교신저자：이재훈, 570-711 전북 익산시 신용동 344-2  원광대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   오존 및 배기가스를 포함한 대기오염물질은 호흡상피에 산화 스트레스로 인한 독성효과를 일으켜 천식 및 알레르기비염의 발생 및 증상악화를 일으킬 수 있다. 산화물에 대한 신체내 방어작용으로 항산화 효소인 glutathione S-transferase(GST) superfamilies(GSTM1, GSTT1, GSTP1)가 reactive oxygen species(ROS)의 생성을 억제하는데 중요한 역할을 한다.¹⁾ GST은 호흡상피에서 발현되어 산화물을 해독하는데 작용한다.²⁾ 산화물에 대한 GST의 작용은 개인적 GST 유전자 감수성에 의해 영향을 받을 수 있다.³⁾ GSTM1과 GSTT1 유전자의 동형 결실 유전자 다형성(homozygous deletion polymorphism, null type)은 항산화효소의 기능을 잃게 된다.²⁾ 디젤 배출 미분자를 이용한 비강내 유발 검사에서 GSTM1 null 유형의 개인들에서 항산화기능을 가진 GSTM1 wild 유형의 개인들에 비해 디젤 배출 미분자 노출 후 비세척액에서 IgE와 히스타민이 유의하게 증가되었다.⁴⁾ GSTM1 null 유형의 개인들에서 GSTM1 wild 유형의 개인들에 비해 대기오염와 같은 산화 스트레스로 인해 비강내 알레르기 반응이 촉진된다.⁴⁾
   GST 유전자 다형성은 주로 천식환자를 대상으로 하여 GSTM1과 GSTT1 null 유형에서 감수성이 있음이 보고되었으나,^3)5)6)7) 알레르기비염환자를 대상으로 한 보고는 아직까지 없었다. 이에 저자들은 한국인 알레르기비염환자를 대상으로 GSTM1과 GSTT1 null 유형과의 감수성여부를 알아보고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   실험군은 2002년 1월부터 2004년 3월까지 알레르기비염의 증상으로 본원을 방문하여 피부반응검사에서 알레르기비염으로 확진된 287명을 대상으로 하였다. 알레르기비염 진단은 흔한 항원(house dust mites, house dust, grass mix, tree pollens, animal dander, molds)에 대한 단자검사용 시약(Torii, Tokyo, Japan)을 이용한 피부반응검사에서 한 가지 이상의 항원에서 강양성 반응을 보인 경우로 하였다. 대조군은 건강 검진을 위해 본 병원을 방문한 262명을 대상으로 하였고 설문지를 통해 알레르기 질환의 증상들과 피부 단자 검사에 음성을 보인 경우로 하였다. 평균 연령은 대조군에서 28.2±10.5세, 실험군에서 26.3±11.2세로 통계학적 차이가 없었으며, 남녀성비는 대조군은 남 : 여=142 : 120, 실험군은 남 : 여= 156 : 131으로 통계학적 차이가 없었다. 

방  법 
   GST 유전자형 분석은 Miller 등⁸⁾의 방법으로 말초 혈액에서 분리된 유핵 세포로 부터 genomic DNA를 추출하고자 말초 혈액내 유핵 세포를 3% dextran이 들어있는 생리 식염수로 분리하였다. 남아 있는 적혈구는 0.2% 저장식염수를 이용하여 용혈시켜 제거하고 얻어진 백혈구를 10% sodium dodecyl sulfate(SDS)로 처리한 후 phenol, chloroform 및 isopropanol을 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 그리고 동형 결실의 경우에서만 확인이 가능한 multiplex PCR 방법으로 GSTM1과 GSTT1 유전자형을 확인하였다. 백혈구로부터 추출된 genomic DNA를 template로 하였으며, GSTT1에 대한 PCR primer(Bioneer, Daejon, Korea)는 5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC와 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA, GSTM1에 대한 PCR primer는 5'-GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC, 5'-GTTGGCTCAAATATACGGTGG, β-globin에 대한 PCR primer는 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3', 5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'을 주문제작하여 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 genomic DNA 1 μg, primer 각각 10 pmol씩, dNTP 혼합체 200 μM, MgCl2 1.5 mM, Tris-Hcl 10 mM(pH 8.0), Taq polymerase(TaKaRa, Otsu, Japan) 2.0 unit를 섞어 총 용량이 50 μl로 하였다. PCR 반응은 초기 denaturation 94℃ 5분 반응 후 94℃ 1분, 59℃ 1분을 35회 반복한 후 마지막 72℃에서 1분간 extension 하여 증폭시켰다(MJ Research, Waltham, Massachusetts, USA). 그리하여 GSTT1에 대한 480 bp, GSTM1에 대한 219 bp 그리고 β-globin에 대한 268 bp의 분절들을 얻었다. PCR의 정확성을 높이기 위하여 β-globin 대조군의 경우 GSTT1과 GSTM1 PCR의 증폭율이 동일함을 확인하였고, 양성대조군과 음성대조군은 모든 PCR 산물에서 DNA 대신 물로 하였다. PCR 산물은 2% agarose gel에서 전기영동시켜 ethidium bromide로 염색하여 최종 유전자형을 확인하였다.

통계처리
   환자군과 대조군의 GST 유전자 다형성 분포 차이에 대한 평가는 χ²검사를 사용하였다. 통계 처리는 SPSS pro-gram version 10(SPSS Inc. Chicago, IL, U.S.A.)을 이용하였다. 

결     과

GSTM1 및 GSTT1 유전자 다형성 유형
   GSTM1의 유전자 다형성은 2가지 유형(null형, wild형)을 보였다. Wild형은 219 bp의 분절을 보였고, null형은 분절이 보이지 않았다(Fig. 1). GSTT1의 유전자 다형성은 2가지 유형(null형, wild형)을 보였다. Wild형은 480 bp의 분절을 보였고, null형은 보이지 않았다(Fig. 1). 

GSTM1 및 GSTT1 유전자 다형성 유형 분포
   환자군에서 GSTM1 유전자 다형성 유형은 null형이 24%, wild형이 76%, 대조군에서는 null형이 32%, wild형이 68%로 null형이 대조군에서 높은 빈도를 보였으며 두 군 사이에 유의한 차이가 있었다(Table 1). 환자군에서 GSTT1 유전자 다형성 유형은 null형이 44.6%, wild형이 55.4%, 대조군에서는 null형이 48.5%, wild형이 51.5%로 두 군 사이에 유의한 차이가 없었다(Table 1). 

고     찰

   두가지의 supergene families가 GST 활성에 관여하는 단백질들을 암호화하고, 이를 암호화하는 유전자는 세포 사이토졸과 막에서 발현된다.²⁾ 사이토졸 효소들을 암호화하는 유전자들은 Alpha(GSTA), Mu(GSTM), Pi(GSTP), Theta(GSTT), Zeta(GSTZ)가 알려져 있다.⁹⁾ 이러한 유전자들 중 Mu, Theta 그리고 Pi에 대한 유전자 다형성에 관심이 많아지고 있다.²⁾ GSTM1, GSTT1, GSTP1과 같은 흔한 대립인자 변이들이 존재하며, GST 유전자 다형성이 천식을 포함한 염증성 질환에 관여 할 수 있다.⁵⁾ 
   급속한 산업 발달과 더불어 공기 오염과 같은 환경적 변화는 호흡기의 염증 발생에 크게 관여할 수 있다. 오존은 대표적으로 호흡기에 영향을 주는 강력한 산화물로 알려져 있다. 오존은 호흡기에 염증을 일으키며 ROS를 생성하게 되는데 산화 스트레스기전을 통하게 된다.¹⁰⁾ 내인 및 외인의 독성 혹은 발암물질의 해독에 관여하는 GST 효소는 가장 대표적인 phase II 효소로 알려져 있다.¹¹⁾ GST의 유전자형에 따라 유전적 감수성에 따른 다양한 개인별 차이가 있을 수 있으며, GSTM1 및 GSTT1의 null 유전자형은 효소의 해독 기능을 잃게 된다.²⁾ 임신 중 담배에 노출된 GSTM1 null 유전자형 어린이에서 천식 유병율이 높았으며, GSTP1 Ile105 wild 유전자형은 학동기 어린이에서 호흡기 감염의 발생과 심함에 영향을 준다.⁵⁾ 최근 천식과 GSTM1, GSTT1, CC16의 유전자 다형성들과의 관계연구에 의하면 GSTM1과 GSTT1의 null 유전자형의 빈도에 대한 성별과의 연관성은 없으나 GSTM1 null 유전자형을 가진 군에서 GSTM1 wild 유전자형을 가진 군보다 3.17배의 천식발생위험률을 보였고, GSTT1 null 유전자형은 GSTT1 wild 유전자형을 가진 군보다 2.62배의 천식발생위험률을 보였다.⁵⁾ 105Ile에서 105Val으로 치환되는 GSTP1 유전자의 exon 5에서의 다형성은 아토피성 환자들에서 val105/val105(동형 돌연변이)의 빈도가 비아토피성 환자들에 비해 감소된 소견을 보였다.¹²⁾ GSTP1 val105/val105의 빈도는 심한 기도과민성을 가진 환자들에서 심하지 않은 기도과민성을 가진 환자들에서 비해 유의하게 적었다.¹³⁾ 이러한 결과들은 GSTP1 val105/val105이 천식의 발생 감소 및 증상 악화 억제에 관여할 수 있음을 시사한다. GST 유전자에 의해 암호화하는 효소들은 ROS의 조절을 통해 eicosanoids의 합성에 영향을 줄 수 있으므로 천식 발생에 관여할 수 있다.¹⁴⁾ 비강유발검사상 GSTP1 Ile105 wild 유전자형은 디젤 배출 미분자에 대한 비강 내 알레르기 반응을 촉진한다.⁴⁾ 서양인 천식환자를 대상으로 한 GST 유전자 다형성 연구에서 GSTM1 null 유전자형과 GSTT1 null 유전자형이 천식환자와의 연관성이 있었다.^3)5)6)7) 
   본 연구의 결과 GSTM1 null 유전자형은 대조군에서 32%, 실험군에서 24%로 예상과는 달리 오히려 대조군에서 높은 빈도를 보였으며 통계학적으로 유의하였다. GSTT1 null 유전자형은 정상군에서 48.5%, 실험군에서 44.6%로 대조군에서 높은 빈도를 보였으나 통계학적으로 유의하지 않았다. 지금까지 천식환자를 대상으로 한 연구들^3)5)6)7)과 본 연구와는 상이한 결과를 보였다. 저자들은 GSTM1 null 유전자형과 GSTT1 null 유전자형은 한국인 알레르기비염환자의 유전적 감수성 결정에 관여하지 않을 것으로 추정하였다. 본 연구가 알레르기비염환자에서의 GST 유전자 다형성에 대한 첫 연구이어서 다른 연구결과들과 비교 할 수 없었다. 그러나 GSTT1와 GSTM1 유전자 다형성에 대한 감수성이 천식과 알레르기비염에서 차이를 보일 수 있고, 병리 기전에서 대기오염과 같은 산화물에 의한 천식 발생과 악화에 보다 더 중요한 감수성을 줄 수 있음을 시사 할 수도 있다. 또한, 알레르기비염의 병태생리에서 다양한 인종과 노출된 항원에 의한 환경적인 요건에 따라 유전자 다형성과의 연관성에 차이를 보일 수 있다. 보고된 GSM1 null형과 GSTT1 null형의 동시 발생비율이 정상대조군에서 빈도를 보면 서양인에서 5~12.5%, 동양인에서 22~37%로 인종간의 빈도의 차이가 있어 GST 유전자 다형성이 인종에 따라 다른 영향을 줄 수 있다.⁷⁾ 인종에 다른 알레르기비염환자를 대상으로 한 앞으로의 많은 연구들이 이루어져 GSTM1 null과 GSTT1 null 유전자형이 알레르기비염환자에서 유전적 감수성에 역할에 대해 명백히 밝혀질 수 있을 것으로 생각된다. 
   결론적으로 본 연구결과를 토대로 GSTM1 null과 GSTT1 null 유전자형은 한국인 알레르기비염의 유전적 감수성 결정에 관여하지 않을 것으로 생각된다. 향후 한국인 알레르기비염환자의 GSTP1의 유전자 다형성의 연관성연구가 필요할 것으로 생각된다. 

1. Kelly FJ. Oxidative stress: Its role in air pollution and adverse health effects. Occup Environ Health 2003;60:612-6.

2. Hayes JD, Strange RC. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences. Pharmacology 2000;61:154-66.

3. David G, Romieu I, Sienra-Monge JJ, Collins WJ, Ramirez-Aguilar M, del Rio-Navarro BE, et al. Nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate) reduced: Quinone oxidoreductase and glutathione S-transferase M1 polymorphisms and childhood asthma. Am J Res Crit Care Med 2003;168:1199-204.

4. Bastain TM, Gilliland FD, LI Y-F, Saxon A, Diaz-Sanchez D. Intrain-dividual reproducibility of nasal allergic responses to diesel exhaust particles indicates a susceptible phenotype. Clin Immunol 2003;109: 130-6.

5. Gilliland FD, Rappaport EB, Berhane K, Islam T, Dubeau L, Gauderman WJ, et al. Effects of glutathione S-transferase P1, M1 and T1 on acute respiratory illness in school children. Am J Respir Crit Care Med 2002;166:346-51.

6. Saadat M, Saadat I, Saboori Z, Emad A. Combination of CC16, GSTM1, and GSTT1 genetic polymorphisms is associated with asthma. J Allergy Clin Immunol 2004;113:996-8.

7. Ivaschenko TE, Sideleva OG, Baranov VS. Glutathione-S-transferase and theta gene polymorphisms as new risk factors of atopic bronchial asthma. J Mol Med 2002;80:39-43.

8. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16:1215.

9. Unal M, Tamer L, Ates NA, Akbas Y, Pata YS, Vayisoglu Y, et al. Glutathione S-transferase P1, M1 and T1 gene polymorphisms in laryngeal squamous cell carcinoma. Am J Otolaryngol 2004;25:318-22.

10. Mudway IS, Kelly FJ. Ozone and the lung: A sensitive issue. Mol Aspects Med 2000;21:1-48.

11. Lee SH, Kim YR, Nam SY, Choi SH, Park JJ, Choi EK, et al. Single nucleotide polymorphism analysis in larynx and hypopharynx squamous cell carcinoma. Korean J Otolaryngol 2004;47:885-92.

12. Fryer AA, Bianco A, Hepple M, Jones PW, Strange RC, Spiteri MA. Polymorphism at the glutathione-S-transferase, GSTP1 locus: A new marker for bronchial hyperresponsiveness and asthma. Am J Res Crit Care Med 2000;161:1437-42.

13. Stange RC, Spiteri MA, Ramachandran S, Fryer AA. Glutathione-S-transferase family of enzymes. Mutat Res 2001;482:21-6.

14. Hayes JD, Strong RC. Potential contribution of the glutathione S-transferase supergene family to resistance to oxidative stress. Free Radic Res Commun 1995;22:193-207.