서     론

   비만세포는 1877년 Paul Ehrlich에 의해 세포질에 이염성 과립(metachromatic granule)을 가지는 세포로 처음 발견되었다.¹⁾ 비만세포의 어원은 breast를 뜻하는 희랍어인 "mastos"로부터 유래되었는데 이는 비만세포의 세포 내 과립들이 영양소를 함유하고 있다고 믿었기 때문이었다. 직경 6~12 um의 비만세포는 피부, 폐, 코점막, 장점막 등 여러 조직 내에 분포하는 세포로 호염기구나 호산구와 같은 다른 세포와 달리 정상적으로 말초혈액에는 거의 존재하지 않으며,²⁾ 성숙한 세포의 형태가 아닌 전구세포(progenitor)로서 골수에서 분비된다(Fig. 1). 즉, 비만세포는 주위환경자극에 따라 표현형이 바뀌게 되며 설치류나 사람 모두 조직특이적인 이질성(heterogeneity)을 나타낸다.^3,4,5) 좀 더 구체적으로 시험관내 연구에서 각기 다른 자극이나 약물학적인 억제에 대한 반응을 보면 종간, 조직간 차이가 존재한다. 따라서 알레르기 반응의 주요한 세포인 비만세포를 이해하고 연구하는 데 많은 어려움이 따른다. 
   알레르기 염증반응에 있어서 비만세포의 역할을 이해하기 위해서 이 논문에서는 비만세포 발달에 관여하는 조절인자, 비만세포 배양의 유용성과 실제에 대해 기술하고자 한다. 

비만세포 발달의 조절

   시험관내에서 CD34+ 골수세포로부터 인간 비만세포가 기원한다는 것이 발표되었고 골수이식을 받은 환자에서 198일까지 공여자의 비만세포가 발견된다는 보고가 있었다.^6,7) 이 결과들은 인간 비만세포도 조혈 전구세포(hematopoietic progenitor)에서 기원함을 암시한다. 
   인간 비만세포 발달에 있어서 간상세포인자(stem cell factor, SCF)는 필수불가결한 성장인자로 1990년 클로닝에 성공한 이후에 비만세포의 성장, 분화에 관한 연구의 획기적인 발전이 있었다.^8,9,10) 혈청이 결핍된 배양의 조건에서 간상세포인자는 단독적으로 CD34+ 제대혈액세포로부터 비만세포생산을 50주까지는 지속적으로 증가시켜 세포의 수를 1010까지 높일 수 있다.¹¹⁾ 또한 간상세포인자 100 ng/ml로 배양된 비만세포의 경우 10 ng/ml로 배양된 경우보다 더 크고 많은 양의 히스타민을 함유하여 간상세포인자는 인간 비만세포의 성장과 성숙에 있어서 중요한 자극원으로 결론지을 수 있겠다. 
   간상세포인자 이외에 여러 인자들이 비만세포의 발달을 촉진 혹은 억제하는 작용을 할 수 있다. IL-9은 Th2세포에서 생산, 분비되는 사이토카인으로 알레르기 면역반응에 관여하는 여러 가지 종류의 세포에 작용할 수 있으며,¹²⁾ CD34+ 제대혈액세포를 메틸셀룰로스 배지에서 배양했을 때 IL-9은 간상세포인자와 함께 비만세포 집락의 수와 크기를 증가시킨다. 또한 IL-9와 간상세포인자는 소아 천식환자의 CD34+ 말초혈액세포로부터 비만세포의 집락의 수를 정상군보다 의미 있게 증가시킴을 알 수 있었다.¹³⁾ 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)는 고친화성 수용체인 TrkA를 통해 간상세포인자와 함께 비만세포의 세포고사(apoptosis)를 억제하고 비만세포에서 chymase의 함유량을 증가시킨다.^14,15) 
   IL-3는 처음에는 Durand 등에 의해 마우스에서와 마찬가지로 간상세포인자와 IL-3의 조합이 CD34+ 제대혈액세포에서 인간 비만세포로 분화하는데 필요하다고 보고되었으나,¹⁶⁾ 혈청이 결핍된 배양에서 인간 비만세포를 생산하지 못한다는 상반된 보고도 있다.¹¹⁾ IL-4는 간상세포인자에 의해 발달한 비만세포의 수를 감소시키고,^17,18) 고친화 IgE 수용체(FcεRI), 세포간 접착분자-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)의 발현을 증가시킨다.^19,20)
IL-6와 간상세포인자는 간상세포인자 단독으로 배양한 군에 비해 세포크기를 증가시키고 chymase양성세포와 세포 내 히스타민의 양을 증가시킨다. 간상세포인자, IL-4와 IL-6를 함께 사용하였을 때는 세포성장을 억제하지만 세포 내 히스타민의 양을 증가시킨다. 
   Fetal bovine serum(FBS)을 함유한 배지와 혈청을 함유하지 않은 배지에서의 비만세포의 성숙, 분화의 차이는 많이 알려져 있는데 실제로 인간의 혈청이 CD34+ 제대혈액세포로부터 tryptase양성 비만세포의 성장을 억제한다. 특히 혈청 속에 2×10-6 M의 농도로 존재하는 retinol이 중요한 억제인자이다. 
   이상을 정리하여 보면 인간 비만세포의 성숙과 분화에 관여하는 인자들을 네 가지 유형으로 나눌 수 있는데 간상세포인자와 같이 성숙과 분화를 모두 촉진시키는 인자, IL-9과 같이 분화만 자극하는 인자, IL-4, IL-6와 같이 분화는 억제하고 성숙을 자극하는 인자, retinoid와 같이 성숙, 분화 모두 억제하는 인자들로 나눌 수 있다(Fig. 2). 

알레르기 염증반응에 있어서 비만세포 배양의 유용성

   배양된 마우스 비만세포로부터 여러 가지 사이토카인 분비가 처음 밝혀진 후 탈과립화에 의한 수용성 화학 인자들의 분비로 국한되었던 비만세포의 역할을 재조명하게 되었다.^21,22,23) 사람에서도 비만세포가 IL-4, IL-5, IL-6, 종양괴사인자를 분비하는 것이 증명되었고 특히 IL-4, 종양괴사인자는 활성화된 호산구에서 분비되는 VLA-4 integrin의 리간드인 맥관의 세포유착분자(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)의 발현을 혈관내피세포에서 증가시킴으로써 호산구 유입에 관여하여 후기 알레르기 염증을 유지시킨다.²⁴⁾ 이런 발견에도 불구하고 생기는 많은 의문점에 비만세포 배양이 해답을 줄 수 있을 것이다. 예를 들면, 비만세포 전구세포가 기도, 피부, 소장 등 특이조직으로 유입되게 만드는 국소환경들은 무엇인지, 미성숙한 비만세포는 완전히 분화된 표현형이 되기 전에 어떤 기능적인 작용을 하게 되는지, 비만세포에 의해 조직 내로 유입된 호산구, 호염기구에서 분비되는 사이토카인들이 어떤 역할을 하게 되는지 등등. 
   첫째로 배양과정 중 비만세포의 발달과정에서 비만세포 전구세포에 특이적인 표지자를 밝힘으로써 조직 내에서 전구세포를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 비만세포의 분화 과정 중에 접착분자(adhesion molecule)의 발현과 비만세포의 이동과 화학주성(chemotaxis)을 자극하는 인자들의 연구를 통해 비만세포가 조직으로 유입되는 기전을 이해할 수 있다.^25,26) 둘째로 시험관 내에서 여러 가지 수용성 성장 인자, 다양한 기질 단백질을 이용하여 다른 미세환경을 만듦으로써 생체 내 비만세포의 표현형을 얻는데 필요한 조건들을 조절할 수 있다. 또한 림프구 등 다른 세포와의 상호작용을 이해하는데도 비만세포 배양이 유용하다. 
   비만세포 배양은 얻어진 많은 수의 세포를 이용해 약물학적, 독성학적 연구를 하는데 도움이 된다. 비만세포의 탈과립화를 일으키는 여러 약물이나 물질들을 확인할 수 있고 항알레르기 염증작용을 가지는 새로운 신약의 효과를 입증하는데도 도움이 될 것이다.^29,30) 또한 대기오염물질 등 알레르기를 일으킬 수 있는 여러 가지 물질들이 직접적으로 비만세포에 영향을 주는 지도 확인할 수 있다. 

마우스 비만세포와 인간 비만세포

   알레르기와 면역학 연구에 있어서 마우스 모델은 눈부신 기술학적인 발전과 특정 경로를 차단하거나 knockout 마우스 모델을 이용하는 면역학적 방법을 통해 여러 면역결핍질환에 관여하는 유전자들을 밝히는 데 이용되었다. 하지만, 천식과 같은 알레르기 질환에 있어서 마우스 모델의 이용은 이견이 존재한다.^31,32) 동물실험에서 얻어진 결과가 사람에서는 임상적으로 나타나지 않는 경우가 있는데, 예를 들면 사람에 있어 anti-IL-5 antibody의 효과가 미미함을 들 수 있다.^33,34) 
   1981년 각기 다른 연구자들이 마우스 골수에서 배양한 비만세포에 대한 결과를 발표하였는데, 후에 이 중 가장 중요한 성장인자는 IL-3로 밝혀졌다. Galli는 이와 같은 마우스 비만세포 배양의 확립과 그것들이 어떻게 비만세포의 기원이나 발달에 대한 질문에 해답을 줄 수 있는지를 기술하였다.³⁵⁾ 
   마우스 골수세포에서 배양된 비만세포를 이용하여 세 가지 중요한 점을 발견할 수 있었는데 전구세포가 골수에 존재한다는 점, IL-3가 세포분화에 가장 중요한 인자라는 점, 비만세포의 표현형이 주위 환경자극에 따라 변한다는 점이다.³⁶⁾
   마우스 비만세포와 인간 비만세포의 사이토카인과 항알레르기 약물에 대한 각기 다른 반응이 보고된 바 있고,^37,38) Nakajima 등은 두가지 비만세포의 유전자발현을 비교하여 발표하였고 종간 비교 데이터베이스(interspecies comparison database)는 온라인에서도 확인할 수 있다(http://bio.mki.co.jp/en/results/comparativeDB/comparativeDB_index.html).³⁹⁾ 
   위의 결과를 보면 IgE 수용체에 의해 인간 비만세포나 마우스 비만세포를 자극했을 때 공통적으로 발현이 증가되는 사이토카인/케모카인 유전자는 다음과 같다: PYCS, CEACAM1, PHLDA1, CCL5, DTR, OLR1, GADD45B, IL-5, INHBA, RGC32, CSF1, TNF, RRAD, SERPINE1 (plasminogen activator inhibitor-1), RIL, MMP19, CCL4, IL3, CCL1(I-309). 인간 비만세포에서만 특이적으로 증가, 발현되는 유전자로는 PRG2(major basic protein)를 들 수 있다. 
   이를 통해서 마우스 비만세포를 이용한 연구를 인간에 적용하려면 인간 비만세포와 비슷하게 발현하는 마우스 비만세포의 유전자에 관한 연구만이 의미를 가질 것으로 생각된다. 

비만세포 아집단(subset) 특이 유전자

   제대혈액에서 배양된 비만세포는 tryptase, chymase, 히스타민의 발현이 조직 내 비만세포와 유사하다. 하지만, 조직 내 비만세포와 달리 FcεRI가 낮게 발현되어 간상세포인자, IL-3, IL-6에 의한 배양이 FcεRI발현을 나타내는 데 충분하지 않음을 보여준다.^16,19,40) 말초혈액에서 배양된 비만세포와 비교하여 보았을 때 말초혈액에서 배양된 비만세포가 높은 FcεRI발현과 함께 많은 히스타민 분비량을 나타낸다.⁴¹⁾ 
   제대혈액과 말초혈액으로부터 많은 수의 비만세포를 배양할 수 있게 되었고,⁴²⁾⁴³⁾ 발전된 microarray 기술을 이용하여 10⁵ 이상 되는 세포만 있으면 세포에 존재하는 유전자를 확인할 수 있게 되었다. Iida 등은 제대혈액의 비만세포 전구세포와 말초혈액의 비만세포 전구세포로부터 비만세포를 배양하여 유전자발현의 차이를 확인하였는데, 많은 차이점을 발견할 수 있었다.⁴⁴⁾ 
   Kashiwakura 등은 인간의 구개편도로부터 배양된 비만세포와 폐로부터 배양된 비만세포와의 비교를 통해 MIP-1α(CCL3), MIP-1β(CCL4)가 편도비만세포에서 특이적으로 발현되며 FcεRI 집합(aggregation)에 의해 TNF-α의 발현이 증가함을 보고하였다.⁴⁵⁾ CCL3와 CCL4가 T 림프구를 림프절로 유입시키는 작용을 가지고 있어 편도비만세포에 의해 편도선으로 T 림프구가 유입될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 편도비만세포에서는 chymase가 높게 발현됨을 알 수 있는데 조직특이적인 비만세포의 특징이 오랜 기간 배양 후에도 유지되는 것은 흥미로운 점이다.⁴⁶⁾ 피부로부터 배양한 비만세포가 오랜 기간 배양 후에도 substance P에 대한 반응도가 변하지 않는다는 보고도 이를 뒷받침한다.⁴⁷⁾ 
한편 Bradding 등은 피부로부터 배양한 비만세포가 폐, 제대혈액비만세포와 비교했을 때 다른 유형의 이온통로(ion channel)를 가짐을 보고하였다.⁴⁸⁾ 
   위의 결과들을 종합해보면 비록 주위의 미세환경에 의해 비만세포의 특성이 변화하지만 특정 조직에서 배양된 비만세포는 조직특이적인 비만세포의 특성을 배양조건하에서 상당히 오랜 기간 유지하는 것으로 생각된다. 과연 각 조직에 유입되는 비만세포 전구세포가 골수단계에서 어떤 조절을 거쳐 미리 결정된 운명을 가지고 유입되는지 아니면 환경적인 인자가 표현형을 결정하는 보다 더 중요한 인자인지는 좀 더 연구가 필요할 것이다. 

비만세포 배양의 실제

   100 ml의 말초혈액을 채취한 후 lymphocyte separation medium(Organon Teknika, Durham, NC)과 함께 37℃에서 30분간 원심 분리시킨다. 이어 얻어진 mononuclear cell을 CD4, CD8, CD11b, CD14, CD19(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에 대한 자기구슬을 접합한 항체(magnetic microbead-conjugated antibodies)에 반응시킨 후 자기장 분리칼럼(magnetic separation column, MACS II；Miltenyi Biotec)을 통과시켜 Lineage-negative(Lin^-)세포를 얻는다. 말초혈액에서는 제대혈액과 달리 CD34+ 세포의 수가 매우 제한적이기 때문에 대신에 Lin^-세포를 사용한다. 메틸셀룰로스 배양을 위해서 1% insulin-transferrin-selenium(GIBCO BRL, Grand Island, NY), 50 μM 2-ME(GIBCO BRL), 1% penicillin-streptomycin(GIBCO BRL)과 0.1% bovine serum albumin을 함유한 0.3 ml의 Iscove modified Dulbecco medium (IMDM；GIBCO)으로 Lin^-세포를 부유한 후 200 ng/ml 간상세포인자, 50 ng/ml IL-6, 1 ng/ml IL-3를 함유한 2.7 ml serum-free Iscove methylcellulose medium(MethoCult SFBIT；Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)과 섞고 1분간 잘 흔들어 고루 섞이게 한다. IL-3는 배양초기에만 첨가해주는데 초기에 IL-3를 첨가하여 주는 것이 다른 세포의 집락을 유도하지 않고 비만세포 집락만을 유도할 수 있기 때문이다. 이어 세포부유액을 0.3 ml씩 24-well plate(Iwaki Glass, Tokyo, Japan)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양을 시작한다. 매 2주마다 100 ng/ml 간상세포인자와 50 ng/ml IL-6를 함유한 0.3 ml 메틸셀룰로스 배지를 첨가해주고 6주가 되면 PBS로 모든 세포들을 회수하여 100 ng/ml 간상세포인자, 50 ng/ml IL-6, 5% fetal calf serum(Cansera, Rexdale, Canada)을 함유한 complete IMDM으로 부유하여 25-cm² 플라스크(Iwaki Glass)에서 배양을 계속한다. 대개의 경우 100 ml로부터 10⁸개의 mononuclear cell을 얻게 되고 이 중 5%인 5×10⁶개의 Lin-세포에서 비만세포 전구세포가 0.1%인 5×10³개 있다고 했을 때 이로부터 배양하면 3개월 후에 성숙한 비만세포를 106개 얻게 된다(Fig. 3). 
   편도선에서 비만세포의 배양은 말초혈액의 과정에서 몇 가지 과정이 더 필요한데 우선 편도선을 잘게 분산시킨 후 3 ug/ml fungizone과 100 U/ml penicillin-streptomycin을 함유한 IMDM에 부유시킨 후 lymphocyte separation medium을 이용하여 밀도구배원심분리(density-gradient centrifugation)를 이용하여 mononuclear cell을 얻는다. MACSII를 통해 얻은 Lin^-세포에 추가적으로 anti-kit mAb에 30분간 처리한 후 Lin^-kit+ 세포를 얻게 된다. 얻어진 세포를 말초혈액에서와 같은 조건으로 메틸셀룰로스 배지에서 배양을 시작한다. 단, 말초혈액과는 달리 6주째 액체배지로 옮기지 않고 계속 메틸셀룰로스 배지에서 배양을 지속한다(Fig. 4).

결     론

   비만세포의 배양은 비만세포가 다른 염증세포와 달리 조직 내에서 분화, 성숙된다는 사실을 고려하면 매우 중요하다. 특히 분화과정에서 여러 가지 환경적인 인자에 의해 영향을 받는다는 사실은 시험관내에서 재현할 수 있어 관련연구를 가능하게 한다. 아울러 인간 비만세포 배양은 긴 배양기간과 높은 비용에도 불구하고 마우스 비만세포와의 많은 차이점과 조직간의 차이점이 있어 비만세포의 연구에 있어서 꼭 필요하다고 하겠다. 이미 gene chip 분석을 통해 밝혀져 있는 사람의 여러 조직 내의 비만세포 및 다른 염증세포의 유전정보 데이터베이스를 이용하여 단백질 단계에서 중요한 기능을 하는 유전자를 확인한다면 위에서 기술한 단점들을 극복할 수 있을 것이다. 불행하게도 코점막으로부터의 비만세포 배양에 대한 유전자 데이터베이스는 기존의 배양방법으로는 충분한 수의 비만세포를 얻을 수 없었기 때문에 밝혀져 있지 않다. 알레르기 비염환자의 코점막의 비만세포가 알레르기 반응의 모든 단계에 관여하는 여러 보고들을 미루어 볼 때 코점막 비만세포 배양이 확립된다면 알레르기 비염연구의 획기적인 사건이 될 것으로 기대된다. 
   또한 질병의 기전과 관련된 신약의 개발을 위해서는 비만세포자체의 어떤 특징보다는 세포기능의 구조나 역동학적인 측면을 system level에서 연구하는 system biology의 시야를 가지고 연구하는 것이 필요하다고 생각한다.

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