교신저자：전시영, 660-702 경남 진주시 칠암동 90번지  경상대학교 의과대학 경상대학교병원 이비인후과학교실
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서     론

   비부비동염의 발병기전을 연구하기 위해서는 실험적 비부비동염의 유발이 필수적이다. 현재까지 실험적 비부비동염에 대한 연구로는 Hilding이 토끼 상악동의 자연공 부근에 비-상악동창을 만들어서 화농성 비부비동염을 유발 시킨 것을 시작으로,¹⁾ Maeyama가 2.5% 난백알부민으로 감작시킨 토끼의 상악동내에 포도상 구균을 주입하여 발생시킨 비부비동염의 병리조직학적 변화를 관찰하였다.²⁾ Kumlien과 Schiratzki는 토끼의 상악동내에 이물과 폐렴구균을 동시에 주입하여 비부비동염을 유발시켰으며,³⁾ Min 등⁴⁾은 상악동 자연공을 골편으로 폐쇄한 후 폐렴구균을 주입하여 급성 비부비동염을 유발 시켰다. 이러한 기존의 방법들은 비부비동염의 유발에 있어서 상악동 자연공의 폐쇄와 세균주입이 필요하였다. 그러나 이 방법들은 상악동 자연공을 인위적으로 폐쇄하여야 하고 세균을 주입해야 하므로 상악동을 노출할 때 이로 인한 상악동 자체의 손상과 이차적 염증을 유발시킬 가능성이 있어 실제 비부비동염의 치유과정을 이해하는데 한계가 있다.
   실험적 비부비동염의 연구에 가장 적합한 동물로 토끼가 널리 이용되어 왔다.^{1)2)3)4)5)6)7)8)} 비교적 크기가 큰 동물로서 수술적 조작이 용이하기 때문이다. 그러나 토끼는 비부비동염을 유발하기 위하여 상악동 자연공을 인위적으로 폐쇄하여야 하고 유전적 조작, 염증반응에 관여하는 다양한 염증 매개체와 항체에 대한 실험적 조작이 용이하지 않기 때문에 최근 생쥐를 이용한 실험적 비부비동염 모델이 개발되어 보고되고 있다.
   Bomer 등⁹⁾은 생쥐의 비강내에 폐렴구균을 주입하여 유발시킨 급성 비부비동염의 생쥐모델을 보고하였다. 흰쥐는 의학적 연구에 광범위하게 사용되며 신뢰도가 높은 동물이다. 생쥐에 비하여 크기가 커 실험적 조작이 용이하다. 흰쥐의 비강 및 비부비동은 사람과 유사한 해부학적 구조를 가지고 있으며 조직학적으로도 흰쥐의 부비동은 호흡상피로 이루어져 있어 사람의 비부비동염을 연구하는데 적합한 실험적 비부비동염의 새로운 모델이라고 생각된다. 따라서 본 교실에서는 흰쥐를 이용하여 혈소판 활성인자에 의해 실험적 비부비동염을 유발시킨 모델을 발표하였다.¹⁰⁾
   세균을 이용한 비부비동염의 대부분의 연구에서 가장 흔히 사용되고 있는 병원균은 Streptococcus pneumoniae나 Bacteroides fragilis이다. 또한 포도상 구균(Staphylococcus aureus)도 급성 비부비동염을 유발시키는 비교적 흔한 균주이다. 아직까지 흰쥐를 이용하여 세균을 직접 점적하여 만든 비부비동염 실험모델은 보고된 바가 없다.
   따라서 본 연구의 목적은 세균성 비부비동염의 흔한 균주인 포도상 구균을 이용하여 급성 비부비동염 흰쥐 실험모델을 만들고자 하였다.

대상 및 방법

실험동물
   체중 60~70 g의 외견상 건강하고, 비공이 깨끗한 4주령의 Sprague-Dawley계의 24마리의 수컷 흰쥐를 사용하였으며, 이들을 실험군 15마리와 대조군 9마리로 나누었으며 실험기간 중에는 경상대학교병원 동물 사육장에서 동일한 조건 하에서 사육하였다.

흰쥐의 정상적인 해부학적 구조
   먼저 흰쥐의 정상 해부학적 구조를 관찰하기 위해 코주둥이에서 비인강까지 네등분하여 각각 Level I에서 Level IV로 명명하였다(Fig. 1). 그런 후에 각각을 조직염색 처리한 결과 흰쥐의 사골동과 상악동 그리고 비점막 림프조직(nasal-associated lymphoid tissue)를 모두 포함하고 있었기 때문에 비부비동염 실험을 위해서 Level III 부위를 선택하였다(Fig. 2).

포도상 구균에 의한 급성 비부비동염 흰쥐 모델제작과 조직처리
   Ketamine hydrocloride(Ketalar, 75 mg/kg)와 xylazine hydrocloride(Rampun, 10 mg/kg)의 혼합용액을 흰쥐의 복강내 주사하여 마취하였다. 마취가 된 흰쥐는 기도확보를 위해 머리를 약 30도 정도 낮게 한 다음 실험군 흰쥐 15 마리에는 spectrophotometer(VITEK, USA)로 McFarland No.1 혼탁 정도를 보이는 10⁸ colony-forming unit(CFU)/ml의 포도상 구균(ATCC 25923)를 흰쥐의 양쪽 코구멍에 각 40 μl씩 micropippet을 이용하여 점적 하였으며, 대조군 흰쥐 9마리에는 실험군과 동일한 양과 방법으로 0.45% 생리식염수를 점적하였다. 그리고 실험군과 대조군을 2일, 5일, 그리고 14일간(각각 실험군 5마리, 대조군 3마리)의 생존기간을 둔 후 각각 해당 일에 비강내 세균배양을 실시한 후 그 다음날에 코흐의 가설에 의하여 동일 균주인 포도상 구균임을 확인하였다. 관류고정은 먼저 200 ml의 생리식염수 를 관류시키고 이어서 2% paraformaldehyde 첨가, 0.1 M 인산완충액의 고정 액 200 ml로 관류고정을 하였다. 관류고정이 끝난 후 흰쥐의 머리를 적출하여 눈, 피부, 근육, 하악골과 혀를 저배율의 현미경에서 제거한 후 동일 고정액에 2시간 동안 4℃에 담궈 후고정을 하였다. 동일 고정액에 16시간 동안 더 침습고정 한 후 0.1 M 인산완충용액에 5분간 씩 3회 세척한 후에 5% nitric acid 용액에 3일간 담궈 탈회를 실시하였다. 탈회가 되어 조직이 연하게 되면 흰쥐의 머리부위 중 level III 부위를 자른 후 적출하여 흐르는 물에 약 16~18시간동안 세척을 시킨 후 탈수 과정을 거쳐 그 다음 날에 파라핀에 조직을 고정시켰다. 파라핀에 조직을 고정시킨 후 4~5 μm 두께로 연속절편을 제작하였고 탈파라핀화 과정을 거친 후 형태학적 관찰을 위해 hematoxylin-eosin 염색을 시행하였다.

병리조직학적 결과 판정
   포도상 구균을 투여한 실험군과 0.45% 생리식염수를 투여한 대조군에서 염색된 각 조직에서 40배의 저배율에서 관찰하여 모든 부비동강에서 염증 세포 군집을 이루는 부비동강의 수를 백분율로 나타내었고(Figs. 3 and 4), 비점막림프조직과 배중심(germinal center)은 40배 저배율에서 보이는 모든 수를 세었다(Fig. 5).

통계분석
   대조군과 실험군 간의 차이는 t-test를 이용하였으며, 대조군과 실험군의 시간별 차이는 일원분산분석(ANOVA)과 post hock test를 이용하였다. 유의 수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

염증세포 군집
   대조군과 실험군간의 시간적 차이는 2일, 5일째에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.05). 실험군에서의 시간적 차이는 2일째에서 염증세포 군집이 관찰되어 5일째에 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.05) 하였으며 14일째에는 감소하는 소견을 보였다(Fig. 6). 대조군간의 차이(ANOVA)는 서로 유의한 차이를 보이지 않았다.

비점막림프조직
   대조군과 실험군간의 시간적 차이는 5일째에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.05). 실험군에서의 시간적 차이는 2일째에 비점막림프조직의 증가가 관찰되어 5일째에 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.05) 하였으며 14일째에는 감소하는 소견을 보였다(Fig. 7).

배중심
   배중심의 수는 대조군과 실험군간의 시간적 차이는 통계적으로는 유의한 차이를 보이지 않았으나 5일째에 증가되는 경향을 보였고. 실험군 간에서도 유의한 차이를 보이지 않았으나 5일째에는 증가하는 경향을 보였다(Fig. 8). 

고     찰

   비부비동염의 실험적 모델로는 과거에는 대부분 토끼를 이용하였다.^{1)2)3)4)5)6)7)8)} 그러나 최근 들어서는 생쥐를 이용한 실험들이 많이 보고되고 있다.⁹⁾ 하지만 흰쥐를 이용한 비부비동염 모델은 본 교실에서 혈소판활성인자를 이용하여 만든 흰쥐의 모델을 보고한 바 있다.¹⁰⁾
   급성 세균성 비부동염을 일으키는 흔한 균주로서는 Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, 그리고 Moraxella catarrhalis 등이 알려져 있다.¹¹⁾ 따라서 세균을 이용한 비부비동염의 실험적 모델에서 사용 되는 균주는 대부분 Streptococcus pneumoniae와 Bacteroides fragilis 등 이다.¹²⁾¹³⁾ Merino 등¹³⁾은 만성 부비동염으로 진단된 사람에게서 510예의 상악동 천자 세균배양검사를 시행하여 만성 부비동염의 호기성 원인 균주 중 포도상 구균이 네번째로 흔한 균주라고 보고하였으며, Brook 등¹⁴⁾도 급성 재발성 비부비동염을 일으키는 흔한 균주로 Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, 그리고 포도상 구균을 보고하였다. 그리고 급·만성 접형동염을 일으키는 가장 흔한 균주가 포도상 구균이라는 보고도 있다.¹⁵⁾
   이에 본 연구에서는 실험 동물로서는 생쥐보다 조작이 용이한 흰쥐를 선택하였고 비부비동염을 일으키는 비교적 흔한 균주인 포도상 구균을 이용하여 비부비동염을 유발시켜서 급성 비부비동염의 병리기전을 이해 하고자 하였다.
   본 연구에서는 흰쥐의 양쪽 콧구멍에 McFarland No.1 정도의 혼탁, 즉 108 CFU/ml에 해당하는 포도상 구균을 각각 40 μl씩 점적하였다. 포도상 구균의 농도를 위와 같이 정한 이유는 대부분의 세균을 이용한 비부비동염 실험에서 약 108 CFU/ml정도의 세균수를 사용하였으며, 40 μl씩 양쪽 콧구멍에 점적한 이유는 Bomer 등⁹⁾의 생쥐 실험에서 20~25 μl 정도의 용액에 견딜 수 있다고 발표하였기 때문이다. 이에 흰쥐는 생쥐보다 크므로 이보다 약간 많은 양으로 비강 내에 점적하였다. 또한 본 연구에서는 각각 50 μl 이상을 점적한 결과 흰쥐는 견디지 못하고 질식사하였으므로 이보다 작은 40 μl씩을 점적하였다.
   급성 비부비동염의 병리학적 소견으로는 광학현미경관찰에서 상피하 부종, 소정맥의 확장, 배상세포(goblet cell)의 형성, 섬모의 융합 및 탈락, 상피 세포의 괴사 및 궤양, 중성구, 임파구, 형질세포, 대식세포 등의 염증세포 침윤, 편평상피로의 이행 등이 보고되고 있다.¹⁰⁾ Bomer 등⁹⁾은 Streptococcus pneumoniae를 생쥐의 비강 내에 접종하여 광학 현미경소견으로 중성구 군집과 중성구의 관찰로 급성 세균성 비부비동염의 생쥐모델을 보고하였는데 세균 접종 후 5일째에서 중성구 군집과 중성구 수의 증가로 생쥐에서 세균에 의한 비부비동염이 유발됨을 보고하였다. 따라서 본 연구에서도 염증세포 군집을 관찰하였다. 관찰된 염증세포 군집은 흰쥐의 비부비동강내에서 40배의 저배율로 모든 부비동강에서 염증세포 군집을 이루는 부비동강의 수를 백분율로 나타내었다. 포도상 구균을 비강 내로 점적한 실험군의 2일째에서 염증세포 군집이 관찰되어 5일째에 그 수가 현저히 증가(p<0.05)를 보였으며 14일째에는 감소하는 소견을 보였다(Table 1). 이러한 결과는 포도상 구균에 의한 급성 비부비동염의 흰쥐 모델이 가능함을 뒷받침해주고 있다.
   한편 소화기와 호흡기 점막하 부위에는 피막이 없이 림프구 또는 배중심이 형성되어 있는 림프여포들이 흩어져 있으며 이 조직을 점막림프조직(mucosal associated lymphoid tissue)이라 부른다. 이들 중 잘 알려진 것이 소화기점막림프조직(gut associated lymphoid tissue)과 기관지점막 림프조직(bronchus associated lymphoid tissue)이다. 비점막림프조직은 호흡기에서 주된 점막림프조직로서 설치류에서는 비인두관의 입구에 양측으로 존재하는 림프조직이다. 인간의 구개편도 및 아데노이드와 유사한 역할을 하는 면역기관으로 알려져있다. 이 조직의 기능은 어떤 특정 항원이 비점막으로 들어오면 항원은 호흡상피에 붙어서 비점막림프조직 바로 위에 위치한 특수화된 상피세포인 microfold 즉 M 세포에 의해 받아들여진다. 그런 후에 항원은 후경부림프절로 우선적으로 들어간다.¹⁶⁾ 이러한 경부림프 절에서 B 세포가 증식되고 분화되어서 형질세포로 전환된 후에 분비형 IgA를 분비한다. 인간에서 편도 및 아데노이드 절제술 후에 비인강에서 분비형 IgA의 분비가 감소하는 것과 일치되는 소견이다.¹⁷⁾ 따라서 비점막림프 조직은 비점막의 국소 면역반응에 관여하는 것으로 알려져있다.
   또한 림프 여포(lymphoid follicle)는 일차 여포와 이차 여포로 대별 되는데 일차 여포는 소림프구로 구성된데 반해, 이차 여포는 항원 자극 후 발생하며 배중심을 갖는다. 즉, 일차 림프 여포를 이룬 항원 특이 B 세포가 항체에 의해 감작된 후 B 세포 증식을 일으키며 배중심을 이루게 된다. 따라서 배중심의 일차적 역할은 아마도 B 세포의 기억 발달에 중요한 역할 을 한다. 배중심은 설치류인 흰쥐에서는 뚜렷하게 존재하지 않는다고(equivocal) 알려져있다.¹⁶⁾ 본 연구에서는 비점막림프조직과 배중심은 40배 저배율에서 보이는 모든 수를 세었다. 비점막림프조직은 대조군에서는 뚜렷하게 보이지는 않았지만 5일째의 실험군에서는 통계학적으로 유의한 증가를 보였다. 그리고 배중심의 경우는 실험군에 비하여 통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았지만 5일째의 실험군에서 뚜렷하게 약 2개 이상 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과로 볼 때 실험군 5일째에서 비점막 림프조직 수의 증가만큼 배중심의 수가 증가하지 않은 것은 배중심의 기능 이 B 세포의 기억 역할을 하므로, 실험군의 흰쥐들이 아마도 이전에 포도 상 구균에 기감작(presensitization)되어서 이런 결과가 나온 것이라고 생각된다.

결     론

   흰쥐의 비강에 국소적으로 포도상 구균을 투여한 후 부비동강내에서 염증 세포 군집의 증가를 관찰함으로써 비부비동염을 확인하였다. 이러한 본 연구는 향후 급성 세균성 비부비동염의 또 다른 하나의 모델이 될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 비점막림프조직과 배중심의 수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았으나 염증세포 군집이 가장 많은 5일째의 실험군 흰쥐에서 증가하는 경향을 보이는 바 향후 비부비동염과의 관계에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다.

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