교신저자：조양선, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
              전화：(02) 3410-3579, 6727 · 전송：(02) 3410-3879 · E-mail：yscho@smc.samsung.co.kr
              현소속：정재윤(단국대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실)

서     론

   p53 단백질은 종양억제유전자(tumor suppressor gene)에 의해 생산되는 분자량 53 kDa의 핵인산단백이다. 정상적인 환경에서 p53은 유전자를 보호하는 기능을 하여 유전자가 손상되었을 때 세포의 증식을 G1단계에서 멈추게 하여 유전자를 복구시키고, 복구가 안 될 경우에는 손상 받은 세포의 고사를 일으키도록 유도한다고 알려져 있다.¹⁾²⁾
   p53은 암세포에서의 과다발현과 관련되어 변이형 p53에 대해 주로 연구되어져 왔으나 최근 양성피부질환에서의 발현에 관한 연구도 많이 보고되었다. 활발한 과증식이 일어나는 다양한 피부병변(건선, 만성피부염, 지루성 각화증, 편평태반)에서의 p53이 다양한 정도로 과발현을 보였는데,²⁾ 이는 각질세포의 비정상적인 증식에 대한 반응으로 야생형 p53이 각질세포의 고사를 유발하기 위해 과발현된 것이라고 할 수 있다.
   중이진주종에서도 p53의 역할에 관한 연구가 많이 이루어졌다. 중이진주종의 형성은 중이강의 염증으로 인한 외이도나 고막 표피세포의 중이강 내로의 이동, 그 후에 일어나는 과증식 및 분화로 인한 각질축적의 결과로 생각되고 있다. 진주종에서 나타나는 각질화는 일종의 고사의 결과로 볼 수 있으며 여기에 p53 단백질이 관여되는 것으로 알려져 있다.³⁾ Shinoda와 Huang⁴⁾은 야생형 p53의 항체를 이용하여 진주종의 과립층에 있는 각질세포의 핵 속에서 p53의 존재를 확인할 수 있었으며, 중이진주종에서 각질세포의 고사에 p53이 관여할 것이라는 가능성을 제시하였다. 하지만 중이진주종에서 p53의 과발현이 p53유전자에서의 전령리보핵산(mRNA)을 만들어내는 전사단계에서 이루어지는 항진의 결과인지, 생성된 p53의 반감기의 증가와 같은 단백질 수준의 변화 때문인지는 명확하게 밝혀지지 않았다.
   본 연구에서는 환자들로부터 얻어진 진주종 조직과 정상피부조직을 대상으로 면역조직학적 검색방법과 반정량적 역전사 중합효소반응(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 이용한 p53 mRNA의 측정을 같이 시행함으로써 중이진주종에서 p53의 과발현 여부와 그 기전을 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

면역조직학적 염색

연구대상
   진주종성 중이염으로 중이수술을 받은 환자에서 수술시 진주종 조직을 얻었으며, 정상피부는 후이개피부를 소량 채취했다. 총 27예의 진주종 조직 중 11예를 관찰하였으며 정상 피부는 4예를 관찰하였다. 

조직의 처리
   수술시 채취된 조직은 즉시 4% paraformaldehyde로 10~16시간 동안 4℃냉장실에서 조직 고정을 한 후에 파라핀으로 포매하여 4 μm 두께의 절편을 만들었다.

면역조직학적 염색 및 관찰
   파라핀 조직 슬라이드를 탈파라핀화를 시킨 후 메탄올로 희석한 과산화수소에 20분간 처리하여 내인성 과산화수소수를 제거하고 인산완충용액(pH 7.4)으로 세 차례 세척했다. 실온의 수조에서 차단항체와 30분간 반응시켜 비특이성 항원을 차단하고 1：100으로 희석한 일차항체인 p53 (Zymed laboratories, U.S.A.)을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 인산완충용액으로 세 차례 세척하고, 이차항체인 biotinylated antimouse IgG(Vector Elite kit, Vector laboratories, U.S.A.)를 실온의 수조에서 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세 차례 세척한 뒤 ABC reagent (Vector laboratories, U.S.A.)를 가한 뒤 실온의 수조에서 45분 동안 반응시키고, diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma Chemicals, U.S.A.)으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. Harris 헤마톡실린으로 20초간 대조 염색한 후 Permount로 봉입하였다.

결과의 판독 및 통계적 처리
   두 사람의 판독자가 100배의 배율에서 500개의 표피세포들 중에서 양성으로 염색된 세포수의 백분율로 표시하였다. 주변부에 비하여 선명하게 갈색으로 나타나는 세포를 양성으로 판정하였다. 진주종과 정상피부 사이의 p53의 발현을 분석하기 위해 SPSS 7.5(SPSS Inc., Chicago, USA)를 이용하여 비모수 검증법인 Wilcoxon Rank Sum test를 사용하였다. 

역전사 중합효소반응을 이용한 반정량적 분석 

연구대상
   수술 중 얻은 중이진주종과 정상 피부 중 면역조직학적 염색에 포함되지 않은 나머지 각각 16예를 대상으로 관찰하였으며 양성 대조군으로서 p53유전자가 과발현되는 것으로 알려진 두경부 편평상피세포암 세포주(AMC-HN-1, AMC-HN-3)를 사용하였다. 

조직 채취 및 처리
   수술시 채취된 조직은 즉시 액체 질소에서 급속 동결시켜서 실험하기 전까지 -70℃ 냉장고에 보관하였다. 냉장 보관된 조직은 TRIzol 용액(GIBCO BRL, USA)에 넣어 멸균 소독된 가위로 잘게 잘라서 분해하여 균일화시켜 사용하였다.

역전사-중합효소반응
   Total RNA는 TRIzol 용액을 사용하여 추출하였고 분광광도계(Genequant, Pharmacia, Sweden)를 이용하여 260 nm에서 RNA양을 측정하였으며 조직에서 얻어진 RNA의 온전성(integrity)을 확인하기 위해 한천겔에서 전기영동시켰으며 ethidium bromide 염색으로 28S rRNA와 18S rRNA의 존재를 확인하였다. 1 μg total RNA를 1 μl random hexamer(25 μM), 1 μl 10 mM dNTP(0.5 mM), 1×First strand buffer, 0.1 mM DTT와 1 μl SUPERSCRIPT II(200 U/μl, GIBCO BRL, USA)를 이용하여 42℃에서 50분간 반응 시켰다. 이렇게 얻은 cDNA를 주형으로 사용하여 중합효소반응을 시행하였다. 조직에 존재하는 p53 mRNA의 상대적인 양을 측정하기 위해 RNA양의 상대적 척도가 되는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 이용하였다. 이때 사람 p53의 primer의 염기서열은 Human p53 amplimer Set(Clonetech, USA)를 사용하였고, GAPDH의 specific primer는 human control amplimer set(Clonetech, USA)를 이용하였다(Table 1).⁵⁾ 중합효소반응물로 1×PCR reaction buffer, 0.2 mM dNTP, 0.4 μM 5' primer, 0.4 μM 3' primer, 2U Tag DNA polymerase, 2 μl cDNA를 넣고 전체 부피가 50 μl가 되도록 3차 증류수를 첨가하여 다음 조건으로 반응시켰다. GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER, USA)을 이용하여 94℃에서 3분간 반응물을 변성(denaturation)시킨 후 94℃에서 45 초, 65℃에서 1분(GAPDH는 65℃), 72℃에서 1분간 32회 중합효소반응을 시행하였다. 마지막 cycle은 72℃에서 5분간 연장 반응시켰다. 중합효소반응 결과 p53, GAPDH 생산물은 각각 371 bp, 452 bp의 크기를 갖는다. Cycle 수는 time kinetic analysis를 통해 직선상의 증폭범위를 구하여 이 범위 내에서 정했다(Fig. 1). 두경부 편평상피세포암 세포주(AMC-HN-1, AMC-HN-3)를 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군으로는 template가 없는 중합효소반응물을 사용하였다.

중합효소반응 생산물의 써던블롯 분석
   중합효소반응 생성물을 1.2% 한천겔에 전기영동시킨 다음 겔을 변성(1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH), 세척, 중화(0.5 M Tris-HCl(pH 8.0), 1.5 M NaCl) 단계를 거친 후 모세관법(capillary method)으로 나일론막(Amersham, England)으로 전이시키고 UV cross linker를 이용하여 막에 전이된 DNA를 고정하였다. 막은 보합결합용액(hybridization buffer；50% formamide, 4×SSC, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2.5 mM EDTA, 0.1% SDS, 0.25 mg/ml ssDNA, 5×Denhardt’s 용액)으로 42℃에서 2시간 동안 미리 혼성화시킨 후 [α-32P]dCTP로 표시된 소식자(probe)를 보합결합용액에 첨가시킨 후 42℃에서 12시간 이상 보합결합 시켰다. 사용한 소식자는 p53과 GAPDH의 cDNA를 random primed labelling 방법으로 labelling시켜 만들었다. 그런 다음 혼성화된 막은 Sol I(2×SSC, 1% SSC)로 실온에서 20분간 세척하고 다시 Sol II(2×SSC, 0.5% SCS), Sol III(0.1×SSC, 0.5% SDS)로 60℃에서 잘 씻었다. 이렇게 만든 막은 비닐팩에 잘 봉합한 후 phosphoimager의 screen에서 적당한 시간 동안 노출시키고 MCID software를 이용하여 방사능 활성도를 측정하였다. 그리고 막 위에 X-ray 필름을 얹어서 -70℃ 냉동고에서 방치시킨 후 감광된 필름을 현상하여 결과사진을 얻었다. 

p53/GAPDH 비율을 이용한 분석 및 통계처리
   조직에서 p53 mRNA의 상대적인 양을 p53/GAPDH 비율을 이용한 반정량적 분석으로 측정하였다. 이 값을 진주종조직과 정상피부, 그리고 두경부 편평상피암 세포주에서 각각 비교하였다. 정상피부군과 진주종조직군의 p53 mRNA의 상대적인 양의 차이를 SPSS 7.5(SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 비모수검정법인 Wilcoxon Signed Rank test로 분석하였으며, 유의수준은 0.05를 기준으로 하였다.

결     과

면역조직학적 염색
   p53은 주로 기저층(basal layer)과 기저상부층(suprabasal layer)에서 염색되었으며(Fig. 2), 진주종조직(13.15±15.91%)과 정상조직(0.50±0.48%)에서의 발현정도는 의미 있는 차이를 보였다(p=0.003, Wilcoxon Rank Sum test).

역전사 중합효소반응을 이용한 반정량적 분석 
   p53의 상대적인 양은 중이 진주종에서 평균 0.48±0.29, 정상피부에서는 평균 0.42±0.29으로 두 군에서 의미 있는 차이를 발견할 수 없었다. 음성대조군에서는 밴드를 얻을 수 없었으며 양성대조군으로 사용한 편평상피암 세포주에서는 각각 0.95 및 1.10으로 중이 진주종이나 정상피부보다 월등히 높게 측정되었다(Table 2, Fig. 3).

고     찰

   진주종의 과증식성은 PCNA, Ki-67 등을 이용한 여러 연구에서 이미 증명되었다.⁶⁾⁷⁾ 증식의 지표인 Ki-67은 진주종 이외에도 정상 피부에서 1~3%, 과증식성을 보이는 편평태반, 건선 등 양성 피부병변에서는 4~17%로 세포분열이 많은 피부병변에서 Ki-67의 과발현을 확인한 보고가 있으며, 이 연구에서 p53의 양성 정도가 높을수록 Ki-67의 양성 정도가 의미있게 증가하였으며, 이는 상피세포의 과증식에 대한 반응으로 p53이 축적이 되고 이는 고사와 관계가 있을 것이라고 하였다.²⁾ 세포 증식과 관련되어 나타나는 단백질인 Ki-67과 세포 주기의 정지를 유도하는 p53이 같이 증가하는 이유로는 p53이 최대로 발현되어도 많은 수의 잠재적인 증식세포를 모두 억제하지는 못했기 때문에 두 단백질이 동시에 증가하였을 것이라고 해석할 수 있다.⁸⁾ 하지만 중이진주종에서의 p53 과발현에도 불구하고 고사의 증가를 보이지 않는 실험 결과들은 진주종 조직에서의 p53 과발현이 일반적인 caspase를 통한 고사로 이어지지 않을 가능성을 제시하고 있다.⁹⁾ 
   본 연구에서 중이진주종의 면역조직학적 염색에서 p53 양성율은 13.15±15.91%로 나왔으며, 이는 Huisman 등의 연구에서 발표한 17.8±12.3%의 양성율과 유사한 결과를 보였으며 발현부위 역시 주로 기저층으로 본연구와 비슷한 결과를 보였다.⁹⁾
   p53은 잘 알려진 대로 종양억제유전자의 산물로서 세포증식을 억제하며, 유전자가 손상되었을 경우 이를 복구하거나 유전자 손상에 의한 고사를 유도하게 되는데, 최근에 알려진 바로는 p53의 작용 조절은 절대적인 p53 양의 증감, 단백질간의 상호작용, post-translational modification, 등에 의해 모두 이루어지며 세포의 종류에 따라 다른 표적유전자를 가지며 다양한 반응속도와 반응역치를 보인다고 여겨지고 있다.¹⁰⁾
   본 연구에서도 p53의 과발현에도 불구하고 p53 mRNA의 증가를 보이지 않은 것은 p53의 절대적인 양의 증가보다는 단백질 단계에서의 변화에 의한 것일 가능성을 보여 주는데, 최근 진주종 조직에서 다양한 유전자의 mRNA의 과발현 여부를 살펴본 연구에서도 유사한 결과를 보였다. 이 연구에서는 상품화된 DNA chip을 이용하여 1,700여 가지의 유전자에 대해 cDNA array를 시도하였는데 그 결과 p53 mRNA의 과발현은 보이지 않았다.¹¹⁾
   정상 세포에서 p53은 ubiquitin-dependent proteasome pathway에 의한 급속한 분해로 인해 매우 낮은 정도로 유지되어 활성화가 억제된다. 이러한 p53의 분해에 관여하는 것이 MDM2 단백질이다. p53의 양은 주로 MDM2 oncoprotein에 의해 전사후 단계에서 조절된다고 하며, p53의 phosphorylation이 일어날 경우 p53 분해에 관여하는 MDM2의 작용이 방해를 받아 결과적으로 p53의 활성화가 일어난다고 이해되고 있다.¹⁰⁾ 또한 MDM2 단백에 dephosphorylation이 일어날 경우 p53의 억제가 제대로 이루어지지 않아 결과적으로 p53의 안정화에 기여할 가능성도 제기되고 있다.¹²⁾
   Albino 등은 진주종 검체의 95%에서 p53이 발현되었고 상피세포 중에서의 p53의 양성세포의 비율은 7.5~16.5%라고 했으며,¹³⁾ Shinoda 등은 야생형 p53 항체를 이용하여 진주종 상피의 과립층에 있는 각화세포의 핵 속에서 p53의 존재를 확인할 수 있었다.⁴⁾ 진주종에서 p53의 발현은 염색체 연구에서 알려진 바와 같이 악성종양과 같은 유전자의 불안정에 따른 과발현은 아닐 것이며 진주종에서의 세포 증식을 조절하기 위해 p53이 과증식을 멈추고 고사를 유도하는 기전으로서 나타난 것으로 생각된다.¹⁴⁾ 또한 p53에 의해 전사단계에서 영향을 받는 Fas/APO-1 같은 단백질도 진주종에서 고사의 증진과 관계된다고 밝혀지고 있다.¹⁵⁾
   진주종 이외에도 돌연변이가 없는 양성 조직에서의 p53의 발현은 후두유두종, 후두결절, 후두용 등의 양성후두질환,¹⁶⁾ 피부모반, 편평태반,¹⁷⁾ 다형성 홍반¹⁸⁾ 등에서 연구가 되었으며, 모든 연구에서 야생형과 돌연변이형 모두에 반응하는 pan-antibody를 사용하였으나 양성조직에서 나타나므로 야생형일 것이라고 추정하였다. 이번 연구에서도 처음에는 야생형 항체를 이용하여 p53을 검출하려고 하였지만 정상조직뿐 만 아니라 진주종에서도 염색이 거의 관찰되지 않았다. 그러나 pan-antibody를 사용하여 진주종에서 발현을 관찰할 수 있었다. 이러한 현상에 대한 원인으로 추정할 수 있는 것은 야생형 항체의 경우 돌연변이형이 염색이 되지 않도록 많은 epitope를 차단하였고 따라서 민감도가 pan-antibody에 비하여 떨어지기 때문이라고 생각되었다.
   일반적으로 조직 내에서 단백질을 정량적으로 분석하기 위한 방법으로 면역조직화학적 방법은 적절하지 않지만 본 연구의 결과에서처럼 진주종에서는 약 13%의 세포에서 발현되면서 정상조직에서는 거의 발현되지 않아, 차이가 확연하게 난다면 의미를 부여할 수 있을 것이다. 또한 mRNA의 정량적인 분석에서도 대개 노던블롯을 이용하지만 이는 예민도가 낮아 발현이 극히 낮은 유전자는 검출할 수 없으며 또한 실험에 필요한 RNA의 양이 대개 20 μg 정도로 많이 필요하므로 진주종과 같이 소량의 RNA만을 얻을 수 있는 실험에서는 분석이 어렵다.
   본 실험에서도 진주종과 같은 양성조직에서는 p53의 발현이 많지 않으며 수술 중 얻은 검체에서 RNA를 분리하였을 때 5 μg 이하의 소량이었으므로, 이러한 문제점을 극복하기 위하여 상대적 역전사 중합효소반응을 이용한 p53 mRNA의 반정량적 측정을 시행하였다. 그러나 역전사 중합효소반응은 반응이 충분히 진행되었을 경우는 초기의 주형량에 구애받지 않는 동량의 생성물이 생기므로 상대적인 증폭 산물량으로 원래의 주형량을 추정하기가 어려워진다. 그러나 중합효소반응 횟수에 비례하여 생성물이 증가하는 범위 내에서만 증폭을 시행하여 분석을 하게 되면 주형량의 추정이 가능하며 다른 RNA 정량적 검사와 동일한 정도의 신뢰성을 가진다.¹⁹⁾ 따라서 저자들은 time kinetic analysis를 통해 유전자의 직선상의 증폭범위를 구하였고 그 범위 안에서 중합효소반응 횟수를 32회로 정해 실험하였다.
   이번 연구에서의 결과에서 중이진주종에서의 p53의 활성화가 mRNA의 양적 증가를 동반하지 않음을 알 수 있었다. 앞으로 p53의 활성도에 영향을 미치는 전사 이후 단계에서의 여러 단백질간의 상호작용과 발현양상을 중이진주종에서 밝히는 연구가 필요하겠다. 

결     론

   중이진주종에서 정상피부에 비해 p53이 과발현 되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 p53 mRNA의 증가와 동반되지 않았다.

1. Cristofolini M, Boi S, Girlando S, Zumiani G, Cristofolini P, Palma PD, et al. p53 protein expression in nevi and melanoma. Arch Dermatol 1993;129:739-43.

2. Soini Y, Kamel D, Paakko P, Lehto VP, Oikarinen A, Vahakangas K. Aberrant accumulation of p53 associates with Ki-67 and mitotic count in benign skin lesions. Br J Dermatol 1994;131:514-20.

3. Shinoda H, Huang CC. Heat shock proteins in middle ear cholesteatoma. Otolaryngol Head Neck Surg 1996;114:77-83.

4. Shinoda H, Huang CC. Expression of c-jun and p53 proteins in human middle ear cholesteatoma: Relationship to keratinocyte proliferation, differentiation, and programmed cell death. Laryngoscope 1995;105:1232-7.

5. Harris N, Brill E, Shohat O, Prokocimer M, Wolf D, Arai N, et al. Molecular basis for heterogeneity of the human p53 protein. Mol Cell Biol 1986;6:4650-6.

6. Bujia J, Sudhoff H, Holly A, Hildmann H, Kastenbauer E. Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen in middle ear cholesteatoma. Eur Arch Oto Rhino Laryngol 1996;253:21-4.

7. Bujia J, Holly A, Sudhoff H, Antoli-Candela F, Tapia MG, Kastenbauer E. Identification of proliferating keratinocyte in middle ear cholesteatoma using the monoclonal Ab Ki-67. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1996;58:23-6.

8. Albino AP, Reed JA, Bogdany JK, Sassoon J, Desloge RB, Parisier SC. Expression of p53 protein in human middle ear cholesteatoma. Am J Otol 1998;19:30-6. 

9. Huisman MA, De Heer E, Grote JJ. Cholesteatoma epithelium is characterized by increased expression of Ki-67, p53 and p21, with minimal apoptosis. Acta Otolaryngol 2003;123:377-82.

10. Prives C, Hall PA. The p53 pathway. J Pathol 1999;187:112-26.

11. Tokuriki M, Noda I, Saito T, Narita N, Sunaga H, Tsuzuki H, et al. Gene expression analysis of human middle ear cholesteatoma using complementary DNA arrays. Laryngoscope 2003;113:808-14.

12. Blattner C, Hay T, Meek DW, Lane DP. Hypophosphorylation of Mdm2 Augments p53 Stability. Mol Cell Biol 2002;22:6170-82.

13. Albino AP, Kimmelman CP, Parisier SC. Cholesteatoma: A molecular and cellular puzzle. Am J Otol 1998;19:7-19.

14. Kojima H, Tanaka Y, Tanaka T, Miyazaki H, Shiwa M, Kamide Y, et al. Cell proliferation and apoptosis in human middle ear cholesteatoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998;124:261-4.

15. Park HJ, Park K. Expression of Fas/APO-1 and apoptosis of keratinocytes in human cholesteatoma. Larngoscope 1999;109:613-6.

16. Ingle RR, Setzen G, Koltai PJ, Monte D, Pastore J, Jennings TA. p53 protein expression in benign lesions of the upper respiratory tract. Arch Otolaryngol Head Neck 1997;123:297-300.

17. Dekker NP, Lozada-Nur F, Lagenaur LA, MacPhail LA, Bloom CY, Regezi JA. Apoptosis-associated markers in oral lichen planus. J Oral Pathol Med 1997;26:170-5. 

18. Chrysomali E, Lozada-Nur F, Dekker NP, Papanicolaou SI, Regezi JA. Apoptosis in oral erythema multiforme. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1997;83:272-80. 

19. Ceol M, Forino M, Ganbaro G, Sauer U, Scheicher ED, D'Angelo A, et al. Quantification of TGF-β1 mRNA in porcine mesangial cells by comparative kinetic RT/PCR: Comparison with ribonuclease protection assay and in situ hybridization. J Clin Lab Anal 2001;15:215-22.