교신저자：노종렬, 301-040 대전광역시 중구 대사동 640번지  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실 암연구소
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서     론

   후성문협착(posterior glottic stenosis)은 치료가 어렵고 삶의 질에 심각한 영향을 줄 수 있는 질환으로 대부분 기관내삽관(endotracheal intubation)에 따른 후두내외상으로 발생한다.¹⁾²⁾ 후성문협착은 10일 이상 기관삽관을 했던 병력이 있는 환자의 약 14%에서 발생한다고 알려져 있다.¹⁾ 이것은 설근과 기관의 후방이 각(angulation)을 이루고 있어서 삽관된 튜브가 쉽게 후방으로 밀리게 되어 성문 후연합(posterior commissure)을 포함한 후성문 점막에 직접 압력이 가해져 발생한다. 장기간 기관삽관을 유지하면 점막의 미란, 궤양, 육아조직 형성에 따른 반흔화가 나타나 피열연골과 성대의 미세한 운동에 장애를 초래하게 된다. 이와 같이 기관삽관으로 인한 후성문에 발생할 수 있는 주된 병적 변화들로는 후연합이나 피열연골 사이 반흔화, 윤상피열관절의 고정으로 인한 성대운동의 저하 등이 있다.²⁾
   후성문협착은 감염, 경부 외상, 후인두역류, 유독한 가스나 부식물의 흡인에 의해서도 발생할 수 있다. 최근 재발성 호흡유두종증(respiratory papillomatosis)이나 선천적 후두기형과 같은 원인으로도 발생할 수 있다고 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾ 후성문협착이 있는 환자가 증상을 호소하게 되면 국소주사요법, 후두내 수술이나 후두절개술(laryngofissure)과 같은 외부 접근법 등에 의한 치료가 필요하다.⁵⁾ 그러나 이들 치료법에도 불구하고 후성문협착이 재발하거나 성대운동의 장애가 개선되지 않는 등의 문제가 지속될 수 있어 그 발생 자체를 예방하는 것이 중요하게 되었다.
   Mitomycin-C는 1958년 Wakaki가⁷⁾ Streptomyces caespitosus에서 자연적으로 추출한 항생제의 일종이였으나 이후 항암제의 하나로 널리 사용하는 약제이다. 이 약제는 고농도에서 세포 DNA 합성을 직접 작용해 종양의 성장을 억제한다고 알려져 있다.⁸⁾ 또한 이 약제가 저농도에서는 섬유모세포(fibroblast) 증식을 억제하는 효과가 있다고 알려지면서 안과 수술분야에서 처음으로 임상적용이 이루어지기 시작하였는데 녹내장, 익상편(pterygia), 사시나 누비관 협착 등을 수술한 후에 재협착을 예방하기 위해 사용하였다. 최근에는 이비인후과 영역에서도 고막절개술 후 개방창을 오래 유지할 목적이나 부비동내시경수술, 기관이나 후두수술 후에 협착을 방지하고자 이 약제를 임상적으로 활발하게 사용하게 되었다.^10)11)12)
   그러나 mitomycin-C를 임상적으로 광범위하게 사용하게 되었음에도 불구하고 이를 이용하여 동물실험을 통해 그 유용성을 입증한 실험들은 비교적 드문 편이었다. 따라서 저자들은 임상에서 비교적 흔히 접하면서도 그 치료가 쉽지 않았던 후성문협착에 mitomycin-C를 이용하여 그 발생을 예방할 수 있는지에 대해 토끼 후성문 창상모델을 이용하여 확인하고자 하였다. 먼저 토끼 후성문에 레이저를 이용하여 창상을 만든 후 mitomycin-C 국소도포가 후성문협착에 예방적 효과가 있는지에 대해 육안적, 조직학적 변화를 통해 살펴보았다. 

재료 및 방법

토끼 후성문 창상모델의 개발과 Mitomycin-C 국소도포
   New Zealand white breeder rabbit(Korea Biolink Co., Eumsung, Korea) 21마리를 실험에 이용하였고 xylazine 5 mg/kg, ketamine 35 mg/kg과 acepromazine 0.75 mg/kg을 토끼에 근육 주사하여 마취를 유도하였다. 몸무게 2.25~2.5 kg인 14~16주령의 수컷 토끼를 본 실험에 사용하였다. 소아용 Kleinsasser 후두경(Karl Storz GmbH & Co., Tuttlingen, Germany)을 이용한 직접후두경과 수술현미경(Carl Zeiss, Gottingen, Germany) 하에 straight microcup forceps(Karl Storz GmbH & Co.)을 사용하여 토끼 윤상연골과 피열연골을 촉진하고 수동적 운동 상태를 살펴보았다. 수술현미경에 부착된 CO₂ laser(Sharplan Lasers, Inc., Allendale, NJ)를 이용하여 후연합, 양측 피열연골과 전방으로 양측 후성대까지 후성문점막에 6 W, continuous focused mode로 레이저를 조사하였다. 레이저 조사로 조직에 생긴 그을림을 생리식염수에 적신 솜으로 닦아 내고 같은 부위에 다시 한번 레이저를 조사하였다. 후두에 레이저를 조사한 총 시간은 약 2분 정도이며 조사부위의 점막이 모두 제거되고 점막하조직이 노출되도록 하였다. 또한 각 실험동물간 창상 정도와 범위를 일정하게 하기 위해 한명의 숙달된 외과의사에 의해 레이저조사가 이루어졌고 그 손상범위를 모든 실험동물에서 telescope을 이용하여 촬영하여 기록을 남겨두었다.
   레이저 조사 후에 바로 mitomycin-C를 조사부위에 국소도포하였다. Mitomycin-C 분말을 멸균된 물에 녹여 각각 0.4 mg/ml(MMC 0.4, group 1)와 1.0 mg/ml(MMC 1.0, group 2)의 용액으로 만들고 솜에 묻혀 각 7마리씩 토끼 후성문에 5분간 덮어둔 후 생리식염수로 세척하였다. 대조군(group 3)은 mitomycin-C를 섞지 않은 생리식염수만 5분간 도포하였다. 
   모든 동물은 규격을 갖춘 시설과 환경에서 물과 토끼 사료를 양껏 제공하면서 관리하였고 이상 실험 후 2개월 후에 모든 동물을 희생하였다. 모든 실험은 본 병원 동물실험위원회의 동의를 거쳐 시행하였고 가능한 인도적인 방법으로 모든 동물실험을 진행하였다. 

육안적 조직학적 소견의 비교
   실험동물을 희생하기 전에 이상에서 설명한 방법대로 마취하고 후두원시경(30°, 24 cm length, 5 mm diameter；Karl Storz GmbH & Co.)을 이용하여 후성문을 관찰하였다. 초기 레이저 조사로 인해 후성문 점막의 반흔화, 육아조직 형성이나 후연합 협착 등과 같은 이상 소견이 없는지 관찰하고 실험에 사용한 모든 동물의 성문부를 촬영하여 기록을 남겼다. 피열연골을 microcup forceps으로 잡아 그 수동적 운동상태를 관찰한 후 동물의 심장에 sodium pentobarbital 치사량을 주입하여 모든 동물을 고통 없이 희생하였다.
   실험에 사용한 토끼 후두를 모두 수거하여 10% formaldehyde에 24시간 두고 조직에서 알코올을 제거하고 paraffin 처리하는 등 정해진 방법대로 조직을 처리하였다. 후연합을 포함하는 후성문부와 윤상피열연골부를 5 μm 간격으로 잘라 hematoxylin and eosin(H & E)과 Masson trichrome 염색을 시행하였다. 염색 후 조직에서 콜라겐이 축적된 정도를 0에서 +3까지 점수를 매기고 섬유모세포와 침윤된 염증세포의 수를(400배 고배율에서 관찰하여 기록하였다. 또한 모세혈관생성을 관찰하고자(40배 저배율에서 먼저 관찰하여 모세혈관수가 가장 많은 곳을 찾아 다시 (200배 시야에서 그 숫자를 세어 기록하였다. 이상의 조직학적 관찰은 두 명의 숙련된 병리의사에 의해 이루어졌고 두 사람간 오차 범위는 7.5% 이내였다. 또한 손상 받았던 토끼의 후두 미세 소견을 한번도 손상 경험이 없었던 정상적인 네 마리의 토끼 후두와 비교하였다.
   각 군에서 육안과 조직학적 검사를 통해 나온 데이터는 평균과 표준편차로 표시하였고 SPSS 10.0 for windows(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용해 통계분석을 시행하였다. 육안적 관찰에서 점막의 반흔화, 육아조직 형성이나 후연합 협착과 같은 발생빈도를 나타내는 비연속변수들은 Fischer's exact test를 이용하였다. 조직학적 관찰에서 콜라겐 축척, 섬유모세포, 염증세포와 모세혈관 수는 Mann-Whitney test를 이용하여 통계 검증 하였으며 p값이 .05이하일 때 통계적 의미가 있는 것으로 간주하였다.

결     과

   실험에 사용했던 토끼 중 한 마리만이 초기 실험 후 사망하였고 나머지 20마리 모두 희생할 때까지 살아 있었으며 경과 관찰 중에 감염이나 출혈 등의 문제들은 발생하지 않았다.

육안적 관찰 사항들의 분석
   후두원시경과 촬영한 사진을 통해 성문부를 관찰하였을 때 레이저에 의해 손상을 입었던 후성문부에서 반흔과 육아조직형성과 같은 이상 소견들이 명확하게 관찰되었다. 육아조직은 후연합부와 피열연골의 성문돌기나 몸체부의 내면에 위치하였고 하얀 반흔도 관찰되었다(Fig. 1). 이러한 반흔과 육아조직들은 후연합과 그에 가까운 후성문부에 주로 발생하였다. 육안으로 관찰된 육아조직들은 H & E 염색을 통해 현미경적으로도 확인할 수 있었다(Fig. 2). 후성문부에 생긴 반흔과 육아조직은 대조군에서 모두 7 마리 중 3 마리에서 관찰되었으나 피열연골의 수동적 운동검사에서 그 운동이 제한되었던 것은 그 중 한 마리에서만 관찰할 수 있었다(Table 1). Mitomycin-C를 국소 도포하였던 군에서는 이와 같은 반흔이나 육아조직 생성이 13마리 중 3마리에서만 관찰되었고(p=.016) 후연합 유착이나 피열연골의 운동 제한은 한 마리에서도 발견할 수 없었다. 그러나 실험에 사용한 mitomycin-C의 용량에 따른 육안적 관찰 항목들의 차이는 발견할 수 없었다. 

현미경적 관찰 사항들의 분석
   현미경적 관찰에서 2개월 전에 레이저조사를 받았던 토끼 후두에서 축적된 콜라겐 양이 정상 토끼 후두보다 증가되었다(Fig. 3A and B). 콜라겐 축척과 함께 섬유모세포의 증식과 염증세포의 침윤이 나타나 그 세포수가 증가되었고 모세혈관 생성이 동반되었다(Fig. 3C, Table 1). 또한 레이저 조사부에서 점막하선이 완전히 소실됨을 관찰할 수 있었으나 윤상피열연골접합부의 섬유화와 같은 이상 소견들은 발견할 수 없었다(Fig. 3D). Mitomycin-C을 국소 도포하였던 토끼 후성문에서는 콜라겐 양과 섬유모세포의 증식이 현저하게 억제되었다(p<.02). 그러나 이러한 효과에 대해 mitomycin-C의 용량에 따른 차이는 발견할 수 없었으며(group 1과 group 2, p>.3) 염증세포나 모세혈관 수는 mitomycin-C 처리군이나 대조군에서 차이를 보이지 않았다. 또한 mitomycin-C를 처리하였던 군에서도 점막하선이 모두 소실되었고 그 재생은 관찰할 수 없었다.

고     찰

   후성문협착은 주로 장기간 기관내삽관에 따른 후성문 손상으로 인해 발생하는 비교적 흔하게 접할 수 있으나 자주 간과되는 문제 질환이다.³⁾ 그러나 이 질환의 중요함에도 불구하고 발병과정을 이해하고 그 발생을 예방하고자 하는 연구가 부족하였다. 최근 개를 이용한 실험에서 일측 후성문에 레이저를 조사하여 창상을 만들고 반대측은 손상부와 대조를 위해 창상을 만들지 않았다.¹³⁾¹⁴⁾ 그 저자들은 후성문협착의 주된 병변을 윤상피열연골접합부 고정으로 생각하여 이에 중점을 두고 레이저를 이 곳에 직접 조사하는 실험방법을 택했다. 그러나 실제 임상에서는 기관내삽관에 따른 후두 손상 초기에는 후성문부 중 후연합이나 피열연골 사이 반흔이 가장 흔히 나타나고 피열윤상연골접합부 유착은 비교적 후기에 나타나 심하게 손상 받은 환자의 후두에서 발견된다.²⁾³⁾ 따라서 이전 동물실험 모델에서는 후성문부에 발생하는 흔한 병적 변화들의 관찰과는 거리가 있어서 본 실험에서는 후연합을 포함한 후성문부 양측 모두에 손상을 가하는 동물 모델을 제작하게 되었다. 
   본 실험에 사용한 토끼 후성문부에 레이저 조사로 인해 후성문협착에서 발견되는 여러 병적 변화들을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 후성문부에 창상을 만들고 2개월 후에 희생한 대부분의 토끼 후성문부에서 반흔과 육아조직이 형성되었고 후연합 유착은 약 절반 수에서 발견할 수 있었다. 그러나 피열연골의 수동적 운동 제한은 한 마리에서만 관찰되어 이러한 소견들이 실제로 성문 운동에 심각한 영향을 주지는 않았던 것으로 생각할 수 있다. 이와 같은 관찰사항은 윤상피열연골접합부를 현미경적으로 관찰하였을 때 섬유화와 같은 이상이 발견되지 않았던 것과 그 맥락을 같이한다. 또한 이 관절부에 직접적인 손상 없이 후성문부 점막에 국한된 손상만으로 윤상피열연골 운동의 제한을 초래하지 않았다는 기존 보고들과 일치한다.¹³⁾¹⁴⁾ 또한 육안적으로 관찰된 후성문부의 반흔과 유착은 현미경적 관찰에서 섬유모세포의 증식에 따른 콜라겐의 증가와 동반되어 나타났다는 사실을 발견할 수 있었다. 따라서 이러한 현미경적 변화가 후성문부 손상에 따른 육안적 변화와 밀접한 관계가 있다는 것을 암시한다. 이상에서 관찰된 사항들을 고려해 볼 때 후연합부 반흔과 육아조직 생성과 같은 초기 관찰 항목들이 윤상피열연골 관절의 유착보다 흔히 발생한다는 임상 관찰과 부합하는 소견으로 그 의의가 있다고 하겠다.
   본 실험에서 국소 도포한 mitomycin-C가 레이저손상을 받아 후성문에 나타날 수 있는 육안적, 현미경적 변화들의 발생률을 의미 있게 낮췄다. 여러 결과들을 종합해 볼 때 mitomycin-C에 의해 섬유모세포의 증식이 억제되어 손상부에서 콜라겐 축척이 억제되고 육안적으로 후성문부의 반흔과 육아조직 생성이 줄어들게 되었다고 할 수 있다. 그러나 침윤된 염증세포와 모세혈관 수는 mitomycin-C에 의해 영향 받지 않아 이 약제가 주로 섬유모세포 증식과 이에 따른 콜라겐 축척에만 주로 영향을 준다는 사실을 발견할 수 있었다. 이상의 결과들은 이전에 발표되었던 여러 보고들과^{9)10)11)12)14)} 일치하고 mitomycin-C가 섬유모세포를 통한 섬유화를 억제하는 효과로 인해 후성문협착을 예방할 수 있다는 사실을 본 실험에서도 확인할 수 있었다. 또한 실험에 사용한 mitomycin-C 두 가지 용량(0.4 mg/ml와 1.0 mg/ml)은 서로 비슷한 효과를 나타낸 것도 흥미 있는 결과로 볼 수 있다. 이 용량은 이전에 개를 이용한 후성문협착 모델에 사용한 것(10 mg/ml)보다 훨씬 낮은 것이지만 임상에서 부작용 없이 바로 사용할 수 있는 용량이라는데 그 의의가 있다고 할 수 있다. 또한 이 같은 사실은 in vitro 실험에서도 확인된 바 있는데 저용량의 mitomycin-C 처리만으로도 인체 섬유모세포 증식이 효과적으로 억제될 수 있다고 보고되었다.⁹⁾
   본 실험의 결과들은 임상적으로 매우 유용한 정보를 담고 있다. 기관내삽관 후 발생하는 후두 손상은 급성기, 만성기와 치유기의 세 단계를 거치게 되는데 급성기에는 후연합 점막의 염증과 궤양이 주로 나타나게 되고 만성기에는 육아조직과 윤상연골이나 피열연골의 노출 등이 나타날 수 있다. 후성문협착은 이러한 손상이 치유되지 않고 남은 것으로 본 실험결과로 볼 때 mitomycin-C를 후두 손상 초기에 사용하면 만성기로 이행하여 후성문부협착이 영구적으로 남게 되는 것을 예방할 수도 있다. 따라서 10일 이상 기관내삽관을 했던 병력이 있었던 환자는 후두내시경 검사가 필요하고 만약 후두에 이상 소견들이 관찰된다면 mitomycin-C 국소도포를 통해 이러한 병적 소견들이 영구적인 변화를 일으키는 것을 막을 수 있을 것이다. 이뿐만 아니라 재발성 호흡기유두종증, 선천적 혹은 후천적 후두협착과 후성문에 국한된 비교적 초기 종양을 후두내수술(endolaryngeal surgery)을 통해 제거하고자 할 때도 수술 후 발생할 수 있는 후성문협착을 방지하기 위해 mitomycin-C를 이 부위에 예방적 목적으로 수술 중에 사용할 수 있겠다.

결     론

   토끼의 후성문협착 모델을 이용한 실험에서 mitomycin-C의 국소도포가 섬유모세포 증식을 억제하여 레이저조사로 인해 손상 받은 후성문부의 섬유화를 억제하고 반흔, 육아조직 형성이나 후성문부 유착을 예방한다는 사실을 확인할 수 있었다. 본 실험 결과들로 볼 때 장기간 기관내삽관을 했던 병력이 있거나 후성문부 수술을 받은 환자들에서 mitomycin-C를 사용하여 손상에 따른 후성문협착으로 이행하는 것을 예방할 수 있다. 

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