교신저자：김정수, 700-721 대구광역시 중구 삼덕2가 50번지  경북대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   점액과다분비는 비염, 부비동염, 기관지염, 천식 등의 기도 질환의 흔한 임상 증상 및 징후로 점액분비의 조절기전의 이해는 이들 질환의 치료에 매우 중요하여 이에 대한 많은 연구가 진행되어 왔으나 아직까지 점액의 생성과 분비 기전에 대한 이해는 부족하며 특히 비강 내 점액선에 대한 연구는 미미하다. 부비동염을 포함한 기도 내 염증질환에서 통상 관찰되는 점액분비선의 비대(hypertrophy) 혹은 증식(hyperplasia)과 호중구 중심의 염증 병변은 점액의 과다 분비가 호중구 염증과 매우 밀접한 연관이 있음을 시사한다.
   호중구는 여러 염증매개체를 분비하며 이들 중의 하나인 에라스틴분해효소(human neutrophil elastase, 이하 HNE)는 점액 분비를 초래하는 것으로 알려져 있다. 기관지확장증 환자의 담을 배양세포에 투여한 결과 세포의 점액분비를 촉진하며 HNE 길항제의 투여로 점액과분비가 차단된다.¹⁾ 기니픽의 오존에 노출된 기관에서 점액분비의 증가는 HNE의 길항제에 의해 의미 있게 차단되며²⁾ 햄스터의 기관지 기관배양에서 HNE는 당접합체(glycoconjugate)의 분비를 증가시켰다.^3,4)
   또한 코의 점막에서 점액분비에 대한 HNE의 역할에 대한 연구에서 쥐의 비강 내에 내독소 혹은 HNE를 주입한 실험에서 점막의 배상세포의 비대 및 증식이 관찰되었으며 상피 내에 상당한 점액 성분이 증가함이 보고되었다.⁵⁾
   만성부비동염 환자의 비루 내 HNE의 존재여부 및 이들의 비강 내 점액분비에 미치는 영향에 대한 연구는 충분치 않다. 저자들은 하비갑개 기관배양을 이용하여 HNE가 비강 내 점막의 점액분비에 미치는 영향과 환자의 비세척액 내의 HNE의 농도측정 및 이들과 점액분비의 상관 관계를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대상 및 비세척액 획득
   만성부비동염 환자 11명을 실험군으로, 비중격만곡 환자 10명을 대조군으로 하였다. 평균나이는 환자군에서 37세(16~60세), 대조군에서 42세(23~57세)였으며 환자군에서 남자가 7명, 여자는 4명이었고 대조군은 모두 남자였다. 만성부비동염은 화농성비루, 비폐색, 후비루, 두통, 후각장애 등의 환자의 증상과 내시경으로 관찰한 비강 소견 및 부비동 전산화단층촬영 결과로 진단하였으며, 최소한 3개월 이상의 항생제를 포함한 내과적 치료에도 호전이 없는 환자들을 대상으로 하였다. 천식, 알레르기 비염, 진균성 부비동명, 점액낭종, 상악동 후비공 낭종 등은 대상에서 제외하였다. 연구대상 모두에서 항생제와 술전 경구용 또는 국소용 스테로이드는 사용하지 않았다. 비세척(nasal lavage)은 0.9%의 생리식염수를 사용하였으며 피검자가 앉은 자세에서 먼저 비강 내를 흡입기로 간단히 청소 후 한쪽 비강 내에서 5 ml의 식염수로 10초간 유지하여 배출 후 점소와 HNE 농도 측정을 위해 -70℃에 모아 두었다.

단기간의 기관배양(Organ culture)
   비후성비염 환자의 하비갑개를 채취 4×4 mm의 크기로 6조각으로 잘라 무게 측정 후 5 mL의 Krebs-Henseleit solution(KHS)에서 배양하였다. 2시간의 회복기를 거친 후 30분간 새로운 KHS에서 배양(period 1) 후 30분간 농도(100~400 ng/ml)를 달리하는 HNE(Serva, Heidelberg, German), HNE 및 HNE 길항제(1 μg/ml, Calbiochem, CA, USA), HNE 길항제 단독 및 KHS 단독(대조군)으로 배양(period 2)한 후 배양액을 얻어 다음 사용 때까지 -70℃에 보관하였다.

점소(Mucin) 측정을 위한 Enzyme-linked lectin assay(ELLA)
   점액성 분비선의 분비 마커인 점소는 lectin에 의해 측정될 수 있다. 96개의 well을 가진 microtiter plate에 lectin의 한 종류인 WGA(Wheat Germ Agglutinin) 60 μl를 도포한 후 수거된 배양액 50 μl를 첨가한 후 2시간 동안 배양하였다. 이후 horseradish peroxidase가 결합된 DBA(dolichos biflorus agglutinin)을 1시간 배양하였다. 각 과정이 끝난 후에 phosphate buffered saline으로 4차례에 걸쳐 수세하였다. Tetramethylbenzidine(150 μl)으로 발색시켰으며 H₂SO₄로 발색을 멈춘 후 ELISA 측정기(Model 550, Bio-Rad)로 450 nm의 흡수파장에서 optical density를 측정하였다. 점소의 농도는 농도를 알고있는 porcine stomach mucin(3.2~200 ng/ml)의 optical density와의 비교로 계산하였다.

비세척액 내의 human neutrophil elastase(HNE) 검사
   HNE 검사는 ELISA 키트(Alexis Biochemicals, Vienna, Austria)를 사용하여 검출하였다. 먼저 비세정액을 검체 희석액으로 1：10 비율로 희석하였다. 스탠다드는 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0 μg/ml 농도로 준비하였다. 스탠다드와 검체를 2반복씩 HNE polyclonal antibody(egg yolk)로 코팅된 microwell plate에 각 well 당 100 μl씩 넣었다. 덮개를 덮은 후, rotator에서 실온, 100 rpm 정도로 1시간 반응시켰다. 세척액을 사용하여 4회 반복 세척한 후 microwell을 종이 수건에 마르지 않을 정도로 잠시 엎어 세척액을 제거하였다. 이후 모든 well에 HRP-conjugate를 150 μl씩 넣었다. 다시 덮개를 덮은 후, rotator에서 실온, 100 rpm 정도로 1시간 반응시킨 후 세척액으로 4반복 세척하였다. 모든 well에 tetramethylbenzidine base(TMB)-substrate solution을 200 μl씩 넣어 실온에서 20분 정도 반응시켰다. 반응을 멈추기 위해 각 well에 stop solution 50 μl씩을 넣었다. 이후 ELISA reader로 450 nm에서 광학밀도를 측정하여 standard curve를 얻어 비세척액 내의 HNE의 농도를 계산하였다.

통계분석
   통계학적 분석은 Stat View 5.0 통계분석 프로그램(SAS Institute, Cary, NC)을 사용하여 paired t-test, unpaired t-test, simple regression으로 검증하였으며 유의수준은 0.05 미만으로 하였다.

결     과

하비갑개 기관배양에서 HNE의 점소 분비에 미치는 영향
   시간 경과에 따른 동역학검사(kinetic study)에서 HNE (400 ng/ml) 자극군 및 대조군 모두에서 5시간 동안 지속적으로 점소 분비가 증가하였으며 특히 HNE로 자극 한 군에서 대조군에 비해 통계적으로 의미 있게 점소의 분비의 증가가 관찰되었다(Fig. 1). 점소의 분비는 HNE의 농도가 증가함에 따라 증가하는 농도 의존적 양상을 나타내었으며 HNE(400 ng/ml) 자극군은 대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 점소분비의 증가가 있었다. HNE 길항제 단독으로는 점소의 분비에 영향을 미치지 않았으나 HNE에 의한 점소분비의 증가를 차단하였다(Fig. 2).

비세정액 내의 HNE및 점소의 농도
   만성부비동염 환자 비세척액의 HNE의 농도는 25.7±15.6 μg/ml, 대조군의 농도는 9.9±6.7 μg/ml로 만성부비동염 환자에서 HNE의 농도가 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높았다(Fig. 3A)(p=0.016). 또한 만성부비동염 환자의 비세척액의 점소의 농도(56.5±9.3 ng/ml)는 대조군(29.1±15.5 ng/ml)에 비하여 통계적으로 유의하게 높았다(Fig. 3B)(p=0.0002).

HNE와 비강 내 점소 농도와의 연관성
   만성부비동염 및 대조군에서 비세정액 내의 HNE와 점소 농도와의 연관성을 조사한 결과 비교적 높은 상관계수를 나타내었으나 통계학적 유의성은 없었다(r=0.423, p=0.08)(Fig. 4).

고     찰

   코를 포함한 상기도 염증 시에 발생하는 점액의 과다분비는 이들 질환의 대표적 임상 증상 중의 하나이나 아직까지 점액분비를 조절할 수 있는 뚜렷한 약제가 개발되지 않아 점액분비 조절의 이해와 이를 통한 약제의 개발은 시급한 과제 중의 하나이다. 본 연구에서는 수술 중 채취한 하비갑개 기관배양과 실험군 및 대조군의 비강 세척액을 통한 실험에서 100~400 ng/ml의 HNE는 농도 및 시간 의존적으로 하비갑개의 점소분비를 증가시켰으며 이들은 HNE의 길항제로 분비의 증가가 차단되었다. 실험군에서 대조군에 비하여 비세척액에서 HNE의 농도가 높았으며 비록 통계학적 유의성은 없었으나 점소의 농도와 비교적 높은 상관계수를 나타내었다. 따라서 이번 연구의 결과들은 HNE가 사람의 코점막에서 점액분비를 촉진할 수 있으며 만성비부비동염 환자의 비루에 존재하여 점액의 분비에 관여한다는 사실을 증명하고 있다.
   기도 염증질환에서 흔한 병리소견인 점액분비세포의 비대 및 증식과 점액에 의한 기도의 폐색 및 호중구 중심의 염증 소견은 점액의 분비의 증가가 호중구 염증과 밀접한 관계가 있는 것을 시사한다. 호중구는 비염증 상황에서는 세포자멸사(apotosis) 후에 대식세포에 의해 제거 되어 호중구 내용물의 분비가 일어나지 않으나 기도염증 시에는 호중구의 괴사와 이후 HNE, 사이토카인, 산화 대사물(reactive oxygen species), lactoferrin, defensins 등이 분비된다.^6,7)
   HNE에 의한 점액분비 증가에 관한 많은 보고들이 있다. 햄스터의 기관지 기관배양에서 단백분해 효소를 투여한 결과 당접합체(glycoconjugate)의 분비를 증가시켰으며,^3,4) 고양이 기관지를 이용한 실험에서도 HNE에 의한 당접합체와 점액당단백의 분비증가가 관찰되었다.⁸⁾ 이들 모든 실험에서 chloromethylketone 등의 seine protease 길항제는 HNE에 의한 점액당단백과 당접합체의 증가를 차단하여 HNE가 점액분비에 매우 중요한 역할을 하는 것을 시사한다. 뿐만 아니라 기니픽의 알레르기 천식모델에서의 항원유발에 의한 배상세포 점액분비와⁹⁾ 기니픽에서 오존에 의한 배상세포의 점액분비의 과분비에도 호중구의 기도점막 침윤과 HNE가 중요한 역할을 하는 것이 보고되어²⁾ 광범한 기도질환에서 HNE이 점액의 과다 분비에 관여하는 것으로 생각된다.
   코점막의 점액분비에 대한 HNE의 역할은 쥐의 비강 내에 내독소 혹은 HNE를 주입한 실험에서 점막의 배상세포의 비대 및 증식이 관찰되었으며 상피 내에 상당한 점액 성분이 증가함이 보고 되었다.¹⁰⁾ 내독소를 투여한 군에서는 호중구의 조직 내 침윤이 가장 높은 시기에 점액분비도 가장 높았으며 HNE 길항제를 비강 내에 투여한 군에서는 점막에서는 점액물질의 증가가 의미 있게 감소하였다. 또한 호중구를 제거한 쥐에서도 HNE의 투여만으로 점액분비의 감소가 없어 내독소에 의한 점액분비 증가는 HNE가 중요한 매개체임을 시사한다. 사람의 코점막 기관배양실험에서 HNE는 점액당단백(mucus glycoprotein)와 당접합체(glycoconjugate)를 증가시켰으며 이는 chloromethylketone 에 의하여 부분적으로 증가가 차단되었다.⁸⁾ 본 연구에서도 사람의 하비갑개 기관배양 실험에서 HNE는 사용된 100~400 ng/ml에서 농도 및 시간 의존적으로 점액분비를 증가 시켰으며 HNE의 길항제는 HNE에 의한 점액분비 증가를 차단하여 위의 실험의 결과들을 뒷받침하고 있다.
   본 연구에서는 만성부비동염 환자의 비강 세척액에서 HNE의 농도는 약 27 μg/ml으로 이는 천식이 악화된 환자의 가래 내의 HNE의 농도(27 μg/ml)와 유사하였으나 낭포성섬유증(cystic fibrosis) 환자의 가래 내의 HNE의 농도(466 μg/ml) 보다는 낮았다.¹¹⁾ 흥미로운 사실은 사람의 하비갑개 기관배양을 실시한 Lundgren 등⁸⁾과 사람의 기관지 세포배양 실험을 실시한 Voynow 등¹²⁾의 실험에서 사용된 HNE의 농도는 각각 50~500 ng/ml과 약 750 ng/ml로 저자들이 사용한 농도인 100~400 ng/ml과 비슷하였으나 환자의 비강 내 세척액이나 가래 내의 HNE 농도에 비하여 매우 낮아 실제 체내에서는 보다 높은 HNE 농도에서 점액분비가 발생하는 것으로 판단된다.
   본 연구에서 만성부비동염 환자에서 채취한 비강세척액 내의 HNE의 농도와 점소의 농도는 대조군에 비하여 유의하게 높아 만성부비동염 환자에서 비강 내에 호중구에 의한 염증반응과 이에 따른 점액분비의 증가를 추측할 수 있다. 비세척액 내에서 HNE 농도와 점소농도 사이의 상관관계에 대한 조사에서는 비교적 상관계수는 높았으나 통계학적 유의성은 없었으며 이는 표본수의 부족과, HNE이외의 다른 염증매개체들에 의한 점액분비의 추가작용에 기인한 것으로 생각된다.
   결론적으로 HNE는 만성부비동염 환자의 비강 내 분비물에 존재하여 비점막에서 점액의 과 분비에 중요한 역할을 할 것으로 판단되며 호중구와 이로부터 분비되는 HNE을 제어할 수 있는 약제의 개발은 점액과다분비를 치료할 수 있는 중요 수단으로 생각된다.

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