoethoxydiphenyl borate, a membrane-penetrable modulator of Ins (1,4,5) P3-induced Ca2_ release. J Biochem 1997;122(3):498-505.

5. Berrridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signaling: Dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Rev Mol Cell Biol 2003;4(7):517-29.

6. Nakayama T, Hattori M, Uchida K, Nakamura T, Tateishi Y, Bannai H, et al. The regulatory domain of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor is necessary to keep the channel domain closed: Possible physiological significance of specific cleavage by caspase 3. Biochem J 2004;377(pt 2):299-307.

7. Assefa Z, Bultynck G, Szlufcik K, Nadif Kasri N, Vermassen E, Goris J, et al. Caspase-3-induced truncation of type 1 inositol trisphosphate receptor accelerates apoptotic cell death and induces inositol trisphosphate-independent calcium release during apoptosis. J Biol Chem 2004;279(41):43227-36.

8. Sugawara H, Kurosaki M, Takata M, Kurosaki T. Genetic evidence for involvement of type 1, type 2 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in signal transduction through the Bcell antigen receptor. EMBO J 1997;16(11):3078-88.

9. Tantral L, Malathi K, Kohyama S, Silane M, Berenstein A, Jayaraman T. Intracellular calcium release is required for caspase-3 and -9 activation. Cell Biochem Funct 2004;22(1):35-40.

10. Matsui JI, Ogilvie JM, Warchol ME. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J Neurosci 2002;22(4):1218 -27.

11. Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature 1993;361(6410):315-25.

12. Peppiatt CM, Collins TJ, Mackenzie L, Conway SJ, Holmes AB, Bootman MD, et al. 2-Aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) antagonises inositol 1,4,5-trisphosphate-induced calcium release, inhibits calcium pumps and has a use-dependent and slowly reversible action on storeoperated calcium entry channels. Cell Calcium 2003;34(1):97-108.

13. Soulsby MD, Wojcikiewicz RJ. 2-Aminoethoxydiphenyl borate inhibits inositol 1,4,5-trisphosphate receptor function, ubiquitination and downregulation, but acts with variable characteristics in different cell types. Cell Calcium 2002;32(4):175-81.

14. Missiaen L, Callewaert G, De Smedt H, Parys JB. 2 -minoetho- xydiphenyl borate affects the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, the intracellular Ca²⁺ pump and the non-specific Ca²⁺ leak from the non-mitochondrial Ca²⁺ stores in permeabilized A7r5 cells. Cell Calcium 2001;29(2):111-6.

15. Bilmen JG, Wootton LL, Godfrey RE, Smart OS, Michelangeli F. Inhibition of SERCA Ca²⁺ pumps by 2-aminoethoxydipheny borate (2-APB). Eur J Biochem 2002;269(15):3678-87.

16. Kalinec GM, Webster P, Lim DJ, Kalinec F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol Neurootol 2003;8(4):177-89.

17. Ricci AJ, Gray-Keller M, Fettiplace R. Tonotopic variations of calcium signalling in turtle auditory hair cells. J Physiol 2000;524 pt 2: 423-36.

18. Bootman MD, Collins TJ, Mackenzie L, Roderick HL, Berridge MJ, Peppiatt CM. 2-Aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) is a reliable blocker of store-operated Ca²⁺ entry, but an inconsistent inhibitor of InsP3-induced Ca²⁺ release. FASEB J 2002;16(10):1145-50.