교신저자：전창호, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 진단검사의학과교실
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서     론

   후두의 전암성 병변은, 문질러서 탈락되지 않는 백색의 상피 병변을 일컫는 임상적인 용어, 즉 백반증과 혼용되어 사용되고 있는데, 세계보건기구(WHO)에서는 이를 과다형성증(hyperplasia), 각화증(keratosis), 경도, 중도, 고도 이형성증(mild, moderate, and severe dysplasia), 상피내암종으로 분류하였다.¹⁾ 이형성증의 정도가 심해질수록 종양 전환(tumor transformation)의 위험성이 높아지는데, 과다형성증, 각화증, 경도 이형성증은 3~10%의 빈도이지만 중도 및 고도 이형성증은 13~25%의 빈도로 그 위험성이 보고되고 있다.²⁾ 이러한 종양 전환은 여러 단계의 유전적 변화들이 축적되어 나타나는 것으로 이해되고 있는데, 이것을 예측할 수 있는 생체지표(biomarker)에 대한 연구가 진행되어 왔다.^1,3,4,5,6)
   Melanoma antigen gene(MAGE)는 악성 흑색종 세포주에서 세포독성 림프구에 의해 인지되는 항원의 합성을 지령(code)하는 유전자로서,⁷⁾ 폐,⁸⁾ 간,⁹⁾ 유방,¹⁰⁾ 및 두경부^11,12,13)의 여러 암 조직에서 발현되었다. MAGE의 기능은 잘 밝혀지지 않았지만 배아발달, 종양 전환, 종양 진행에 관계하는 것으로 생각되고 있다.¹⁴⁾ 특히 MAGE는 여러 악성 세포에서 발현되지만 고환, 태반을 제외한 정상 세포에서는 발현되지 않는다고 알려져 있다.^7,14) 그러므로 MAGE가 후두의 전암성 병변에서 종양 전환을 예측하는 생체지표로서 유용할 것이라는 가정을 할 수 있다. 본 연구에서는 후두의 양성, 전암성, 악성 상피병변에서 MAGE의 발현양상을 살펴보고 생체지표(biomarker)로서의 유용성을 평가하여 그 임상적 적용가능성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2005년 1월부터 2006년 1월까지 대구가톨릭 의료원에서 후두 미세수술을 시행한 환자 중 양성질환 34명과, 전암성 병변 20명과, 악성 병변 22명의 병변에서 채취한 신선 조직과, 정상대조군으로 편도적출술을 시행한 12명의 전구개궁에서 채취한 정상점막의 신선 조직을 대상으로 하였다. 후두의 양성질환은 폴립 또는 결절 27명, 유두종 7명이었고, 전암성 병변은 과각화증 15명, 이형성 5명이었고, 악성 병변은 22명 모두 후두 편평상피암이었다.

조직의 채취와 보관
   후두병변의 경우 미세기구(겸자와 가위)를 이용하여 조직을 채취하였고, 정상대조군의 경우 편도적출 시 전구개궁에 절개한 후 일부 점막을 가위를 사용하여 조직을 채취하였다. 얻어진 조직의 대부분은 병리검사를 위해 보존하였고, 약 1×1 mm 크기의 조직 일부를 분리하여 Trizol 시약(GIBCO BRL, USA) 1 ml가 들어 있는 1.5 ml 시험관에 즉시 주입하여 검사당일까지 영하 20℃에서 보관하였다. 이때 후두병변에서 채취한 조직이 충분히 크기 않을 경우 모든 조직을 병리 검사를 위해 보존하였고 본 연구 대상에서 제외하였다.

RNA의 분리
   Trizol 시약이 담겨있는 검체에서 RNA의 분리는 GIBCO 사에서 제시한 방법을 따랐다. 즉 chloroform을 첨가하여 혼합한 다음 원심하여 단백질을 제거하고 상층액에 isopropyl alcohol을 주입하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA는 DU 50 spectrophotometer(Beckmann, USA)를 이용하여 RNA 농도와 순도를 확인하였다.

Nested RT-PCR
   역전사(reverse transcription) 반응을 위해 50 mM Tris-HCL, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 250 μM dATP, 250 μM dCTP, 250 μM dTTP, 250 μM dGTP, RNase inhibitor(0.75 U/μl), MMLV reverse transcriptase(5 U/μl), 2.5 μM Oligo dT primer와 1 μg denatured RNA를 포함한 반응액 20 μl를 만든 후 42℃에서 60분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
   1차 PCR 반응을 위해 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dTTP, 200 μM dGTP, 0.6 U Taq DNA polymerase, 0.5 μM sense primer, 0.5 μM antisense primer와 역전사 반응 산물 2 μl를 혼합하여 반응액 20 μl를 만들었다. 이 반응액을 95℃에서 30초, 60℃에서 45초, 72℃에서 45초간 30 cycle 반응시키고 최종적으로 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR을 시행하였다. 1차 PCR 산물 1 μl로, primer만 다르고 나머지 조건은 1차 PCR과 같게하여 nested PCR을 시행하였다. Sense primer와 antisense primer를 조합하여 MAGE A1에서 MAGE A6 유전자의 발현을 동시에 검출하였다. 이때 GAPD(gly-ceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase)를 함께 증폭하여 RNA 손상여부를 확인하였다. 증폭이 끝난 산물은 5 μl씩 혼합하여 1% agarose gel에서 전기영동하여 확인하였다(Fig. 1).
   PCR에 사용된 primer는 MAGE 유전자의 검출률을 증가시키기 위해 고안된 것으로서 다음과 같다：1차 PCR시 sense primer는 5'-CTGAAGGAGAAGATCTGCC-3', antisense primer는 5'-CTCCAGGTAGTTTTCCTGCAC-3'이고, nested PCR시 sense primer는 5'-CTGAAGGAGAAGATCTGCCWGTG-3'(W=A or T), antisense primer는 5'-CCAGCATTTCTGCCTTTGTGA-3'였다.^15,16)

통계처리
   대상에서 MAGE A 유전자 발현의 통계학적 유의성에 대하여서는 Chi square test를 사용하였고, p<0.05일 때 통계학적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

결     과

   후두의 여러 상피질환에서 MAGE A1-6 유전자의 mRNA 발현은 후두의 양성병변에서는 34예 중 12예(35.3%), 전암성 병변에서는 20예 중 10예(50.0%), 악성 병변에서는 22예 중 18예(81.8%)에서 양성으로 판정되었고, 세가지 병변을 동시에 비교하였을 때 MAGE A1-6 유전자의 발현은 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p=0.003). 전구개궁의 정상점막은 12예 중 1예(8.5%)에서 양성으로 판정되었다(Table 1).
   악성 병변 22예에서 MAGE A1-6 유전자 발현이 T 및 N 병기에 따른 통계적 차이를 보이지 않았으나, T3 이상 또는 N1 이상 5예에서는 모두 양성으로 판정되었다(Table 2).

고     찰

   두경부 암에서 종양 전환에 대한 생체지표에 관한 많은 연구가 있어왔다. 후두의 재발하는 전암성 병변에서 여러 번 조직검사를 시행한 연구에서는 이형접합의 소실(loss of heterozygosity)와 종양 전환과의 관계를 밝히고, 특히 이 분자적 변화가 침윤암의 발생 오래 전에 미리 포착될 수 있음을 시사하였다.³⁾ 후두의 양성, 전암성, 악성 병변의 망막아세포종 유전자(Retinoblastoma gene) 산물의 발현이 유의한 차이를 보였음을 밝힌 연구와,⁴⁾ 그 외 구강의 백반증에서 P53, 표피성장인자(epidermal growth factor), 이형성상피의 DNA 양, telomerase 활성도 등이 종양 전환의 분자 생체지표로 유용하다는 연구를 찾아 볼 수 있다.^5,6) 하지만 아직까지는 어떤 병변이 악성으로 전환될 것인가를 예측할 수 있는 신뢰할 만한 방법이나 지표가 없다.
   MAGE 유전자는 염색체에 존재하는 위치에 따라 MAGE A, B, C, D 등의 아군으로 분류된다. MAGE A는 적어도 12개 이상의 유전자로 구성되며 chromosome Xq28에 존재한다.¹⁴⁾ MAGE A 유전자는 흑색종뿐만 아니라 두경부, 폐, 간, 유방, 대장 등의 암 조직에서 발현한다.^{7,8,9,10,11,12,13)} 두경부암에서 MAGE 발현에 관한 연구에는 동결 신선 조직의 면역조직화학적 염색으로 MAGE A3가 45% 발현하였다는 보고와¹³⁾ 그 외 MAGE A가 암 특이적으로 27~47% 빈도로 발현하였다는 보고가 있다.^11,12)
   Lee 등¹⁵⁾과 Park 등¹⁶⁾은 MAGE 발현의 검출률을 높이기 위해 MAGE A1에서 MAGE A6까지의 유전자를 한번에 검출할 수 있는 공통시발체를 고안하여 두경부 편평세포암종의 70.4%에서 적어도 하나의 MAGE A 아형이 관찰되므로, MAGE를 발현하는 암 진단에 유용한 방법을 제시하였다. Lee 등¹⁷⁾은 이 공통시발체를 이용하여 두경부 암환자의 객담에서 MAGE A가 76.3%에서 발현하였으며, 높은 민감도와 특이도를 보였다고 하였다. 그 외 유방암 환자의 말초혈액이나 폐암환자의 객담에서도 이 공통시발체를 이용한 MAGE 검출이 암의 진단과 진행 경과판정에 유용하였다는 보고가 있다.^9,10)
   본 연구에서는 후두의 양성, 전암성 및 악성 상피병변 및 정상 구인두 점막에서 공통시발체를 이용하여 MAGE A1-6 발현의 차이를 확인할 수 있었다. 즉 정상 점막에서 악성으로 진행할수록 MAGE의 발현이 통계적으로 유의하게 많았다. 이 결과는 자궁 경부의 상피에서 공통시발체를 이용한 검사에서 MAGE가 경도의 이형성에서는 12.3% 발현하였고, 고도의 이형성에서는 73.9%, 침윤암에서는 90.9% 발현하여, MAGE가 자궁경부 조직이 침윤암으로 이행하는 것을 예측 혹은 진단하는데 유용하다고 한 보고와 유사하였다.¹⁸⁾ 이상의 결과는 MAGE 유전자의 발현이 후두 상피의 종양 전환에 적극적인 역할을 함을 시사한다고 할 수 있다.
   본 연구에서는 구인두 정상점막 및 후두의 양성 병변에서도 MAGE의 발현이 8.5%와 35.3%에서 관찰되었는데, 이것은 여러 연구에서 MAGE A 유전자는 고환, 태반 이 외의 정상조직에는 발현하지 않고 여러 종류의 암에서만 발현하여 종양 특이 항원으로 밝혀진 사실과는^7,14) 부합하지 않는 소견이었다. 본 연구에서 비 종양조직에서도 MAGE가 발현한 원인은 첫째, 검사방법의 차이가 원인이라고 생각된다. 이전의 연구결과는 조직에서 단회 중합효소 연쇄반응법을 많이 사용하였고,¹⁹⁾ 본 연구에서는 이중 중합효소 연쇄반응법을 시행하였다. 이중 중합효소 연쇄반응법은 단회 반응법에 비하여 민감도가 많이 증가하여 MAGE를 발현하는 세포가 소량으로 혼재된 경우 발현율에 차이가 날 수 있다. 저자들이 조직을 대상으로 이중 중합효소 연쇄반응법을 사용한 이유는, 선행연구^9,10)에서 객담, 혈액 등을 대상으로 MAGE 발현 연구에 이중 중합효소 연쇄반응법을 사용하였는데, 동일한 실험조건하에서 조직내의 MAGE 발현 여부를 확인하고자 하였기 때문이다. 하지만 전암성 병변을 포함한 결절, 폴립, 유두종 등 후두의 양성 병변에서 MAGE 발현 여부를 확인한 다른 연구는 찾아보기 어려워, 발현율의 차이를 검사방법의 차이라고만 단정하기는 어려운 실정이다. 둘째, 악성 종양 조직에서 MAGE 유전자의 발현은 촉진부(promotor region)의 demethylation에 의한 것이며, 정상 조직에서 MAGE 유전자가 발현하지 않는 것은 hypermethylation에 의한 것인데, 이러한 methylation 과정은 종양발생 전단계에서 가역적으로 이루어진다고 이해되고 있다.²⁰⁾ 따라서 본 연구에서 비 종양조직에서도 MAGE가 발현한 원인이 염증부위에 인접한 정상조직이나 양성종양에서 MAGE 유전자의 demethylation이 발생하였기 때문이라고 생각할 수도 있다. 셋째, 연구 과정상의 오류로 인한 위양성의 가능성도 완전히 배제할 수는 없을 것이다.
   본 연구에서 전암성 병변의 MAGE 발현율은 전체적으로 50%였지만, 각화증은 53.3%였고, 이형성은 40%였다. 이 결과는 이형성이 심할수록 종양 전환의 위험이 높아지므로 MAGE의 발현도 높을 것이라는 예상과는 일치하지 않았다. 하지만 이형성의 검체수가 많아지면 차이가 없거나 이형성에서 발현율이 높아 질 것이라고 예상된다. 본 연구에서 악성 병변의 MAGE 발현율은 병기에 따른 유의한 차이를 보이지 않았는데, 유방암의 말초혈액의 MAGE 발현은 원발암의 크기 및 병기와 유의한 관계가 있었다고 하였고,¹⁰⁾ 두경부암 조직 및 객담의 MAGE 발현은 병기와의 연관성이 없었다고 하여서^13,17) 보고된 연구에 따라 차이를 보였다.
   본 연구는 후두의 여러 병변, 특히 전암성 병변에서 MAGE 발현에 관하여 국내외를 포함해서 처음으로 시행되었다. 공통시발체를 이용한 MAGE 유전자의 발현은 후두 상피가 악성종양으로 변환하는 것을 예측하거나 악성종양의 진단에 응용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 본 연구에 포함된 증례, 특히 전암성 병변의 장기적인 추적 관찰은 MAGE 유전자의 생체지표로서의 유용성을 보다 정확히 평가할 수 있을 것이다.

1. Johnson FL. Management of advanced premalignant laryngeal lesions. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2003;11(6):462-6.

2. Blackwell KE, Calcaterra TC, Fu YS. Laryngeal dysplasia: Epidemiology and treatment outcome. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104(8):596-602.

3. Califano J, Westra WH, Meininger G, Corio R, Koch WM, Sidransky D. Genetic progression and clonal relationship of recurrent premalignant head and neck lesions. Clin Caner Res 2000;6(2):347-52.

4. Ioachim E, Assimakopoulos D, Agnantis NJ, Peschos D, Zissi A, Skeva A. Altered patterns of retinoblastoma gene product expression in benign, premalignant and malignant epithelium of the larynx: An immunohistochemical study including correlation with p53, bcl-2 and proliferating indices. Anticancer Res 1999;19(1A):541-5.

5. Sood S, O'Hara J, Quraishi MS. The significance of oral leukoplakia. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg 2002;10:80-4.

6. Tae K, Ahn MJ, Lee HS, Park BJ, Ahn KS. Telomerase activity in oral leukoplakia tissues. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 1999;42(1):82-7.

7. Van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, Van den Eynde B, et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 1991;254(5038):1643-7.

8. Jheon S, Hyun D, Lee SC, Yoon GS, Jeon CH, Park JW, et al. Lung cancer detection by a RT-nested PCR using MAGE A1-6 common primers. Lung Cancer 2004;43(1):29-37.

9. Yamashita N, Ishibashi H, Hayashida K, Kudo J, Takenaka K, Itoh K, et al. High frequency of the MAGE-1 gene expression in hepatocellular carcinoma. Hepatology 1996;24(6):1437-40.

10. Kwon S, Kang SH, Ro J, Jeon CH, Park JW, Lee ES. The melanoma antigen gene as a surveillance marker for the detection of circulating tumor cells in patients with breast carcinoma. Cancer 2005;104(2):251-6.

11. Eura M, Ogi K, Chikamatsu K, Lee KD, Nakano K, Masuyama K, et al. Expression of the MAGE gene family in human head-and-neck squamous-cell carcinomas. Int J Cancer 1995;64(5):304-8.

12. Lee KD, Eura M, Ogi K, Nakano K, Chikamatsu K, Masuyama K, et al. Expression of the MAGE-1, -2, -3, -4 and -6 genes in non-squamous cell carcinoma lesions of the head and neck. Acta Otolaryngol 1996;116(4):633-9.

13. Lee KD, Jo YK, Kim SG, Lee KS, Choi CY, Lee JH. Expression of MAGE 3 gene product in squamous cell carcinoma of the head and neck. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 1998;41(10):1296-303.

14. Barker PA, Salehi A. The MAGE proteins: Emerging roles in cell cycle progression, apoptosis, and neurogenetic disease. J Neurosci Res 2002;67(6):705-12.

15. Lee KD, Lee CS, Lee HH, Lee YS, Chang HK, Jeon CH, et al. Experimental studies on the significance of new MAGE common primers detecting MAGE 1-6 mRNA in head and neck cancers. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 2001;44(7):736-43.

16. Park JW, Kwon TK, Kim IH, Sohn SS, Kim YS, Kim CI, et al. A new strategy for the diagnosis of MAGE-expressing cancers. J Immunol Methods 2002;266(1-2):79-86.

17. Lee KD, Son SH, Moon HS, Lee YS, Chung H, Kim JY, et al. Significance of MAGE A1-6 mRNA Expression in sputa of the head and neck cancer patients-a preliminary report. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 2003;46(12):1070-6.

18. Koh SB, Choi YS, Park JB, Jeon CH, Lee TS. The relationship between the expression of common MAGE gene productions and the infection of human papilloma virus 16, 18 type in the cervical swabs from the patients of cervical neoplasia. Korean J Obstet Gynecol 2003;46(12):2466-72.

19. Jang SJ, Soria JC, Wang L, Hassan KA, Morice RC, Walsh GL, et al. Activation of melanoma antigen tumor antigens occurs early in lung carcinogenesis. Cancer Res 2002;61(21):7959-63.

20. Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: How the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 2003;33 Suppl:245-54.