교신저자：최종철, 320-718 대전광역시 서구 가수원동 685번지  건양대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 600-9215 · 전송：(042) 543-8959 · E-mail：entcjc@mdhouse.com

서     론

   비즙(nasal secretion)은 비강 내에 존재하는 모든 분비물로 비강과 부비동의 점막상태를 반영하는 결과물로서 다양하게 연구되고 있으며, 구성하고 있는 세포들의 조성과 화학매개체의 영향 그리고, 최근에는 각종 단백질을 정성적 혹은 정량적으로 분석하는 연구가 보고되고 있다.^1,2)
   비즙을 구성하는 단백질은 주로 점막하 분비선이나 혈장으로부터 기원하는데, 점막하 분비선에서 분비되는 단백질 중에서 분비형 IgA(secretory IgA, sIgA), 락토페린(lactoferrin)은 점막하 분비선의 지표로서 강력한 항균작용 및 비점막의 보호 작용에 중요한 역할을 하며, 혈장으로부터 기원한 주요 단백질은 알부민, 면역글로불린, 그리고 비(非)분비형 IgA(non-secretory IgA, nsIgA) 등으로 구성되어 비점막의 방어기전에 관여한다.^1,2,3)
   비즙은 여러 가지 물리적, 화학적, 염증성 매개물질에 의하여 비점막에서 분비되는 것으로 혈관투과성의 변화, 점막하 분비선의 분포와 분비조건에 의하여 다양한 조성을 가진다.⁴⁾ 즉, 비즙의 단백질 조성의 변화가 비점막의 변화와 상태를 나타내는 지표로 삼을 수 있으며 다양한 병적조건이나 환경에 의하여 정상 비점막으로부터 분비되는 비즙의 성상과는 다른 구성을 보인다.^5,6) 따라서, 이러한 비즙의 변화가 비점막 질환의 원인과 결과로 여겨지며 비즙의 성상을 분석함으로서 진단과 치료에 유용한 정보를 얻을 수 있다.^7,8)
   만성 비점막 질환은 조직학적으로 점막하 분비선의 증가와 배세포(goblet cell)의 수적인 변화 등으로 인하여 비강 내 분비물이 많아지게 되어 결과적으로 비정상적인 비즙증가의 임상양상으로 나타난다.^9,10,11) 그러나, 임상적으로 흔하게 접하는 만성 비부비동염과 알레르기 비염의 비즙 내 단백질 조성분석과 정상 비점막의 비즙 단백질 조성과의 비교 그리고 기존에 연구 보고된 락토페린과 분비형 IgA에 대한 임상에서의 접근과 비즙 단백질을 이용한 비점막 상태의 진단과 치료에 도움이 되는 연구는 미비한 실정이다.
   본 연구에서는 임상에서 흔히 접하고 있는 만성 비점막 질환인 만성 비부비동염, 알레르기 비염 등에서 점막하 분비선의 분비지표로서 많은 연구가 이루어진 락토페린과 분비형 IgA를 이용하여 만성 비점막 병변에서 비분비 단백질의 임상적 유용성과 적용을 연구하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2003년 9월부터 2005년 8월까지 본원을 내원한 연구 대상군과 정상 대조군을 대상으로 하였다.

정상 대조군(Group 1)
   정상 대조군은 비흡연자로서 비즙채취 8주 전까지 투약병력이 없으며, 과거력 상에서 코증상과 코질환으로 진료 및 치료를 받은 병력과 알레르기 비염의 가족력이 없으며, 비내시경 소견 상 정상으로 보이는 사람들을 대상으로 하였다. 연령분포는 20세에서 58세로 평균연령은 28.4세였고 남자는 12명, 여자는 8명으로 총 20명이었다(Table 1).

만성 비부비동염 환자군(Group 2)
   비흡연자로서 코막힘, 화농성 콧물, 후비루 등의 만성적인 코증상이 최소 3개월 이상 있었고, 병원방문 8주 전까지 진료 및 치료병력이 없었으며, 비내시경 소견에서 비용종이 관찰되지 않고, 만성 비부비동염의 소견을 보이며 방사선학적인 검사 상에서도 만성 비부비동염의 소견을 보인 환자를 대상으로 하였다. 연령분포는 16세에서 68세로 평균연령은 36.9세였고 남자는 11명, 여자는 9명으로 총 20명이었다(Table 1).

알레르기 비염 환자군(Group 3)
   비흡연자로서 3개월 이상의 코막힘, 가려움증, 콧물, 재채기 등의 알레르기 비염의 증상이 있고 집먼지 진드기(D. pteronyssinus, D. farinae)에 대한 피부반응검사에서 양성이며, 총 혈청 IgE가 100I U/ml 이상이고, 집먼지 진드기에 대한 비유발 검사에서 양성의 결과를 보이며, 집먼지 진드기에 대한 radioallergosorbent test(RAST)에서 양성으로 나온 환자들을 대상으로 하였다. 연령분포는 15세에서 54세로 평균연령은 31.2세였고 남자는 9명, 여자는 11명으로 총 20명이었다(Table 1).

만성 비부비동염의 치료 대상군(Group 4)
   비흡연자로서 본원에서 환자의 병력과 증상, 비내시경 소견과 방사선학적인 검사에서 만성 비부비동염의 진단을 받고 약물투여의 치료를 받으며 경과관찰을 하였던 환자들로, 최소한 8주 이상 비증상이 없고 비내시경 검사 상에서 정상으로 확인된 환자들을 대상으로 하였다. 연령분포는 15세에서 62세로 평균연령은 36.0세이었고 남자는 10명, 여자는 10명으로 총 20명이었다(Table 1).

방  법

비즙의 채취
   비즙의 채취는 여과지 흡착법(filterpaper method)을 이용하여 시행하였다. 5×50 mm 크기의 여과지(Whatman No. 50, Maidston, England)를 일측 비강의 측벽에 위치시키고 10분 후에 여과지를 채취하였다. 채취한 여과지를 100 μl의 완충용액(phosphate buffered saline, PBS 0.2 mol, pH 6.5)(Sigma, St. Louis, MO)으로 채워진 시험관에 넣어 연구에 이용하였다.

비즙의 처리
   시험관에 넣어진 여과지를 꺼내어 4∼5조각으로 절단한 후 다시 시험관에 넣어 15분간 혼합기를 이용하여 혼합한 후에 1,500 rpm으로 20분간 원심분리를 한 후 피펫을 이용하여 종이에서 나온 용액을 채취하여 에펜도르프관에 옮겨 넣었다.
   조각난 여과지가 남아있는 시험관에 100 μl의 완충용액(pH 6.5)을 다시 채운 후 같은 조작을 하여 생긴 용액을 에펜도르프관에 추가하여 옮겨 넣은 후 -70℃에 보관하였다.

효소결합 면역흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay method, ELISA)을 이용한 락토페린의 측정
   완충용액(pH 7.3)으로 충전된 polystyrene microtiter plates(Corning, New York, USA)에 1：10,000의 농도로 희석된 100 μl의 mouse monoclonal anti-human lactoferrin(Sigma, St. Louis, MO)을 채운 후 37℃에서 2시간동안 배양하였으며, 사람 면역글로불린(human immunoglobulin(Bethyl, Texas, USA))으로 세척하고, 융합한 후에 37℃에서 1시간 동안 반응시켜, 4℃에서 12시간 이상 배양하였다.
   이후에 PBS-T-BSA(PBS with 0.1% Tween 20 and 0.02% bovine serum albumin(BSA))(Sigma)와 비즙 시료를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
   일차항체로서 PBS-T-BSA로 1：10,000 농도로 희석된 200 μl의 rabbit anti-human lactoferrin antibody(Sigma)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며, 이차항체로서 PBS-T-BSA로 1：10,000 농도로 희석된 goat-anti rabbit IgG-HRP(horseradish peroxidase)(Sigma)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였으며, peroxidase의 활성을 위하여 0.6 ml의 염색 혼합물(4 mg TMB in 1 ml DMSO, pH6.0 10 ml citric buffer, 1.2 μl 30% H₂O₂)을 추가하여 빛이 차단된 실온에서 30분 동안 배양시켰다. 반응의 중단은 100 μl의 2 M H₂SO₄를 사용하였으며, ELISA 판독기(Bio-Rad, 550, Japan)로 450 nm와 630 nm에서 흡광 측정하였다.

효소결합 면역흡착법을 이용한 분비형 IgA의 측정
   완충용액으로 충전된 polystyrene microtiter plates에 1：10,000의 농도로 희석된 100 μl의 mouse monoclonal anti-human sIgA(Sigma)를 채운 후 37℃에서 2시간 동안 배양한 후에 0.1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)(Sigma)을 첨가하여 0.1% Tween 20을 포함한 PBS로 세척하고 차단한 후에 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 4℃에서 12시간 이상 배양하였다. 이후에 PBS-T-BSA(PBS with 0.05% Tween 20)와 비즙 시료를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
   일차항체로서 PBS-T-BSA로 1：10,000 농도로 희석된 200 μl의 rabbit anti-human sIgA antibody(Sigma)를 이용하여 상기의 락토페린과 같은 방법으로 측정하였다.

통계학적 분석
   본 연구를 위한 4개의 군은 각 20명씩으로 연구 집단별 락토페린과 분비형 IgA, 분비형 IgA/락토페린 비율의 차이를 비교하기 위하여 연령을 보정한 후 공변량 분석(ANCOVA)을 통하여 분석 적용하였다. 모든 분석의 유의수준은 α=.05이다.

결     과

락토페린의 측정치
   연구 집단별 락토페린의 측정치는 평균값에 있어서 만성 비부비동염군의 락토페린의 수치(505.43 μg/ml)가 가장 높았으며 다음으로 알레르기 비염군(364.03 μg/ml), 만성 비부비동염 치료받은 대상군(321.81 μg/ml), 정상 대조군(230.07 μg/ml)의 순으로 측정되었으며 연구 집단인 네 군 간의 락토페린의 측정치는 통계학적으로 유의성을 보였다(p<0.05)(Fig. 1).

분비형 IgA의 측정치
   연구 집단별 sIgA의 측정치는 평균값에 있어서 만성 비부비동염군의 분비형 IgA의 수치(688.38 μg/ml)가 가장 높았으며 다음으로 만성 비부비동염으로 치료받은 군(635.94 μg/ml), 알레르기 비염군(562.13 μg/ml)), 정상 대조군(435.39 μg/ml))의 순으로 측정되었으며 연구 집단인 네 군 간의 분비형 IgA의 측정치는 통계학적으로 유의성을 보였다(p<0.05)(Fig. 2).

분비형 IgA/락토페린 비율의 측정치
   연구 집단별 분비형 IgA/락토페린 비율의 차이는 정상 대조군의 수치(2.24)가 가장 높았으며 만성 비부비동염의 치료군(2.05), 알레르기 비염군(1.55), 만성 비부비동염군(1.38)의 순으로 분비형 IgA/락토페린 비율의 결과를 보였으며 연구 집단인 네 군 간의 분비형 IgA/락토페린의 측정치는 통계학적으로 유의성을 보였다(p<0.05)(Fig. 3).

고     찰

   비점막은 호흡기점막의 일부로서 위증층 원주섬모상피, 점막하 고유층, 그리고 기저막으로 구성되며, 점막하 고유층은 장액선, 점액선의 선조직과 혈관 등으로 구성되며 선 조직은 도관으로 상피층과 연결되어 비강점막으로 분비물을 분비하게 되며 주로 부교감 신경의 신경조절을 받는다.¹²⁾
   비즙은 호흡기 분비물로서 비강점막 고유층의 분비선인 장액선과 점액선, 그리고 비강 점막상피층의 배세포의 분비로 구성되는 국소적인 기원과 혈관으로부터의 혈장 투과, 그리고 비점막 상피층의 이온과 수분의 투과력 등의 전신적인 기원 등의 다양한 기원으로부터 생성되어 95%의 수분, 당단백질, 당, 아미노산, 1∼3%의 단백질과 1∼2%의 전해질 등으로 구성되며, 비즙의 점도를 좌우하는 점소의 경우는 점액선과 배세포에서 분비하는 산성의 성분인 sialomucin과 sulphomucin의 조성에 의하여 결정되며, 장액선은 fucomucin, 락토페린, lysozyme, 그리고 분비형 IgA 등의 단백질과 면역 글로불린을 분비하게 되어 결과적으로 비점막은 서로 다른 환경과 자극에 의하여 다양한 기원의 산물인 비즙의 양과 조성이 변화하게 된다.^13,14) 따라서 이러한 비즙의 다양한 기원과 특성으로 인하여 비점막의 상태를 나타내는 지표로서 비즙에 대한 연구들이 발표되고 있다.
   비점막내 분비선의 대표적인 단백질인 분비형 IgA, 락토페린과 lysozyme은 콜린성 자극조절과 미각 반사에 의하여 분비되며, 강력한 항균작용과 비특이적인 면역반응의 중요한 역할을 함으로서 비점막을 보호한다.^5,6,8) 특히, 분비형 IgA는 혈장 단백질로부터 분비된 주요 면역글로불린인 IgA로부터 기원하는데 이합체(dimeric) IgA의 형태로 혈장에서 표현되어 선주위의 결체조직으로 흡수, 여과되어 점막하 분비선인 장액선의 표면에 있는 특이적인 면역글로불린의 수용체와 결합하며, 이중에서 80% 정도가 분비형 IgA로서 비점막 분비선에서 발현되어 특이적 면역 보호 작용에 중요한 역할을 한다.^13,14)
   비점막의 장액선에서 주로 분비되는 락토페린은 80 kd의 질량을 가진 단백질로서 호중구 과립에서 발견되기도 하지만 주로 상부 및 하부 호흡기의 점막하 분비선의 장액선에서 생성되어 분비되며 철결합 당단백질로서 세균의 성장과 증식에 필요한 철성분과 결합하여 세균의 성장과 증식을 저해함으로서 항균작용을 나타낸다. 그러므로 생체내외에서 호흡기점막의 상태 및 질환을 추정할 수 있는 점막하 분비선의 측정 지표 및 분비 지표로서 분비형 IgA와 락토페린에 대한 많은 연구가 이루어졌다.^15,16)
   또한, 비즙 단백질의 조성과 분비는 비점막이 놓여진 환경과 자극에 의해서 변화하므로 비즙 단백질의 조성과 변화를 측정함으로서 비점막의 병적 상태를 추측할 수 있는 객관적 지표로서의 의미가 있다.^17,18)
   비즙의 구성과 변화를 연구하는데 있어서 비즙은 다양한 세포들과 단백질, 무기질과 화학매개체로 구성되어 있어서 비즙을 이용한 연구에 있어서 비즙의 채취방법의 결정은 중요한 사항이다.
   최근에는 비점막으로부터 비즙을 흡착하는 방법으로 솜이나 천, 필터 여과지 띠 혹은 원반, 그리고 폴리우레탄 포말, 수술용 셀룰로오스 스폰지 등과 같은 화학성 매질을 이용한 방법이 소개되어 널리 사용되고 있다. 이러한 방법은 비즙을 동등한 조건하에서 비즙의 양에 영향을 받지 않고 채취할 수 있으며 비점막으로부터 비즙을 검출할 수 있기에 특히, 비즙의 단백질 채취와 분석에서 있어서 다른 방법보다도 많은 양의 단백질 검출이 가능하며, 검사간의 오차도 가장 적은 것으로 알려져 있다.^19,20) 본 연구에서도 위와 같은 단백질 검출과 연구에 가장 안전하고 적합한 여과지 흡착법을 이용하여 비즙의 락토페린과 분비형 IgA의 단백질을 검출하여 연구에 이용하였다.
   임상에서 비교적 흔히 접할 수 있는 만성 비부비동염과 알레르기 비염 등은 비점막에 발생하는 만성 비점막 질환으로 코막힘과 더불어 비즙의 분비량이 증가되는 임상 증상 등을 볼 수 있는데, 이러한 임상 양상은 비점막이 조직학적으로 기저세포막의 비후, 비정상적인 분비선의 출현, 염증세포의 침윤, 점막 상피하조직의 부종, 그리고 점막의 혈관생성 등의 변화의 결과로 비즙의 분비가 정상적인 비점막 보다도 많아지게 되어 결과적으로 비정상적인 비즙 증가의 임상 양상으로 나타난다.^9,10)
   본 연구에서 락토페린과 분비형 IgA의 절대 값의 측정에 있어서 정상 대조군과 비교하여 만성 비부비동염 군에서 통계학적으로 높게 측정되어 만성 비점막질환에서 진단지표로서의 유효성이 확인되었다.
   또한, 알레르기 비염 환자군의 경우에서도 정상대조군에 비하여 락토페린과 분비형 IgA의 측정 값이 통계학적으로 의미 있게 증가하는 만성 비점막질환의 양상을 보여, 임상에서의 유용성에도 도움이 될 것으로 추정된다.
   그러므로, 락토페린과 분비형 IgA가 만성 비점막 질환의 대표적인 지표로서 사용될 수 있다고 생각된다.
   특히, 본 연구에서는 분비형 IgA의 절대 값의 측정치 비교에서 정상 군을 제외한 세군에서 모두 높은 측정값을 보여 만성 비점막 질환의 지표로서의 유용성이 락토페린보다도 우수한 것으로 생각되며, 락토페린의 경우에는 만성 비부비동염 환자군에서 가장 높은 측정값을 보인 반면에 만성 비부비동염으로 진단되어 수술을 제외한 보존적인 치료로 임상증상, 진찰소견 상에서 정상으로 확인된 치료 대상 군에서는 측정값이 감소됨으로서 통계학적으로 유의한 차이를 보여, 분비형 IgA보다도 감염의 지표로서 좋은 결과를 나타내었다. 따라서 만성 비점막질환에서 분비형 IgA는 진단의 지표, 락토페린은 감염의 지표로서 유용하다고 생각된다.
   분비형 IgA와 락토페린의 측정치의 비율 값에서도 흥미 있는 결과를 얻었는데, 분비형 IgA/락토페린 측정치의 비율값(sIgA/lactoferrin ratio)은 만성 비부비동염군과 만성 비부비동염으로 항생제 등의 보존적 치료로 정상으로 확인된 치료 대상군에서 유의한 차이를 보였다. 이러한 결과는 감염된 만성 비점막질환의 치료과정에서 분비형 IgA는 비교적 일정한 측정치의 결과를 보인 반면에 락토페린은 낮은 측정치의 결과를 보여서 만성 비점막질환에서 감염의 지표로서 락토페린의 유용성과 더불어 분비형 IgA/락토페린의 측정치의 비율도 유용하다고 생각된다. 즉, 정상군에 비하여 유의하게 높은 분비형 IgA의 측정치로 만성 비점막질환을 진단할 수 있으며, 락토페린의 측정치를 포함한 비율 값으로 만성 비점막질환의 진단과 더불어 감염성의 여부도 고려할 수 있다고 생각된다.
   이러한 결과는 락토페린의 분비가 감소함으로서 생긴 결과로서 락토페린 분비의 기원이 점막하 장액선과 호중구 등의 기원^13,14,15)을 고려할 때, 만성 비부비동염 환자군과 치료 대상군의 분비형 IgA의 측정값은 비교적 높은 결과를 보이므로 장액선의 조직학적인 가역변화로 인한 분비감소의 결과로 추정하기 보다는 호중구에서 기원하는 락토페린에 영향을 줄 수 있는 요소인 혈관투과성의 변화, 비점막의 특이적 혹은 비특이적 국소면역의 변화, 전신적인 면역체계의 변화 그리고 락토페린 기원에 따른 시간별 분비양상의 변화, 그리고 비점막 분비선의 단백질 조성변화의 원인 등으로 저자들은 생각되며 이에 대한 비점막의 조직학적 검사, 전신적 면역변화의 검사 그리고 비즙 채취의 시간별 고려, 그리고 더욱 많은 대상에서의 확인이 필요하다고 생각된다.
   분비형 IgA의 만성 비점막질환의 높은 측정치의 결과는 조직학적으로 비점막의 점막하 선조직의 과증식, 장액선의 표면에 있는 특이적인 면역글로불린의 수용체의 증가, 그리고 혈관 투과현상의 증가 등으로 생각되며 비가역적 변화를 의미하는지에 대해서는 정상군을 포함한 연구대상군의 비점막의 분비선에 대한 조직학적 연구가 추가되어야 할 것이다.
   본 연구에서는 생체내외에서 호흡기 점막의 상태 및 질환을 추정할 수 있는 점막하 분비선의 측정 지표 및 분비 지표로서 많은 연구가 이루어진 분비형 IgA와 락토페린에 대한 임상에서의 의의를 고려한 바, 정상 비점막에서의 비즙 단백질의 조성과 임상에서 흔히 접할 수 있는 만성 비부비동염군과 만성 비부비동염의 치료군과의 비즙 단백질과의 비교, 그리고 정상 비점막과 알레르기 비염군에서의 비즙 단백질의 조성을 비교하여, 기존 연구 보고된 비즙 단백질의 임상적인 적용을 보고하는 바이며, 중요한 진단지표와 감염지표로서의 유용성을 고려하는 바이다.

결     론

   비즙은 비강내의 조건과 상태를 나타내는 호흡기 분비물로서 여러 기원에서 생성되어 다양한 조성을 이루고 있으며 비즙 내의 단백질은 비점막의 지표로서 유용하다. 특히, 코의 점막하 분비선의 단백질인 락토페린과 분비형 IgA는 임상에서 흔히 접할 수 있는 만성 비부비동염과 알레르기 비염 등의 진단 및 감염지표로서 임상에서 유용하게 사용될 수 있으며 추후에 많은 만성 비점막질환 예에서의 적용이 연구되어야할 것이다.

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