교신저자：정재윤, 330-714 충남 천안시 안서동 산16번지  단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(041) 550-3973 · 전송：(041) 556-1090 · E-mail：jjking@dankook.ac.kr 

서     론

   아미노글라이코사이드계 항생제는 높은 효과와 낮은 비용 때문에 그람음성세균 감염의 치료에 많이 사용되고 있고, 또한 낭성 섬유증이나 Duchenne muscular dystrophy의 치료에도 사용되고 있다.^1,2) 그러나 아미노글라이코사이드계 항생제는 심각한 이독성과 신독성을 일으킬 수 있어 치료에 제한을 갖는다. 특히 내이의 청각과 전정 유모세포는 아미노글라이코사이드계 항생제 같은 다양한 약물에 반응하여 비가역적인 세포사가 일어날 수 있다.³⁾ 이러한 청각과 전정 유모세포의 파괴는 영구적인 청력 감소와 어지러움을 일으키게 된다. 
   현재까지 약물이나 소음으로 인한 유모세포의 이독성에 대한 생화학적 기전에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며, 몇몇 연구 결과에 따르면 reactive oxygen species(ROS)의 생성이 아미노글라이코사이드계 항생제의 유모세포 손상을 유발하는 것으로 보고 되고 있다.^4,5) Caspase는 정상적으로 비활성화 형태로 존재하는 단백 분해 효소계로 세포 고사에 중요한 역할을 수행하고 내이의 유모세포의 고사에도 중요한 역할을 한다. 또한 아미노글라이코사이드계 항생제에 의한 유모세포의 고사는 외인성 경로와 내인성 경로 중 내인성 경로가 더 큰 역할을 할 것으로 생각되고 있다.⁶⁾
   Minocycline은 넓은 항균작용을 갖는 2세대 tetracycline계 항생제로 피부, 성기, 요로 감염뿐만 아니라 폐렴이나 여드름을 치료하는 데 흔히 사용된다. Minocycline은 항균 작용뿐만 아니라 세포 고사를 억제하는 특징을 가지고 있다. 많은 연구들은 minocycline이 ROS뿐만 아니라 inducible nitric oxide synthase(iNOS), caspase-1, cyclooxygenase-2(COX-2)의 발현을 억제하고, 미토콘드리아에 영향을 주어 cytochrome C, AIF, Smac/Diablo와 같은 세포 고사에 관여하는 인자들이 미토콘드리아로부터 세포질로 방출되는 것을 억제하는 것을 보여 왔다.^7,8,9) 이와 같은 특징으로 인해 minocycline이 Parkinson's disease, Huntington's disease와 amyotrophic lateral sclerosis와 같은 neurodegernerative 질환의 진행과, 허혈로 인한 심근 세포 손상을 억제하는 것이 여러 연구에서 증명되고 있고,^8,9,10,11) gentamicin에 의한 와우 유모세포 손상을 예방할 수 있음이 보고되었다.^12,13) 
   본 연구에서는 minocycline이 neomycin으로 인한 유모세포의 손상을 예방할 수 있음을 전정기관 중 하나인 난형낭반 조직배양을 이용하여 알아보았고, 이러한 예방 효과는 neomycin으로 활성화된 ROS와 주요 effector caspase인 caspase-3의 활성을 minocycline이 억제함을 통해 일어남을 알아보고자 하였다. 

대상 및 방법

난형낭반 조직배양 
   배양에 이용된 난형낭반 조직은 생후 3, 4일령(P 3-4)의 흰쥐 Spraque-Dawley rat, Orient, Seongnam, Korea)로부터 얻어졌다. 흰쥐를 70% 에탄올에 소독한 후 두부를 절단하였다. 무균적 방법으로 박리하여 난형낭반을 얻었고, 이석막의 제거 없이 전체 난형낭반을 배양하였다. 난형낭반의 박리는 상온의 Dulbecco's phosphate buffer saline (PBS, Hyclone Laboratory, Logan, UT, USA)에서 시행되었다. 배양액은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Hyclone Laboratory), 10% fetal bovine serum(FBS, Hyclone Laboratory), N-1 supplement(Sigma, St. Louis, MO, USA), 그리고 100 U/ml penicillin(Sigma)으로 구성되었다. 난형낭반은 24시간 동안 배양기(37℃, 5 % CO₂)에서 배양되었다. 

이독성 유발 및 Minocycline의 투여
   둘째 날에 1 mM과 2 mM 농도의 neomycin(Sigma)을 새로운 배양액에 넣어 이독성을 유발하였다. 그리고 1 mM과 2 mM neomycin을 처리한 난형낭반에 10 uM과 100 uM의 minocycline을 처리하여 결과를 비교하였다. Minocycline 투여군은 neomycin 투여 2시간 전에 미리 minocycline으로 전 처리를 하였다. 또한 100 uM의 minocycline만을 배양액에 투여하여 minocycline의 이독성 여부를 평가하였다. 약물을 투여한 후 전체 양이 2 ml가 되도록 배양액이 더해졌고, 난형낭반은 24시간 동안 37℃에서 배양되었다.

전정 유모세포수의 평가
   난형낭반의 유모세포의 수를 평가하기 위해 phalloidin-fluorescein isothiocyanate(phalloidin-FITC, Sigma) 형광 염색을 시행하였다. 배양 마지막에 난형낭반은 4% paraformaldehade로 1시간 동안 4℃에서 고정한 후 이석막을 제거하였다. 0.1 M PBS(pH 7.4)로 세척한 후에 0.25% Triton X-100(Sigma)로 3분 동안 처리한 후 상온에서 1.0 ug/ml phalloidin-FITC로 염색하였다. 그 후, 0.1 M PBS로 3번 세척한 후 유리 글라스에 봉입한 후 FITC에 대한 적절한 필터(absorption：494 nm, emission：518 nm)를 이용하여 공촛점 레이저 주사 현미경(ZEISS510 META, Gottingen, Germany)으로 관찰하였다. 유모세포의 수는 유모세포가 가장 잘 관찰되는 곳에서 20,000 um² 당 유모세포의 수를 평균하여 평가하였다. 각 실험 조건에서 적어도 3개의 난형낭반이 이용되었다. 통계 처리는 SPSS version 10.0을 사용하였으며 Mann-Whitney test를 이용하여 95% 유의 수준에서 검증하였다.

ROS 생성의 평가
   ROS의 측정은 형광 염료인 hydrofluorescent diacetate acetyl ester(H₂DCFDA, Molecular probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 평가하였다. 배양 전 난형낭반의 이석막을 주의 깊게 제거한 후 1 mM의 neomycin을 처리한 후 1분, 3분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 배양 후에 각각 ROS의 발현 정도를 살펴보았다. 각각의 배양 시간 후에 37℃에서 10 uM H₂DCFDA를 직접 배양액에 더한 후 30분 동안 배양기에서 배양하였다. 난형낭반을 유리 글라스에 옮긴 후 고정 없이 공촛점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. Neomycin을 처리 4시간 후에 ROS가 가장 많이 발현됨을 확인한 후, 약물을 처리하지 않은 대조군, 1 mM neomycin만을 처리한 군, 1 mM neomycin과 10 uM minocycline을 처리한 군으로 나누어 4시간 동안 배양하여 ROS의 발현 정도를 비교하였다.

Caspase-3 활성의 평가
   Caspase-3의 활성은 형광 caspase substrate(CaspGLOW Red Caspase-3 Staining Kit, Biovision, Mountain View, CA, USA)을 이용하여 평가하였다. 난형낭반은 neomycin과 minocycline을 처리하지 않은 대조군과 neomycin만을 처리한 군, neomycin과 minocycline을 처리한 군과 neomycin과 caspase-3의 억제제인 Z-VAD-FMK(Z-Val-Ala-Asp(Ome)-CH₂F)를 처리한 군으로 나누어 12시간 동안 배양하였다. 형광 substrate는 배양 마지막 시간에 1 uM의 농도로 직접 배양액에 더해졌다. 1시간 후에 난형낭반은 상온에서 0.1 M PBS로 3번 세척한 후에 4℃에서 4 % paraformaldehyde로 1시간 동안 고정하였다. 고정한 난형낭반의 이석막을 제거한 후 상온에서 phalloidin-FITC로 1시간 동안 염색하였다. 염색된 난형낭반을 0.1 M PBS로 세척한 후 공촛점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 

결     과

Neomycin의 이독성과 minocycline의 이독성 예방 효과(Figs. 1 and 2)
   Minocycline의 이독성 예방 효과를 평가 하기 위해 난형낭반의 조직배양을 이용하였다. 정상 난형낭반의 유모세포의 수는 20,000 um² 당 평균 237±20(n=3) 이었다. Neomycin의 농도가 증가할수록 생존한 유모세포의 수는 감소 하였는데 1 mM과 2 mM에서 각각 96±17(n=3)과 66±18(n=3)으로 정상 난형낭반의 유모세포의 수에 비해 의미 있게 감소하였다(p<0.05). Neomycin 1 mM에서 minocycline 10 uM과 100 uM을 처리한 난형낭반의 평균 유모세포의 수는 각각 121±23(n=4), 157±13(n=4)이었고 100 uM을 처리한 군에서만 통계적으로 의미 있는 유모세포 생존 효과를 보였다(p<0.05). Neomycin 2 mM에서는 minocycline 10 uM과 100 uM을 처리하였을 때, 각각 114±34(n=4), 126±25(n=4)으로 두 농도 모두에서 통계적으로 의미 있는 유모세포 생존효과를 보였다(p<0.05). 마지막으로 유모세포에 대한 minocycline의 자체적인 세포 독성을 알아보기 위해 100 uM의 minocycline을 배양액에 넣고 24시간 배양하였는데 평균 유모세포의 수는 203±22(n=3)로 정상 난형낭반의 유모세포와 비슷한 결과를 얻었다. 

ROS의 활성(Fig. 3)
   Neomycin으로 이독성을 유발한 후 ROS 측정 형광 염료인 H₂DCFDA를 이용하여 ROS의 활성 상태를 평가하였다. 대조군에서는 ROS의 활성을 거의 확인할 수 없었고 neomycin을 처리한 군에서는 4시간째에 ROS가 가장 활성화 되었음을 확인할 수 있었다. Minocycline으로 이독성을 예방한 군에서는 ROS의 활성이 뚜렷하게 감소된 결과를 보였다. 

Caspase-3의 활성(Fig. 4)
   유모세포의 형광 caspase-3의 활성이 약물 처리 12시간 후에 측정되었다. Caspase-3는 neomycin 1 mM을 처리한 군에서 높은 활성을 보였다. 어떠한 약물도 처리하지 않은 대조군에서도 약간의 caspase-3 활성을 보였지만 neomycin을 처리한 군에 비해 매우 적은 활성을 보였다. Neomycin과 minocycline을 같이 처리한 군에서는 caspase- 3의 활성이 neomycin 단독 처리군에 비해 크게 감소된 결과를 보였고 대조군에 비해서도 더 적은 활성을 보였다. Neomycin과 caspase-3 억제제인 Z-VAD-FMK를 처리한 군에서도 neomycin을 처리한 군에 비해 감소된 caspase-3의 활성을 보였다.

고     찰

   아미노글라이코사이드계 항생제의 임상적 유용성은 두 가지 큰 부작용인 이독성과 신독성에 의해 제한되어 왔다. 아미노글라이코사이드계 항생제로 인한 세포 손상의 분자학적 기전은 아직까지 정확히 알려져 있지 않지만 여러 연구들은 ROS의 생성과 caspase-8, 3과 같은 caspase의 활성, 미토콘드리아의 transmembrane potential의 변화를 통한 cytochrome c의 방출 증가와 c-Jun N-terminal kinase의 활성 등으로 보고하고 있다.^5,14) 1940년대, tetracyclin계 항생제가 발견된 이래, 항균력을 높이고, 조직 흡수를 늘리며, 반감기를 길게 하기 위해 다양한 분자학적 변형이 시도되었다. 이 중 minocycline은 2세대 반합성, tetracycline계 항생제로 1세대에 비해 더 높은 조직 흡수와 더 긴 반감기를 가지고 있다. 또한 minocycline은 고유한 항균 작용 외에 세포 고사를 억제하는 역할을 하여 여러 가지 신경질환이나 허혈성 심장질환의 진행을 예방하는 것이 동물과 임상 실험에서 보고되고 있다.^8,9,10,11) Minocycline은 미토콘드리아로부터 cytochrome C의 방출을 억제하며 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2의 발현을 증가시키고 p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK)와 caspase-3의 활성을 방해한다고 알려졌다. 내이에서도 와우 조직배양을 통한 실험에서 minocycline이 gentamicin으로 유도된 이독성을 예방할 수 있음이 보고되었고,¹²⁾ 비슷한 실험을 통하여 이와 같은 보호 기전은 p38 MAP kinase와 caspase-3의 활성을 억제하여 유모세포의 세포 고사를 억제하는 것을 통해 이루어 졌다는 연구 결과도 있었다.¹³⁾ 
   본 연구에서는 먼저 내이의 다른 기관인 난형낭반을 이용하여 neomycin으로 유도된 난형낭반의 유모세포의 손상에 minocycline이 어떤 영향을 주는지 알아 보았다. 난형낭반에 neomycin을 처리하고 24시간 후에 난형낭반의 유모세포를 정량적으로 분석한 결과 neomycin의 농도가 증가함에 따라 더 많은 수의 유모세포가 손상되었으며, neomycin과 minocycline을 같이 처리한 군에서는 모든 군에서 neomycin만을 처리한 군보다 유모세포의 생존율이 높았고, 10 uM의 농도에 비해 100 uM이 더 큰 보호 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Figs. 1 and 2). 또한 minocycline만을 처리하여 배양한 난형낭반을 대조군과 비교한 결과 유모세포의 수가 큰 차이가 없는 것을 알 수 있었고, 따라서 minocycline이 유모세포에 별다른 손상을 주지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
   Minocycline은 항산화 작용을 가지고 있다고 알려져 있다. Minocycline은 6-hydroxydopamine으로 유도된 신경독성과 흰쥐 소뇌 뉴런의 ROS의 생성을 방해하고 혈장 박탈로 유도한 망막 신경절의 ROS에 의한 손상도 예방할 수 있다고 보고 되었다.^7,15) Hydrogen peroxide(H₂O₂), nitric oxide(NO), superoxide anion (O₂^-˙), hydroxyl radical(˙OH)와 같은 ROS는 transcription factor 활성, 유전자 발현, 세포 증식과 같은 많은 세포 내 과정의 조절에 관여하는 것으로 생각되고 있다. 그러나 ROS의 과생성은 여러 형태의 세포사에 관여하고, cisplatin과 아미노글라이코사이드계 항생제, 소음으로 인한 유모세포의 손상에도 ROS의 생성이 관여된다고 보고되고 있다. ROS의 생성이 내이의 항산화 체계 보다 우위에 있을 때 유모세포의 손상이 초래되고, ROS가 아미노글라이코사이드계 항생제를 처리한 와우 및 전정 조직배양에서 과다 발현됨이 알려져 있다.¹⁶⁾ 또한 여러 연구들은 vitamine E, D-methionine, α-lipoic acid와 ebselen 등의 다양한 항산화 물질로 ROS의 생성을 막거나 이미 형성된 ROS를 scavenge함으로써 이독성을 예방할 수 있음을 보였다.^17,18)
   본 연구에서는 난형낭반 조직배양에서 neomycin 처리 후 ROS의 발현을 형광 시약인 H₂DCFDA를 이용하여 검사하였고 minocycline으로 이러한 ROS의 생성을 억제할 수 있는지를 보았다. 먼저 neomycin 처리 후 1분, 3분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간 후에 각각 ROS의 발현 정도를 보았는데, 처리 4시간 후에 가장 높은 ROS 발현을 확인할 수 있었고, 이후 발현 정도가 감소하였다. Minocycline을 같이 처리한 군에서는 대조군에 비해서는 ROS의 발현이 증가되었지만 neomycin만을 처리한 군에 비해서는 뚜렷하게 ROS의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 
   아미노글라이코사이드계 항생제로 인한 유모세포의 세포 고사에서 downstream effector caspase인 caspase-3는 매우 중요한 역할을 한다. 전체 14개의 caspase가 포유동물에서 확인되었으며 이 중 약 절반이 세포 고사에 기여하는 것으로 알려져 있다. 세포 고사와 관련된 caspase는 upstream initiator caspase와 downstream effector caspase로 분류되어 왔다. caspase-8, 9와 같은 upstream initiator caspase의 활성은 caspase-3 같은 downstream effector caspase를 활성화 시킨다. Effector caspase는 Bcl-2 같은 세포 생존에 필수적인 단백질을 분할함으로써 세포고사를 유도한다.¹⁹⁾ 
   본 실험에서는 형광 caspase-3 substrate를 사용하였는데, 이는 세포 내의 활성화된 caspase-3에 의해 분할되어 붉은 색의 형광을 발현한다. Neomycin 처리 12시간 후에 난형낭반 조직배양에서 높은 caspase-3의 발현을 확인하였다. 12시간의 배양 시간은 유모세포의 사멸을 일으키지 않고 caspase-3의 활성만을 평가하기 위해 선택되었다. 본 실험에서 minocycline은 neomycin으로 인한 caspase-3의 발현을 억제하였고, 이를 통해 minocycline이 caspase-3로 유도되는 세포 고사를 막을 수 있음을 확인하였다. 또한 minocycline을 처리한 군은 정상 대조군에 비해서도 더 적은 caspase-3의 발현을 보여 minocycline이 정상적인 배양 중에 일어나는 생리적인 세포 고사도 억제함을 알 수 있었다. Caspase-3 억제제인 Z-VAD-FMK을 처리한 군에서도 neomycin만을 처리한 군에 비해 뚜렷한 caspase-3 발현 감소를 보였으나 minocycline을 처리한 군에 비해서는 높은 활성을 보여 minocycline이 caspase-3로 인한 경로 외에 다른 경로를 통해서도 세포 고사를 억제함을 추측할 수 있었다(Fig. 4). 
   따라서 minocycline은 아미노글라이코사이드계 항생제와 같이 사용함으로써 부가적인 항균작용과 더불어 내이의 유모세포의 이독성을 예방하여 아미노글라이코사이드계 항생제로 인한 평형 기능 장애를 예방할 것으로 기대된다.

결     론

   난형낭의 조직배양 모델을 통해 minocycline이 neomycin으로 유발된 전정 이독성을 ROS의 생성 억제와 caspase-3의 발현 감소를 통해 예방할 수 있음을 확인하였다. 

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