교신저자：선동일 137-040 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   두경부 종양은 여성 및 청소년 흡연자가 증가함에 따라 매년 그 수가 증가하고 있다. 그러나 지난 수년 동안 조기진단을 위한 많은 노력과 수술술기의 발전, 방사선치료방법의 놀랄만한 발전이 있었음에도 불구하고 두경부 종양 환자의 생존률은 현저히 증가하지는 않았다.¹⁾
   여성 및 청소년 흡연자의 증가 등의 새로운 역학적인 요인의 등장과 종양학의 발전이 기대 수준을 미치지 못함으로써 종양의 조기진단을 통한 치료 효과를 높이기 위한 방법의 일환으로 분자 생물학적 방법을 이용한 두경부 종양학의 기초 연구가 활발하게 되었다. 
   발암과정과 연관된 유전자의 결손, 중복, 돌연변이 등을 분자 생물학적 방법으로 발견하여 종양 발생의 기전을 밝히고 조기 진단에 이용하려는 노력이 있어 왔는데 최근 DNA염기서열의 변화없이 유전자 발현을 조절하는 epigenetic 한 변화인 DNA methylation이 종양발생에 기여한다는 가설이 제시되었다.²⁾ 즉 여러 종류의 종양에서 종양 억제 유전자의 methylation을 통한 Transcriptional silencing이 종양 발생의 중요한 기전으로 보고되고 있으며 이들을 종양의 조기 발견에 이용하려는 많은 노력이 있어 왔다.³⁾⁴⁾
   최근 Jing 등은 3p 염색체에 위치한 Tarozen induced gene 1(TIG1) 유전자가 전립선암에서 92.2%가 발현이 되지 않고 이유전자를 재발현 시켰을때 전립선암 세포가 주위기질세포로 침윤하는 능력이 감소한다고 하였으며 TIG1 유전자의 hypermethylation에 의한 silencing이 종양억제 유전자로서의 기능을 상실하는 기전일 것이라고 보고하였다.⁵⁾
   이에 저자들은 전립선암에서 TIG1 유전자의 methylation 상태를 측정하고 두경부종양의 세포주와 원발암에서 TIG1 유전자의 methylation 상태를 측정하고 TIG1이 이들 종양의 발생에 어떤 역할을 하는지 알아보았다. 

대상 및 방법

대  상
   미국 존스홉킨스대학 이비인후과 head and neck cancer research division에서 제공받은 32예의 두경부 편평세포암종(설암 12예, 후두암 14예, 하인두암 6예)과 31예의 전립선암 조직과 5예의 두경부 종양 세포주(011, 012, 019, 022, 028)와 3예의 전립선암 세포주(PC3, LNCap, DU145)를 대상으로 하였고 대조군으로 비흡연자의 정상 성인 10명의 구강 점막세포와 10명의 정상 전립선조직을 대상으로 하였다.

방  법

세포주와 원발암에서 DNA와 RNA 추출
   존스홉킨스 대학에서 제공받은 5종류의 두경부 종양 세포주(011, 012, 019, 022, 028)와 전립선 암세포주(PC3, LNCap, DU145)를 RPMI 1640 배양액에 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin과 streptomycin 등을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37℃ 배양기에서 배양하였다. RNAeasy extraction kit(Qiagen)을 이용하여 total RNA를 추출하고 세포주, 원발암과 정상조직에서는 phenol chloroform ethanol 침전법으로 DNA를 분리하였다.⁶⁾

Bisulfite treatment
   세포주와 원발암에서 추출한 1 μg의 DNA를 20 μg의 물에 녹여 0.2 M NaOH에 37℃에서 10분간 변성 시킨다. 변성된 DNA를 10 mM hydroquinone과 3 M bisulfite에 녹여 50℃에서 16시간 incubate한 후 Wizard purification resin(Promega Corp.)에서 desalt 시킨후 0.3 M NaOH로 5분간 상온에 두었다가 ethanol로 침전 시킨다.⁷⁾

세포주에서 5-Aza-2' deoxycytidine(5-Aza-CdR) 처리
   DNA methylaton 억제제인 5-Aza-CdR를 처리하기 전에 세포를 저밀도로 분주하고(5×10⁵/T-25 flask) 1 μM 또는 5 μM 5-Aza-CdR를 각,각 3, 5일째 투여하고 5일째 세포들을 trpsinization시켜 RNAeasy extraction kit(Qiagen)을 이용하여 RNA를 추출한다.

RT-PCR
   5-Aza-CdR처치 전후에 추출한 RNA 5 μg을 이용하여 super script First strand cDNA kit(Invitogen Co)을 이용하여 cDNA를 만들고 PCR template로 이용한다.
   PCR은 추출된 DNA 0.5 μl에 0.2 mM의 각 dNTP들, PCR buffer 10×concentration 2 μl, 0.5 mM의(F/R) primer 각 각 0.2 μl, 0.3 μl의 Taq polymerase(Boehringer manhein, Germany)와 증류수를 섞어 총 20 μl의 양이 되도록 하였다. Thermal cycler(Perkin-Elmer, USA)에서 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초의 처리과정을 35회 반복하였다(Table 1). 
   증폭 산출물 중 10 μl를 2% agarose gel(Boehringer Manhein, Germany)에서 전기영동(80 volts에서 45분)한 후 0.5 μl/mL 농도의 ethidium bromide(Boehringer manheim, Germany) 용액으로 30분간 염색하였다. 

MSP(methylation specific PCR)
   Bisulfite 처리된 DNA를 MSP에 이용하였다.
   Primer는 methylated DNA, unmethylated DNA 각각 고안하여 만들었다. methylated PCR은 bisulfite 처리된 DNA 2.0 μl에 0.2 mM의 각 dNTP들, PCR buffer 10×concentration 2 μl, (F/R) primer 각각 0.2 μl, 0.3 μl의 Taq polymerase(Boehringer manhein, Germany) DMSO 2 μl 증류수를 섞어 총 20 μl의 양이 되도록 하였다. Thermal cycler(Perkin-Elmer, USA)에서 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 30초의 처리과정을 35회 반복하였다.
   Unmethylated PCR은 bisulfite 처리된 DNA 2.0 μl에 0.2 mM의 각 dNTP들, PCR buffer 10×concentration 2 μl, (F/R) primer 각각 0.2 μl, 0.3 μl의 Taq polymerase(Boehringer manhein, Germany) DMSO 2 μl 증류수를 섞어 총 20 μl의 양이 되도록 하였다. Thermal cycler(Perkin-Elmer, USA)에서 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초 의 처리과정을 40회 반복하였다. 
   증폭 산출물 중 10 μl를 2% agarose gel(Boehringer Manhein, Germany)에서 전기영동(80 volts에서 45분) 한 후 0.5 μl/mL 농도의 ethidium bromide(Boehringer manheim, Germany) 용액으로 30분간 염색하였다. 

결     과

   두경부 종양 및 전립선세포주에서 시행한 MSP에서는 두경부 종양 세포주는 5예에서 모두, 전립선암 세포주에서는 3예중 2예(66.7%)에서 methylation 된 소견을 보였다. MSP 결과를 확인하기위해 MSP 양성인 7예의 세포주에서 염기서열 분석을 하였는데 7예에서 모두 methylation된 소견을 보였다(data not shown).
   RT-PCR에 의한 세포주에서 mRNA 발현 양상은 methylated된 세포주 6예에서는 발현이 되지 않았으나 methylation의 억제제로 알려진 5Aza-CdR을 처치한 후 6예의 세포주 모두에서(012, 019, 022, 028, PC3, LNCap) mRNA은 재발현 되었다. 011 세포주에서는 MSP 결과에서는 methylation된 소견을 보였으나 RT-PCR에서는 발현 되었다.
   원발암에서의 MSP결과는 전립선암 31예 중 17예(54.8%), 두경부암 32예에서는 16예(50%)에서 methylation된 소견을 보였다.
   대조군으로 선택한 10예의 정상 전립선 조직과 정상 구강점막에서는 모두 methylation된 소견이 없었다(Fig. 1, Table 2).

고     찰

   유전자의 변형이 병의 진행이나 치료의 결과를 나타낼 수 있는 지표로 이용될 수 있다는 연구가 인체의 종양에서 많이 연구 되어왔으며 염색체의 일정부분의 소실이나 중복도 지표로 이용이 가능한 것으로 알려져 왔다.^8)9)10)
   최근에는 promoter DNA methylation에 의한 종양억제유전자의 불활성화가 종양 발생에 기여한다는 것이 알려지면서 여러 종양에서 연구가 되어 왔다. 전립선암에서 E-cadherin, RASSF1A, GSTP1 등의 유전자의 methylation 이 이들 유전자의 불활성화와 연관이 있다고 알려져 있으며^11)12)13) 두경부 종양에서도 p16, MGMT, DAP-kinase 의 promoter hypermethylation 이 두경부 종양의 발생과 연관이 있다고 알려져 왔다.¹⁴⁾¹⁵⁾
   수많은 유전자 결손 연구들 중 특히 3번 염색체의 결손연구에 의하면 이곳에는 3군데의 결손부위(3p14, 3p21, 3p24-25)가 종양에서 존재할 수 있는데 이는 3번 염색체에는 종양의 진단과 치료에 도움을 줄 수 있는 여러 종양억제유전자가 존재할 수 있다는 가능성을 암시 한다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 그 후 여러 연구를 통하여 3번 염색체에 존재하는 여러 유전자들이 폐암, 유방암, 두경부종양 등에서 연구되어 왔다.¹⁸⁾¹⁹⁾ 
   TIG1은 3번 염색체의 3p13, 3p12 사이에 존재하는 유전자로 228개의 아미노산을 coding 한다. 이는 retinoid에서 유래한것들 중 하나로(retinoid acid responsive 1 gene (RARRES1) 이라고도 한다.³⁾ 
   TIG1의 기능은 완전히 알려져 있지는 않지만 cell adhesion molecule로서 세포에 결합하여 세포간의 결합력을 증가 시키고 증식을 억제하는 기능을 가지고 있다고 알려져 있다.⁵⁾
   이 유전자는 처음에 피부에서 발견되었으며 건선의 치료에 이용되기도 한다.²⁰⁾
   TIG1유전자의 발암과정에서의 역할은 전립선암에서 먼저 밝혀져 전립선암에서 악성화가 높을수록 발현이 감소하며 악성도가 높은 세포에서 TIG1을 재발현 시켰을 때 침윤성이 현저하게 감소한다고 알려져 있다.⁵⁾
   본 연구에서도 전립선암에서의 TIG1 유전자의 불활성화가 hypermethylation에 의한다고 확인할 수 있었으며 두경부 종양에서도 hypermethylation에 의한 TIG1 유전자의 silencing이 발암 과정에서 중요한 기전이 될 수 있다고 알 수 있었다. 
   DNA 염기서열의 변화없이 유전자 발현을 조절하는 epigenetic한 변화인 DNA methylation은 인체에서 가장 흔한 DNA modification으로 cytosine에서만 일어나며 DNA Methyltransferase가 S-adenosylmethionine을 이용하여 cytosine ring 5번째 탄소에 methyl 기를 첨가하는 함으로 이루어지며 이를 CpG methylation 이라고 부른다.²⁾
   DNA methylation은 정상세포에서는 태아발생과정, X 유전자 불활성화, imprinting, parasitic DNA sequence 억제 등에 관여하는 반면,^21)22)23) 다른 측면에서 볼 때, 유전자의 돌연변이를 증가시키며 CpG island로 구성된 promoter를 가진 유전자의 transcription을 억제하여 유전자를 silencing 시킨다고 한다.^24)25)26)
   종양발생에 DNA methyation이 미치는 영향은 아직 확실하게 정립되어 있지 않으나 다음 4가지 기전이 관여할 것으로 생각하고 있다. 
   첫째, 종양세포에서 C→T 돌연변이의 중요성：unmethylated cytosine은 정상적으로 deamination을 거치면 uracil로 되고 이것은 Uracil-DNA glycosylase에 의해서 G：U pair를 복구하지만, methylated cytosine는 deamination이 되면 복구되지 못하고 C→T로 transition이 일어난다.²⁷⁾ 가장 잘 알려진 종양억제유전자인 p53 유전자의 coding region에 있는 CpG는 모두 methylated되어 있으며, p53 유전자 돌연변이중 약 24%가 CpG dinucleotide의 C→T transition이며, 돌연변이의 33%가 mutation hot spot인 codon 175, 245, 248, 273, 282의CpG site에서 발생한다.²⁸⁾²⁹⁾ p53 유전자 coding region에 있는 CpG methylation이 대장암의 50%, 일반적으로 종양의 25%와 연관이 있다고 하였다.³⁰⁾ 둘째, 종양억제유전자의 hypermethylation：종양세포에서 종양억제 유전자 발현이 돌연변이, 결손으로 인해 억제되는 것과 같이 유전자내 promoter내 CpG site의 methylation에 의해서도 유전자 발현이 불활성화 된다.
   셋째, 염색체 불안정성 유발：대표적인 mismatch repair 유전자인 hMLH1유전자가 promoter의 methylation으로 인해 불활성화 됨으로서 microsatellite instability 등을 일으킨다고 하였으며, in vitro 실험에서 5-Aza-CdR을 투여 후 hMLH1이 활성화되면서 mismatch repair 기능이 복구된 것으로 볼 때 hMLH1 promoter의 methylation이 일차적인 원인이었음을 알 수가 있다.³¹⁾ 넷째：DNA methylation과 발암물질과의 상호작용：앞서 언급한 바와 같이 p53 유전자에서 C→T transition 돌연변이는 methylcytosine의 deamination에 의해 발생하지만, 특히 폐암에서 많이 발생하는 G→T transversion은 담배의 발암물질인 benzopyrene이 methylcytosine의 5'쪽에 있는 guanosine에 다른 부위보다 3~10배 더 강하게 결합하기 때문에 발생한다는 점에서³²⁾ DNA methylation은 여러가지 방법으로 유전자 돌연변이를 증가시킨다는 사실을 알 수 있으며, 이것이 발암과정과 연관이 된다고 생각된다.
   위와 같이 DNA methylation은 기존에 종양발생을 설명하였던 유전자 염기자체의 변화뿐 아니라 DNA modifiction에 의해 유전자 기능을 변화시켜 종양화 과정에 관여할 것이라는 것이 현재까지의 연구에서 강력히 시사되고 있다. 
   두경부 종양에서도 여러 유전자의 DNA methylation이 연구되어 p16, MGMT, DAP-K 등이 두경부 종양 환자의 55%에서 hypermethylation되어 있고 그들 중 42% 환자에서 혈청에서도 hypermethylation 된 소견을 보였는데 혈청에서 hypermethylation 된 환자에서 methylation되어 있지 않은 환자보다 8배나 원격전이율이 높았다고 하였다.¹⁴⁾ 또한 이들 유전자가 hypermethylation되어 있는 두경부종양 환자에서 65%가 타액에서도 hypermethylation되어 있다고 하였다.¹⁵⁾ 이는 종양의 지표가 되는 유전자의 methylation된 정도를 정량적으로 측정하면 혈청으로는 원격전이를 예측하거나 타액으로는 국소 종양의 범위를 정하는데 이용이 가능할 수 있어 환자에서 쉽게 얻을 수 있는 혈청이나 타액을 이용하여 종양을 조기 진단하고 재발 및 이차암을 발견하는데 큰 도움을 줄 수 있을 것이다. 
   그러나 아직까지는 몇가지 유전자의 변화로만 종양을 모두 진단하고 예측할 수 있는 유전자는 없어 새로운 유전자를 찾기 위한 노력이 진행되고 있다.
   특히 본연구의 결과에서 같이 대조군으로 이용한 정상조직에서는 methylation된 예가 없어 TIG1 유전자는 종양에서만 특이하게 methylation 되어 있다고 추정할 수 있어 이를 지표로 이용할 수 있는 가능성은 크다고 하겠다.
   두경부 종양은 다른 부위의 암과는 달리 조기 진단이 된 경우 90% 이상의 완치율을 보이고 암전구 병소에서 발견이 되어 치료를 시작하면 95% 이상의 완치율을 보인다. 또한 두경부 종양은 유전자 변이 등 여러 내부 유전적 요인과 흡연, 술과 같은 종양 발생의 외부적인 요인에 동시에 노출되어 발생하며 일차암 및 이차암의 발생이 다른 부위에 비해 많고 병소를 직접 관찰할 수 있으므로 종양 발생의 유전자 변이 기전을 밝히는데 적절한 모델이 된다. 따라서 두경부 종양을 이용하여 종양을 조기에 진단할 수 있는 분자 생물학적 지표를 찾아 치료에 이용할 수 있으면 두경부 종양 뿐 아니라 다른 부위의 암 환자의 생존율을 높이는데 크게 기여할 수 있을 것이다. 

결     론

   TIG1 유전자의 promoter methylation은 전립선암의 생성뿐 아니라 두경부종양과에서 TIG1 유전자를 불활성화 시키는 중요한 기전으로 생각될 수 있고 TIG1 methylation 이 두경부 종양의 조기진단과 치료에 이용될 수 있는 분자 생물학적 표지자로 이용될 수 있는 가능성을 나타냈다고 할 수 있다.

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