교신저자：신승헌, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   급성 부비동염의 경우 바이러스나 박테리아의 감염이 주된 원인으로 알려져 있으나 만성 부비동염의 발생 기전에는 여러 가지 요인들이 관여한다. 1983년 Katzenstein 등¹⁾이 allergic Aspergillus sinusitis를 보고하여 진균이 부비동염의 원인이 될 수 있음을 알게 되었고, 그 후 Aspergillus 뿐 아니라 다른 여러 가지 진균들이 부비동염과 관련이 있음을 보고하였다.²⁾ Ponikau 등³⁾은 알레르기성 진균성 부비동염 뿐 아니라 일반 만성 부비동염의 환자에서도 알레르기성 점소와 비즙 내 진균이 존재함을 보고하였고 만성 부비동염 환자의 93%가 진균성 부비동염의 가능성이 있다고 하였다. Shin 등⁴⁾도 만성 부비동염 환자의 92.5%에서 비즙 내 진균이 존재함을 보고하여 진균이 만성 부비동염의 발생 기전에 관여함을 주장하였다. 
   호흡기 점막은 호흡기 내로 들어온 미생물을 제거하기 위해 매우 효율적이고 특이한 기능과 구조를 가지고 있다. 상피세포의 세포간 폐쇄막 등의 물리적 장벽과 세포가 생산하는 단백물질과 효소들은 미생물을 직접 제거하거나 탐식 작용을 촉진시켜준다. 비강 상피세포는 알레르기 물질에 노출되거나 세균의 침입 등 염증반응이 일어나는 경우 granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF), interleukin-8(IL-8), tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등 각종 화학물질을 생산하여 염증세포의 활성화와 이주에 영향을 미쳐 국소 염증반응에 중요한 역할을 한다.⁵⁾ 호흡기로 침범한 진균이 병원성을 나타내기 위해서는 우선 점액섬모운동의 장애로 호흡기로 흡입된 물질의 배출 장애가 생겨 호흡 상피세포와 진균의 접촉시간이 길어지는 경우, 침입한 진균의 제거를 위해 비강 상피에 존재하는 살진균성 단백물질의 이상이 있는 경우로 진균에서 분비된 단백질분해효소에 의해 국소적 염증반응이 일어난다. 그리고 진균에 의해 보체 체계와 항원-항체 반응이 억제되고, 탐식 세포에 의한 탐식작용이 억제되거나, 진균에서 만들어진 효소들이 상피세포의 손상을 초래하여 조직 내 침투를 용이하게 하는 경우 질병을 일으키게 된다.⁶⁾⁷⁾⁸⁾ 
   저자들은 비강 내에 존재하는 진균이 비강 상피세포에 미치는 영향을 알아보고, 비강 상피세포의 활성화 기전을 알아 보고자 이 연구를 시행하였다. 

대상 및 방법

비강 상피세포의 분리 및 배양
   비내시경 수술을 시행하는 환자의 비용조직을 채취하여 사용하였다. 환자의 선택은 알레르기성 비염이 동반되지 않고, 수술 전 4주 이상 항생제, 항히스타민제, 국소 및 경구용 스테로이드제재 등의 약물 치료를 시행하지 않은 예에서 시행하였다. 채취한 조직을 penicillin(Pc) 100 UI/ml, streptomycin(SM) 100 μg/ml, amphotericin-B(Amp-B) 2 μg/ml을 포함한 Ham's F-12 배양액으로 세척 후 dispase(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 포함한 Ham's F-12로 처리하여 조직 표면의 세포를 분리한다. 박리된 세포들을 10 cm 플라스틱 접시에 1시간 두어 섬유모세포, 근육세포와 혈관 내피세포를 제거하고 얻어진 상피세포는 Pc, SM, Amp-B, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 UI/ml, epithelial growth factor 25 ng/ml, endothelial growth supplement 15 μg/ml, triiodothyronin 200 pM, hydrocortisone 100 nM, fetal calf serum 15%를 포함한 배양액에 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 상피세포의 confluent monolayer가 형성되면 배양액을 10% fetal bovine serum과 gentamycin 50 μg/ml을 포함한 RPMI 1640으로 교체하고, 48시간 배양 후 상등액을 얻어 -70℃에 보관하였다. 이때 Alternaria Alternata, Aspergillus Versicolor, Cladosporium Herbarum 10, 25, 50, 100 μg/ml으로 각각 자극하여 상피세포의 활성화를 유도하였다. 
   상등액에 포함된 화학매개물질은 ELISA(R&D system, Minneapolis, MN, USA)법을 이용하여, IL-8, GM-CSF, regulated on activation normal T expressed and secreted(RANTES)를 측정하였으며, 민감도는 5 pg/ml이었다. 

비강 상피세포의 Protease-activated receptor(PAR) 분석
   배양된 비강 상피세포를 10% Triton X-100, 1 M Tris-HCl, 0.1M PMSF 등을 포함한 세포용해완충액으로 처리한 후 SV total RNA isolation 시약(Promega, Madison, WI, USA)으로 RNA를 추출하여 reverse transcription system을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사 중합효소연쇄반응은 5 mM MgC_l2, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0), 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, 각각의 dNTP 1 mM, 1 U/μl Ribonuclease inhibitor, 20 U AMV reverse transcriptase, 0.5 μg oligo(dT)₁₅ primer의 시약에 총 RNA 9.5 μl를 주입하여 총 20 μl를 DNA thermal cycler 480(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 증폭하였다. PAR의 증폭을 위하여 사용한 시발체의 염기서열은 아래와 같다.

   PAR-1
      F：5'-AAGCTTCCCGCTCATTTTTTCTCAGGAA-3'
      R：5'-GAATTCAATCGGTGCCGGAGAAGT-3'
   PAR-2
      F : 5'-CACCACCTGTCACGATGTGCT-3'
      R：5'-CCCGGGCTCAGTAGGAGGTTTTAACAC-3'
   PAR-3
      F：5'-GTITACATGCTIACTIGCITIGCGA-3' 
      R：5'-GGATAIACIACIGCIAAICTC-3'

비강 상피세포 활성화 기전
   세 가지 진균 중 비강 상피세포를 가장 많이 활성화시키는 진균과 PAR를 활성화 시키는 thrombin 50 nM과 trypsin 2 nM을 이용하였다. 비강 상피세포의 활성화 억제를 위해서 serine protease inhibitor Aprotinin(4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride) 0.5, 1.0. 2.0 μg/ml, Pefabloc(p-aminoethyl benzenesulfonyl fluoride) 100, 200, 500 μg/ml, cysteine protease inhibitor E-64(transepoxysuccinyl-L-leucylamide-(4-guanidino) butane) 1, 5, 10 μg/ml을 진균, thrombin, trypsin과 37℃에서 30분간 처리 후 상피세포와 함께 배양하였다. 48시간 배양 후 얻어진 상등액에서 화학매개물질 IL-8과 GM-CSF를 ELISA법으로 측정하였다.

통계 분석
   각각의 실험은 5회 이상 반복하여 그 결과를 얻고자 하였으며, 진균에 의한 화학매개물질의 생성은 Mann-Whitney U test를 이용하여 비교하였고, 비강 상피세포 활성화 억제는 student t-test를 사용하였으며 유의수준은 0.05로 하였다.

결     과

진균에 의한 비강 상피세포의 활성화
   비강 상피세포 배양액에서는 IL-8이 31.5±37.6 ng/ ml, GM-CSF 533.4±213.8 pg/ml, RANTES 11.1±5.9 pg/ml이 포함되어 있었다. Aspergillus로 상피세포를 자극한 경우 10 μg/ml에서 IL-8가 37.7±24.6 ng/ml, GM-CSF 633.6±465.9 pg/ml, RANTES 19.5±12.6 pg/ml이 생성되었고, 25 μg/ml에서는 IL-8이 46.9±37.6 ng/ml, GM-CSF 869.7±621.6 pg/ml, RANTES 31.8±17.6 pg/ml이 생성되었고, 50 μg/ml에서는 IL-8이 43.6±21.5 ng/ml, GM-CSF 717.2±325.9 pg/ml, RANTES 13.7±5.8 pg/ml이었고, 100 μg/ml에서는 IL-8이 9.4±6.9 ng/ml, GM-CSF가 185.3±136.5 pg/ml, RANTES는 6.8±1.4 pg/ml이었다. Alternaria는 농도가 증가함에 따라 화학 매개물질의 생성이 증가되었으나, Cladosporium은 농도의 증가에 따라 화학 매개물질 생성의 변화가 크지 않았다(Fig. 1). Alternaria 25, 50, 100 μg/ml 및 Aspergillus 25 μg/ml과 함께 배양된 비강 상피세포는 자극하지 않은 경우보다 유의하게 많은 양의 화학 매개물질을 생산하였다(p<0.05). 

비강 상피세포의 Protease activated receptor 발현
   비강 상피세포를 자극하지 않은 경우와 Cladosporium 50 μg/ml을 사용한 경우 PARs의 발현이 유도되지 않았으나 Alternaria 50 μg/ml로 자극한 경우 PAR2와 PAR3 mRNA가 발현되었고, Aspergillus 50 μg/ml은 PAR2 mRNA의 발현을 유도하였으며 trypsin 5 μg/ml은 PAR2, thrombin 100 μg/ml은 PAR3 mRNA의 발현이 있었다(Fig. 2).

비강 상피세포 활성화의 억제
   Alternaria 50 μg/ml으로 자극한 비강 상피세포는 100.4 ±97.3 ng/ml의 IL-8과 1012.4±524.7 pg/ml의 GM-CSF를 분비하였으며, IL-8은 Pefabloc과 E-64에 의해 유의하게 억제되었으며(p<0.05), GM-CSF 생성은 Pefabloc에 의해 강력히 억제되었으나(p<0.05), Aprotinin은 비강 상피세포 활성화를 억제하지 않았다. Trypsin과 thrombin에 의한 비강 상피세포의 활성화도 Pefabloc에 의해 억제되었다(p<0.05)(Figs. 3 and 4).

고     찰

   만성 부비동염의 원인은 세균성 감염, 알레르기, 해부학적 이상, 면역 이상, 점액섬모수송의 장애 등 발병기전에 대한 논란이 지속되고 있다. 만성 부비동염의 치료 또한 항생제, 스테로이드제, 항히스타민제, 부비동 내시경수술 등 다양한 방법을 사용하고 있으나 효과적인 치료와 재발 방지는 이루어지지 않고 있다. 이에 지금까지 알려진 발병 기전 외에 다른 주요한 인자가 있지 않을까 하는 의문을 가지면서 진균에 대한 관심을 가지게 되었다. 진균은 지금까지 10만 여종의 진균이 발견되었으며 그 중 200여종이 병원성을 가지고 있으며 Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, Candida 등 20여종이 호흡기 질환과 연관성이 있다. 이들 진균은 Allergic Bronchopulmonary Aspergillosis, 알레르기성 천식 및 알레르기성 진균성 부비동염 등을 유발한다.⁹⁾¹⁰⁾ 진균성 부비동염은 수술적 치료를 받은 만성 부비동염 환자의 6~7%를 차지하는 것으로 알려져 왔으나 진단 장비와 진균 배양 기술의 발달로 실제 유병율은 더 높을 것으로 알려지고 있다. Ponikau³⁾와 Shin 등⁴⁾은 만성 부비동염 환자와 정상인의 비즙에서 90%이상의 높은 진균 배양율을 보고하였으며 Alternaria, Cladosporium, Penicillium, Aspergillus 등이 주된 진균이었다. 이에 본 연구에서도 비강 내 흔히 존재하는 Aspergillus, Alternaria, Cladosporium을 이용하여 실험을 시행하였다. 
   진균은 주위에서 흔히 볼 수 있는 기생생물로 작은 포자 형태로 호흡기로 들어간다. 각각의 진균은 여러 종류의 항원성 물질과 aspartic, serine, cysteine 단백질분해효소 성분으로 구성되어 있다.¹¹⁾ 항원성 물질과 단백질분해효소들은 직접 상피세포의 탈피를 유도할 뿐 아니라 호흡 상피세포의 수용체와 반응, 활성화를 유도하여 염증세포의 동원과 염증반응의 유지 악화에 관여하게 된다. 집먼지 진드기 등 호흡기 항원들의 단백질 분해효소는 호흡상피세포의 표피박리와 화학매개물질 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다. 특히 기관지 천식과 같은 염증 반응이 있는 기관지 상피세포는 집먼지 진드기, 진균 등의 항원에 의해 다량의 GM-CSF와 RANTES를 만들어 내고 이들 반응은 항원의 양과 항원에 노출된 시간 그리고 항원과 상피세포의 상호 반응성 등에 영향을 받는다.¹²⁾¹³⁾ 호흡 상피세포에서는 IL-1β, IL-6, IL-8, eotaxin, RANTES, GM-CSF 등 다양한 화학매개물질을 만들어 내는데 저자들은 부비동염의 발병에 관여하는 호중구와 호산구의 활성화와 화학주성에 관여하는 IL-8, GM-CSF, RANTES에 대해 조사를 시행하였다. 이 연구에서 사용된 진균들도 비강 상피세포의 활성화를 유도하여 IL-8, GM-CSF, RANTES의 생성을 유도하는 사실을 알 수 있었고, 진균의 농도가 이들 화학매개물질 생성 정도에 영향을 미침을 알 수 있었다. 대체로 진균의 농도가 높을수록 화학매개물질의 생성도 증가되었으나, Aspergillus는 50 μg/ml 이상의 농도에서는 활성화가 약해졌는데 이는 진균의 농도가 증가함에따라 진균이 가지고 있는 단백질분해효소가 상피세포를 활성화시킬 뿐 아니라 상피세포의 탈락을 유도하는 세포 독성을 가지기 때문이다.¹³⁾ 
   PARs는 G-protein-coupled receptors의 새로운 형태로 아미노말단의 단백분해성 분할에 의해 tethered peptide ligand가 형성되어 세포벽에 존재하는 수용체와 결합하여 세포의 활성화를 유도하게 된다.¹⁴⁾ 지금까지 5가지의 PAR가 알려져 있으며 그 중에서도 PAR-1, PAR-2, PAR-3에 대한 연구가 활발히 이루어져 왔다. PAR-1과 PAR-3는 thrombin에 의해 활성화되며 주로 조혈세포에 많이 분포하고 단핵구, T-림프구와 혈소판에 존재하고 특히 혈소판의 혈액 응고반응을 위해 필수적이다.¹⁵⁾¹⁶⁾ PAR-2는 serine protease인 trypsin에 의해 활성화되며 각화세포, 혈관내피세포, 소화기 상피세포, 소화기 근세포, 췌장선포세포에 분포하고 있다. PAR의 활성화를 위해서는 tethered ligand의 형성이 필수적이지만 이 tethered ligand의 아미노산 서열에 합당한 합성 peptide로도 PARs가 활성화 될 수 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 기도 상피세포는 PAR1과 PAR2를 가지고 있고, 기관지 상피세포는 PAR1, PAR2, PAR3, PAR4를 가지고 있다. 기관지 천식환자의 경우 특히 PAR2의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ 이는 PAR2가 호흡기 염증반응과 연관성이 있음을 의미하는 것이다. 비강 상피세포의 PARs에 대한 연구는 미진한 상태이다. 이 연구에서 자극을 주지 않은 상피세포의 경우 PARs의 발현이 없었으나, 진균으로 활성화가 유도된 경우 Alternaria는 PAR2와 PAR3의 발현을 유도하였고, Aspergillus는 PAR2의 발현을 유도하였다. 비록 기전은 정확히 알 수 없으나 비강 상피세포의 PARs는 염증성 반응이 일어나는 경우 단백질 분해반응에 의해 PARs의 발현이 이루어지는 것으로 추측되며, 이들 PARs에 의해 염증 반응의 진행이 가속화될 것이다. 진균의 다양한 단백질분해효소들이 상피세포의 PARs 발현과 연관성이 있을 것으로 생각되나 어느 단백질분해효소가 어떠한 과정을 통해서 PARs의 발현을 유도하는지에 대해서는 지속적인 연구가 필요할 것이다.
   Alternaria와 Cladosporium에서는 10여종의 단백물질이 밝혀져있고 Aspergillus는 약 20종의 단백물질이 밝혀져 있는데¹¹⁾ 이들 물질 뿐 아니라 더 많은 항원성 물질 및 단백질분해효소가 존재하며, 이 중 어느 물질이 비강 상피세포의 활성화를 유도하는지는 알 수 없다. 이 연구에서는 serine protease inhibitor인 Pefabloc에 의해 IL-8과 GM-CSF의 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 다른 serine protease inhibitor인 Aprotinin은 화학매개물질의 생성을 억제하지 않았다. 이는 Pefabloc이 serine protease inhibitor일 뿐 아니라 trypsin과 thrombin까지 억제하여 Aprotinin보다 강력한 protease inhibitor 효과를 가지거나 Alternaria가 trypsin과 thrombin의 특성을 포함하고 있음에 기인할 것이다. Cysteine protease inhibitor인 E-64도 진균에 의한 IL-8의 생성을 억제하여 화학매개물질의 종류에 따라 서로 다른 비강 상피세포 활성화 경로가 있을 것으로 생각되었다. 
   이상의 결과를 종합해 보면, 비강 내에 존재하는 진균은 비강 상피세포를 활성화 시켜 IL-8, GM-CSF, RANTES 등의 화학매개물질의 생성을 유도하여 국소 염증반응에 관여함을 알 수 있었고, 비강 상피세포의 활성화 과정에 PARs가 관여함을 알 수 있었다. 진균의 비강 상피세포 활성화 과정에는 진균이 가지고 있는 단백질분해효소 특히 serine protease가 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었다. 이 연구에 사용된 진균의 농도가 인체 비강 내 진균의 농도를 대변하지는 못하는 한계가 있지만 비강 내 존재하는 진균이 비강 염증반응에 관여하고 이러한 염증반응이 만성 부비동염의 발생기전과 연관성이 있음을 추측할 수 있었다. 

1. Katzenstein AL, Sale SR, Greenberger PA. Allergic Aspergillus sinusitis: A newly recognized form of sinusitis. J Allergy Clin Immunol 1983;72:89-93.

2. Frenkel L, Kuhls TL, Nitta K, Clancy M, Howard DH, Ward P, et al. Recurrent Bipolaris sinusitis following surgical and antifungal therapy. Pediatr Infect Dis J 1987;6:1130-2.

3. Ponikau JU, Sherris DA, Kern EB, Homburger HA, Frigas E, Gaffey TA, et al. The diagnosis and incidence of allergic fungal sinusitis. Mayo Clin proc 1999;74:877-84.

4. Shin SH, Lee YH, Lee SJ, Kim CG, Yae MK. Analysis of fungi in the nasal secretion of chronic rhinosinusitis patients. Korean J Otolaryngol 2002;45:479-82.

5. Suzuki H, Shimomura A, Ikeda K, Furukawa M, Oshima T, Takasaka T. Inhibitory effect of Macrolides on Interleukin-8 secretion from cultured human nasal epithelial cells. Laryngoscope 1997;107:1661-6.

6. Tomee JF, Hiemstra PS, Heinzel-Wieland R, Kauffman HF. Antileukoprotease: An endogenous protein in the innate mucosal defense against fungi. J Infect Dis 1997;176:740-7.

7. Mitchell CG, Slight J, Donaldson K. Diffusible component from the spore surface of the fungus Aspergillus fumigatus which inhibits the macrophage oxidative burst is distinct from gliotoxin and other hyphal toxins. Thorax 1997;52:796-801.

8. Kauffman HF, Tomee JF. Inflammatory cells and airway defense against Aspergillus Fumigatus. Immunol Allergy Clin North Am 1998; 18:619-40.

9. Koivikko A, Viander M, Lanner A. Use of the extended Phadebas RAST panel in the diagnosis of mould allergy in asthmatic children. Allergy 1991;46:85-91.

10. Shen HD, Lin WL, Tam MF, Wang SR, Tsai JJ, Chou H, et al. Alkaline serine proteinase: A major allergen of Aspergillus oryzae and its cross-reactivity with Penicillium citrinum. Int Arch Allergy Immunol 1998;116:29-35.

11. Kurup VP, Banerjee B. Fungal allergens and peptide epitopes. Peptides 2000;21:589-99.

12. Sun G, Stacey MA, Schmidt M, Mori L, Mattoli S. Interaction of mite allergens Der P3 and Der P9 with protease-activated receptor-2 expressed by lung epithelial cells. J Immunol 2001;167:1014-21.

13. Kauffman HF, Tomee JF, van de Riet MA, Timmerman AJ, Borger P. Protease-dependent activation of epithelial cells by fungal allergens leads to morphologic changes and cytokine production. J Allergy Clin Immunol 2000;105:1185-93.

14. Dery O, Corvera CU, Steinhoff M, Bunnett NW. Proteinase-activated receptors: Novel mechanism of signaling by serine proteases. Am J Physiol 1998;274:1429-52.

15. Ishii K, Gerszten R, Zheng YW, Welsh JB, Turck CW, Couhlin SR. Determinants of thrombin receptor cleavage. Receptor domains involved, specificity, and role of the P3 aspartate. J Biol Chem 1995;270: 16435-40.

16. Connolly AJ, Ishihara H, Kahn ML, Farese RV, Couhlin SR. Role of the thrombin receptor in development and evidence for a second receptor. Nature 1996;381:516-9.

17. Santulli RJ, Derian CK, Darrow AL, Tomko KA, Eckardt AJ, Seiberg M, et al. Evidence for the presence of a protease-activated receptor distinct from the thrombin receptor in human keratinocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 1995;92:9151-5.

18. D'Andrea MR, Derian CK, Leturcq D, Baker SM, Brunmark A, Ling P, et al. Characterization of protease-activated receptor-2 immunoreactivity in normal human tissues. J Histochem Cytochem 1998;46: 157-64. 

19. Lan RS, Stewart GA, Henry PJ. Role of protease-activated receptors in airway function: A target for therapeutic intervention? Pharmacol Therpeuics 2002;95:239-57.