교신저자：노영수, 134-701 서울 강동구 길동 445  한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(02) 2224-2279 · 전송：(02) 482-2279 · E-mail：ys20805@chol.com

서     론

   내분비계 악성종양 중 가장 흔한 갑상선암은 생활수준의 향상으로 인한 건강에 대한 관심의 증가와 진단기술의 발달로 인해 그 발생 빈도가 최근 급속히 증가하고 있다. 다른 두경부 악성종양과는 다르게 예후가 비교적 좋은 것으로 알려져 있으나 미분화암으로 진행시 예후가 극히 불량한 것으로 보고되고 있다. 이에 갑상선암을 진단하고 예후를 판단하기 위한 여러가지 혈청학적, 분자 생물학적 표지자들이 연구되고 있다.¹⁾
   이중 galectin은 β-galactoside 결합 lectin 계열의 탄수화물-결합 단백으로 세포의 성장, 분화, 그리고 세포의 부착 등에 관여하며 핵, 세포질, 세포막과 세포외기질에 존재한다.²⁾ 갑상선암, 위암, 췌장암 등의 악성종양에서 발현의 증가가 보고되고 있으나³⁾ 아직까지 명확한 작용 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
   본 연구에서는 갑상선 종양에서 galectin-3의 단백발현과 mRNA의 발현을 검사하여 갑상선 종양에서 악성과 양성의 감별진단의 방법으로 galectin-3의 검출이 이용될 수 있는가 알아보고, 분화성 갑상선 유두암종의 다른 예후 인자와 비교하여 galectin-3의 분화성 갑상선 유두암종에서의 임상적 의의를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   본원에서 1997년 1월부터 2001년까지 갑상선 종양으로 진단 받고 외과적 절제술을 시행 받은 예 중 비교적 표본의 보관상태가 양호한 100예를 연구대상으로 하였다. 100예 중 선종성 증식(nodular hyperplasia)이 20예, 여포선종(follicular adenoma)이 20예, 여포암종(follicular carcinoma)이 10예, 유두암종(papillary carcinoma)이 50예 였다. 대조군으로는 정상 갑상선 조직 20예와 정상 림프절 조직을 이용하였다.

병리조직학적 검색
   모든 검체는 10% 중성 포르말린에 고정된 후 통상의 병리진단을 위한 처리과정을 거친 파라핀 포매 조직을 이용하였고 각 증례에서 암종과 비암종 부위가 포함된 파라핀 블록을 선택하여 헤마톡실린과 에오진(Hematoxylin and Eosin, H&E) 염색을 시행하였다. 각 증례의 갑상선 종양 조직을 2명의 병리 전문의가 광학현미경으로 검경하고 재판독하였다.

Galectin-3 mRNA 검출을 위한 역전사 중합효소 연쇄 반응

Total RNA 추출
   갑상선 종양 조직과 정상 조직을 수술 직후 채취하여 액체 질소에 담근 후 영하 80℃에서 동결하였다가 TRIZOL 방식으로 RNA를 추출하였다. 냉동된 조직을 PBS용액으로 수세 후 0.5 cm3 크기로 절단한 조직편 50~100 mg을 액체 질소하에서 Polytron homogenizer(Brinkmann, Westbury, NY, USA)로 분쇄한 후 TRIZOL reagent(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 1 ml를 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 0.2 ml의 chloroform을 넣은 후 15초간 세게 흔들고 10분간 상온에 두었다가 4℃에서 12,000 g으로 15분간 원심분리하고, 수용성 상층액을 피펫으로 새 시험관에 조심스럽게 옮기고 0.5 ml의 isopropanol을 넣고 vortexing하여 상온에 10분간 보관했다가 12,000 g으로 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 상층액을 따라 버리고 75% ethanol 1 ml를 넣고 섞은 후 원심분리하여 RNA pellet을 세정하고, 상층액을 다시 제거한 후 상온에서 RNA pellet을 건조시킨 후 diethyl pyrocarbonate로 처리된 증류수에 녹여서, 분광 광도계(150-20, Hitachi Co., Tokyo, Japan)로 260 nm의 분광광도에서 농도를 측정하고 영하 80℃에 보관하였다.

RT-PCR
   정제된 total RNA를 poly-dT primer와 annealing 시킨 후 AMV reverse transcriptase(USA)를 사용하여 first strand cDNA를 만들었다. 이 cDNA를 가지고 각각의 해당 시발체(primer)를 사용하여 PCR을 시행하였으며, 시발체는 GIBCO사(USA)에서 주문 제작하였다(Table 1). 모든 PCR 반응은 thermal cycler(Perkin Elmer Cetus 9700, USA)를 사용하고 제작 회사에서 제안한 방법으로 수행하였다. PCR 용액은 1 μl template(cDNA 용액)에 1 μl의 primer-5', primer-3'(2 mM), 1 μl의 dNTP 혼합액(2 mM), 1 μl의 10X buffer(20 mM MgCl2, Takara), 1 μl의 Taq polymerase(Takara, 5 U/μl)를 넣어 증류수를 가하여 20 μl로 만들었다. PCR의 조건은 변성 전단계(pre-denaturation)는 94℃에서 5분, 변성 반응은 94℃에서 1분, 결합반응은 57℃에서 1분, 연장반응은 72℃에서 1분으로 전체 30주기를 시행하였다. β-actin의 경우도 결합반응은 59℃에서 1분으로 하여 시작하였다. galectin-3 mRNA 발현을 비교하기 위하여 각 조직에서 분리한 RNA를 가지고 RT-PCR을 시행하였고, 이때 β-actin에 대한 실험을 먼저 시행하여 그 결과에 따라 cDNA template의 양을 조정하여 다시 PCR을 시행하여 β-actin의 PCR 산물의 양이 일정하게 된 것을 확인하였다. 그 이후의 PCR은 조정된 양의 cDNA template를 사용하여 galectin-3에 대한 각각의 primer로 PCR을 수행하였다. 각각의 PCR 산물의 양을 1.5% agarose gel에서 전기영동하여 예상된 크기의 분자에 해당하는 띠(band)에서 확인하고 분석하였다.

면역조직화학적 연구
   포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친 조직을 5 μm 두께로 연속 세 개의 절편을 만들어 xylene으로 탈파라핀하고, 각 절편을 galectin-3 단백에 대하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 단백의 항원성을 유지하기 위해 극초단파(microwave oven method)를 이용하여 끓는 phosphate buffered saline에 처리 후, 내인성 peroxidase의 활성을 억제하기 위해 과산화수소를 도포하고 희석된 정상 염소 혈청(Zymed, USA)을 도포하여 비특이적 결합을 억제하였다. 그 후 1：100으로 희석된 1차 항체인 galectin-3에 대한 단클론성 항체(mouse monoclonal antibody, Novo Castra, UK)를 상온에서 2시간 반응시키고, 2차 항체인 biotinylated link antibody(LSAB kit, DAKO, USA)와 20분간 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. Streptavidin(Zymed, USA)과 peroxidase가 결합된 용액에 30분간 반응시키고, 이후 발색반응은 3,3-diaminobenzidine tetrachloride(DAB)(sigma)로 발색시킨 다음 Meyer's hematoxylin으로 대조염색 후 흐르는 물에 세척하여 실온에 건조시킨 후 봉입하였다.

결과판정과 통계처리
   Galectin-3 mRNA의 발현을 평가하기 위해서 정상 림프절 조직을 대조군으로 강도 1로 정하였다. 정상 갑상선 조직 20예에서 galectin-3 mRNA 발현 강도를 조사한 결과 평균은 0.76±0.23이었다. 갑상선 종양의 mRNA 발현을 평가하기 위해 정상 갑상선 조직 발현 평균치에 표준 편차의 2배치를 합한 값을 양성 기준치로 정하였다. Galectin-3 단백의 면역 조직화학 염색 반응의 판정은 염색된 세포의 밀도가 높은 부분을 광학현미경으로 400배 시야에서 10개를 관찰하였으며, 세포질과 핵막에서 진한 갈색으로 강한 정도로 염색되는 세포를 양성세포로 판정하였다. 양성세포가 전체 종양세포에 대해 20% 이상의 경우 양성으로 구분하였고 그 미만은 모두 음성으로 구분하였다. 통계처리는 윈도우형 SPSS(ver. 8.0) 통계 프로그램을 사용하여 Pearson의 Chi-square 검정과 Fisher의 정확확률 검정으로 분석하였다. 유의수준은 p값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.

결     과

임상 및 병리학적 소견
   병리조직학적으로 판독이 이루어진 총 100예의 갑상선 종양 증례 중 양성 갑상선 종양은 선종성 증식 20예와 여포선종 20예로 전체 40예(40%) 였으며 악성 갑상선 종양은 여포암종 10예와 유두암종 50예로 전체 60예(60%) 였다(Table 2). 악성 갑상선 종양 중 유두암종 50예를 여러 임상예후인자 별로 나누어 보았을 때 45세 이상이 34예(68%), 45세 미만이 16예(32%)였으며, 조직학적 분화도상 고분화도가 35예(70%), 저분화도가 15예(30%)였다. 림프절 전이는 23예(46%)에서 있었고, 림프 색전은 15예(30%)에서 관찰되었다. 종양의 크기가 2.0 cm 이상인 경우는 18예(36%) 였으며, 갑상선 외부로의 종양의 침윤은 18예(36%)에서 관찰되었다.

역전사 중합효소 연쇄반응에 의한 Galectin-3 mRNA의 발현

Galectin-3 mRNA의 발현 양상(Fig. 1)
   Galectin-3 mRNA는 정상 조직에서 거의 검출되지 않았고 검출된 예에서도 발현 강도는 매우 미약하였다. 갑상선 종양에서 galectin-3 mRNA의 발현은 선종성 증식에서 9예(9/20, 45%), 여포선종에서 8예(8/20, 40%), 여포암종에서 6예(6/10, 60%), 유두암종에서 41예(41/50, 82%)가 검출되어 다른 갑상선 종양에 비해 유두암종에서의 galectin-3 mRNA 발현은 통계학적으로 유의성 있게 높은 발현율을 나타냈다(p=0.043).

유두암종에서 Galectin-3 mRNA의 발현과 임상예후인자와의 관계(Table 3)
   유두암종에서 종양의 크기에 따른 galectin-3 mRNA의 발현은 2.0 cm 이상인 경우 15예(15/18, 83.3%)에서 검출되었고 2.0 cm 미만인 경우 26예(26/32, 81.3%)에서 발현되었다. 종양의 분화도에 따른 galectin-3 mRNA의 발현은 고분화성 암종에서 29예(29/35, 82.9%)이었고, 저분화성 암종에서는 12예(12/15, 80%)였다. 종양 내에 형성된 림프 색전의 유무에 따른 galectin-3 mRNA의 발현은 색전이 있는 경우 12예(12/15, 80%)이었고, 색전이 없는 경우 29예(29/35, 82.9%) 였다. 또한 갑상선외 침범에 따른 galectin-3 mRNA의 발현은 침범이 있는 경우 15예(15/18, 83.3%) 였고, 침범이 없는 경우 26예(26/32, 81.3%)였으며 림프절 전이 여부에 따른 galectin-3 mRNA의 발현은 전이성인 경우 20예(20/23, 87.0%)이었으며, 비전이성인 경우 21예(21/27, 77.8%) 였다. 결과를 종합하면 유두상암에서 기존에 임상예후인자로 알려진 종양의 크기, 종양의 분화도, 림프 색전의 유무, 갑상선외 침범의 유무, 림프절 전이의 유무와 galectin-3 mRNA의 발현 사이에는 통계적 유의성이 없었다(p>0.05).

면역조직화학 검사법에 의한 Galectin-3 단백 발현

Galectin-3 단백 발현 양상
   Galectin-3 단백 발현은 선종성 증식 1예(1/20, 5%), 여포선종 3예(3/20, 15%), 여포암종 7예(7/10, 70%), 유두암종 46예(46/50, 92%)에서 검출되었다. 각 암종 간의 galectin-3 단백발현은 통계학적인 유의성은 없었으나, 비 암종인 선종성 증식이나 여포선종에 비해 암종인 여포암종과 유두암종에서 유의성있게 높은 발현을 보였다(p=0.023).

유두암종에서 Galectin-3 단백 발현과 임상예후인자와의 관계(Table 3)
   유두암종에서 galectin-3 단백의 발현을 임상예후인자와 비교하였을 때 종양의 크기에 따른 galectin 단백 발현은 2.0 cm 이상인 경우 16예(16/18, 88.9%), 2.0 cm 미만인 경우 30예(30/32, 93.8%)에서 발현되었으며 종양의 분화도에 따른 galectin-3 단백 발현은 고분화성 암종에서 32예(32/35, 91.4%), 저분화성 암종에서는 14예(14/15, 93.3%) 였다. 종양 내에 형성된 림프 색전의 유무에 따른 galectin-3 단백 발현은 색전이 있는 경우 13예(13/15, 86.7%), 색전이 없는 경우 33예(33/35, 94.3%) 였으며 갑상선외 침범에 따른 galectin-3 단백 발현은 침범이 있는 경우 17예(17/18, 94.4%), 침범이 없는 경우 29예(29/32, 90.6%) 였다. 림프절 전이 여부에 따른 galectin-3 단백 발현은 전이성인 경우 22예(22/23, 95.7%)이었으며, 전이가 없는 경우 24예(24/27, 88.9%) 였다. 결과를 종합하면 galectin-3 단백의 발현 또한 galectin-3 mRNA와 마찬가지로 유두상암의 임상예후인자인 종양의 크기, 종양의 분화도, 림프 색전의 유무, 갑상선외 침범의 유무, 림프절 전이의 유무 사이에 통계적 유의성이 없었다(p>0.05).

유두암종에서 Galectin-3 mRNA와 단백 발현의 관계
   Galectin-3 mRNA 발현과 단백 발현이 모두 검출된 증례는 39예이었고, 모두 음성인 경우 2예 였으며, galectin -3 mRNA만 발현된 경우 2예, galectin-3 단백 발현만 된 경우가 7예로서 양자의 발현 간에는 유의한 상관관계가 있었다(p=0.030).

고     찰

   초음파와 나선형 컴퓨터 단층 촬영 등 영상진단장비의 발전과 건강에 대한 관심의 증가로 갑상선 종양의 진단이 최근 급격히 증가하고 있으며 이에 따라 전체 종양에서 갑상선 종양이 차지하는 비율 또한 매년 증가하고 있다. 갑상선 종양의 양성 혹은 악성 여부 및 악성종양 중 조직학적 감별진단에는 세침흡인세포검사가 주로 이용되고 있으나 그 결과가 아직까지는 충분하지 않으며 특히 여포형 종양과 여포형 분화를 보이는 유두암종 간의 감별이나 유두상 모양을 취하는 선종성 증식 등의 감별은 더욱 어려운 실정이다. 이에 따라 최근 갑상선 종양 관련 표지자들이 활발하게 연구되고 있으며 이러한 표지자들을 갑상선 종양의 감별진단에 이용하려고하는 시도가 지속적으로 이루어져 왔다.⁴⁾⁵⁾
   Galectin은 탄수화물 부착 단백으로 특이 다당류 구조인 당단백과 당지질 상의 특이 다당유구조를 인식하는 물질인 lectin의 하나로 세포 부착, 세포성장, 세포자멸사 조절 등에 관련되는 물질로 발견되었다.²⁾ 또한 악성종양에서는 종양 세포막의 galectin 발현 정도가 암 전이능과 상관관계가 있다는 것이 밝혀지면서 유방암, 대장암, 전립선암 및 갑상선 암에서 종양표지자로서의 역할에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.²⁾⁶⁾ 이러한 연구 결과 galectin-3는 31kDa 크기의 beta-galactoside-binding lectin으로서 다양한 종양, 비종양 세포의 세포막에 발현되어 세포-세포 외 기질 간의 상호작용에 관여하는 것으로 알려졌다.⁷⁾ 그러나 아직까지 여러 연구 결과 galectin-3의 암발생에 있어서의 역할에 있어 상이한 결과를 보이고 있어 그 역할에 대하여 논란이 많은 실정이다. 갑상선암, 위암, 췌장암, 비소세포폐암, 일부의 두경부 암에 있어서 그 발현의 증가가 보고 되고 있으나³⁾ 난소암, 유방암, 소세포폐암, 대장암 등에서는 그 반대의 결과가 보고 되었다.^8)9)10) 또한 이들 연구는 대부분 면역조직화학염색에 의한 galectin-3 단백의 발현만을 비교하였다는 한계가 있다. 이에 따라 본 연구에서는 RT-PCR을 통한 mRNA 발현을 galectin-3 단백 발현과 함께 살펴보고, 갑상선 종양을 선종성 증식, 여포선종, 여포암종, 및 유두암종으로 분류하여 각각에서의 발현양상의 차이를 알아보았다. 한편 galectin-3 발현과 갑상선 종양의 임상적 예후인자와의 관계를 알아보기 위하여 분화성 유두암종에서 기존에 알려진 임상적 예후인자들과 galectin-3 발현과의 관계를 살펴보았다. 연구 결과, galectin-3 단백은 비암종인 선종성 증식이나 여포선종에 비해 여포암종과 유두암종에서 유의성 있게 높은 발현을 보였으며 galectin-3 mRNA 발현은 선종성 증식, 여포선종, 여포암종에 비해 유두암종에서 유의성 있게 높은 발현을 보였다. 이는 galectin-3가 갑상선 암종에 특이적인 암표지자로서 기능할 수 있을 것이라는 기존의 연구결과들을 뒷받침하고 있다.¹¹⁾ 그러나 갑상선 분화암종의 각각의 임상예후인자 별로 구분하는 경우에는 통계적인 의미를 찾을 수 없었다. 따라서 galectin-3가 갑상선 암종의 진단적 의미 이외에 예후 판정의 기준으로 사용될 수 있기 위해서는 단순히 발현의 유무뿐 아니라 발현 정도를 측정할 수 있는 정량적인 검사법이 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   Galectin-3 단백의 발현은 갑상선 암종에서 다른 종양에 비해 특이적으로 높게 나타나 갑상선 악성종양의 표지인자로서 가치가 있을 것으로 생각되며 galectin-3 mRNA 발현은 특히 유두암종에 특이적으로 발현이 높게 나타나 갑상선 유두암의 특이적인 표지인자로 이용될 수 있을 가능성이 있다고 사료되었다.

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