교신저자：이상흔, 700-721 대구광역시 중구 삼덕 2가 50  경북대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Cyclin과 cyclin-dependent kinase(CDK) 복합체는 세포주기(cell cycle)의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 이러한 cyclin-CDK 복합체는 주로 세포주기 진행을 억제하는 여러 cyclin-dependent kinase inhibitors(CDKI)에 의해 조절되고 있다. 일반적으로 CDKI는 구조적, 기능적 특성에 따라 INK4(INhibitors of CDK4)군과 Kip/Cip(Kinase inhibiting protein, CDK inhibiting protein)군의 두 군으로 나뉠 수 있는데 INK4군은 p16^INK4A, p15^INK4B과 p18^INK4C가 포함되며 주로 cyclin D-CDK4/6 복합체를 억제한다고 알려져 있다.²⁾ Cip/Kip군에는 p21^CIP1, p27^Kip1과 p57^Kip2이 있으며 cyclin D-CDK4/6, cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2와 같은 다양한 cyclin-CDK 복합체를 억제한다.³⁾ p27^Kip1은 핵 내의 세포주기에 관여하는 다양한 cyclin-CDK 복합체 특히 cyclin E-CDK2 복합체와 결합하여 CDK의 활성도를 약화시키는 CDKI로 알려져 있으며 G1기의 진행을 억제하여 세포주기를 정지시킨다.⁴⁾ 또한 최근 연구에서는 p27^Kip1이 내이 세포증식 및 고사에 중요한 역할을 함이 알려 졌다. p27^Kip1은 내이발생과정 중 유모세포와 지지세포 모두에서 발현되며 미성숙 세포증식을 조절하고 성숙 내이에서는 지지세포에서만 발현한다.⁵⁾ 뿐만 아니라 p27^Kip1은 이독성 약물에 의한 내이변성에도 관여한다.⁶⁾
   그람 음성균 감염 치료에 주로 사용되는 aminoglycoside는 내이에서 청력저하와 평형 기능의 장애를 나타낸다. Aminoglycoside의 이독성 기전에는 반응성 산소종의 역할(Reaction oxygen species, ROS),⁷⁾ N-methyl D-aspartate(NMDA) 수용체의 과자극,⁸⁾ 미토콘드리아의 기능장애 등⁹⁾이 알려져 있다. 그러나 aminoglycoside의 전정 이독성에서 내이 세포증식과 고사를 조절하는데 중요한 p27^Kip1에 대한 연구는 없었다.
   본 연구에서는 aminoglycoside계 항생제인 겐타마이신에 의한 이독성에 있어서 p27^Kip1의 역할을 밝혀 보고자 하였다. 이를 위하여 C57BL/6 생쥐에서 겐타마이신을 국소 주사하여 이독성을 유발하여 세포고사가 일어남을 확인하고, 시간경과에 따른 p27^Kip1의 발현 양상을 면역조직 화학 염색과 단백면역전기영동으로 관찰하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 겐타마이신 투여
   Preyer반사가 정상인 C57BL/6 생쥐(생후 6주, 20~25 gm) 27마리를 사용하였다. 겐타마이신에 의한 이독성 유발은 Nakagawa의 방법¹⁰⁾에 따라 내이로 국소 투여하였다. 실험 동물을 ketamin(100 mg/kg)과 xylazine(9 mg/kg)으로 복강내 주사하여 마취하고 이개 후방을 절개하여 후반고리관 및 수평반고리관을 확인하였다. 26게이지의 바늘을 이용하여 후반고리관에 작은 구멍을 만들어 5 μl의 겐타마이신용액(40% w/v)을 주사한 후 연조직을 이용하여 후반고리관의 구멍을 막고 피부 절개부위를 봉합하였다. 실험군은 주사 후 경과시간에 따라 1일군(9마리)과 3일군(9마리)으로 나누었다. 정상군(9마리)은 처치 없이 조직을 채취하였다. 

조직절편준비
   각 군당 5마리의 C57BL/6 생쥐로부터 조직을 채취하였다. 실험군은 겐타마이신을 주사하고 1일, 3일 후에 4% paraformaldehyde를 심장 관류를 시행 후에 측두골을 채취하였다. 측두골은 섭씨 4도에서 4시간 동안 4% paraformaldehyde에서 고정시켰다. 수평반고리관의 팽대부를 측두골로부터 분리하여 10 μm두께의 동결절편을 제작하였다. 정상군에서도 같은 방법으로 수평반고리관 팽대부 절편을 얻었다.

TUNEL염색
   ApopTag Fluorecein Direct In Situ Apoptosis Detection Kit(Intergen, NY, USA)를 이용하여 TUNEL 염색을 하였다. 0.5% Triton X-100을 슬라이드 위에 떨어뜨리고 실온에서 30분간 배양하였다. 인산 완충 식염수(PBS；pH 7.6)으로 5분간 3회 세척한 후 kit에 준비된 평형 완충액 75 μl를 절편에 가하고 실온에서 10초간 배양하였다. 절편주위의 수분을 제거한 후에 working strength TdT enzyme을 절편에 가하고 섭씨 37도에서 1시간동안 반응시켰다. stop/wash 용액을 절편에 가하고 실온에서 10분간 배양한 후 PBS로 1번 세척하였다. 2 μg/ml 4’,6-diamino-2-phenylindoledihydrochloride 용액(DAPI；Molecular Probes, Eugene, OR)에 15분간 반응시켜 대조염색 하였다. 그 후 절편을 PBS로 2회 세척한 다음 Vector shield(Vector Laboratories Inc. Burglingame, CA)를 절편 위에 조심스럽게 떨어뜨리고 덮개유리로 덮은 후 형광현미경(ECLIPSE E600, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 10 μg/ml의 DNAse 1(Sigma-Aldrich corporation, St. Louis, MO)을 실온에서 15분간 반응시킨 절편을 양성대조염색으로 하였으며, 음성대조염색을 위해서 working strength TdT enzyme만을 빼고 같은 방법으로 염색하였다. 각 실험 동물마다 5개의 조직절편을 관찰하여 팽대부 유모세포층에서 TUNEL 양성세포 수를 구하였고 그 합을 각 실험동물의 값으로 하여 통계학적인 분석을 하였다.

p27^Kip1 면역조직화학염색
   0.5% Triton X-100을 슬라이드 위에 떨어뜨리고 실온에서 30분간 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% 정상 염소 혈청에서 20분간 배양하고, PBS로 3회 세척한 후에 일차항체인 p27^Kip1 mouse monoclonal항체(1：100, Neomarker, Fremount, CA)로 섭씨 4도에서 24시간 동안 반응시켰다. 상온에서 PBS에 3회 세척한 후 2차 항체인 Alexa Fluor 594에 결합된 anti-mouse goat immunoglobin(1：200, Molecular Probes, Eugene, OR)에 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS에 세척한 후 2 μg/ml DAPI용액에 15분간 반응시켜 대조염색 하였다. 그 후 절편을 PBS로 2회 세척한 다음 Vector shield를 절편 위에 조심스럽게 떨어뜨리고 덮개유리로 덮은 후 형광현미경으로 관찰하였다. 음성 대조군은 p27^Kip1에 대한 일차항체 대신 PBS로 대치시키고 나머지 방법은 같은 방법으로 시행하였다. DAPI염색의 양성여부 및 위치에 따라 남아 있는 유모세포 수와 지지세포 수를 정하였다. 각 실험 동물마다 5개의 조직절편을 관찰하여 남아있는 유모세포 수, 지지세포 수, p27^Kip1 양성 지지세포 수를 구하였고 그 평균을 각 실험동물의 값으로 하였다. 통계학적인 분석을 위하여 유모세포 생존률과 p27^Kip1 양성률을 계산하였다. 정상군의 유모세포 수에 대한 실험 동물의 유모 세포 수의 비를 유모세포 생존률로 하였다. 실험동물의 지지세포 수에 대한 p27^Kip1 염색에 양성인 지지세포 수의 비를 p27^Kip1 양성률로 하였다.

p27^Kip1 단백면역전기영동
   단백면역전기영동을 시행하기 위하여 각 군당 4마리에서 수평반고리관 팽대부를 채취하였다. 면역조직화학염색에서 사용한 p27^Kip1 mouse monoclonal 항체를 일차 항체로 사용하였다. 동물을 에테르로 마취하고 두부를 절단한 후 측두골에서 수평반고리관 팽대부를 신속히 채취하였다. 팽대부를 apoprotinin, leupeptin, trypsin inhibitor, phenylmethylsul-fonyl fluoride가 들어 있는 lysis buffer(25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)에 넣고 균질화하였다. 초음파처리를 한 후, 팽대부 균질액을 섭씨 4도에서 15,000 g로 20분간 원심분리하였다. 단백의 농도는 BCA kit(Pierce chemical company, Rockford, IL)로 정량화하였다. 4개의 팽대부에서 얻어진 4 μg의 단백을 포함하는 부유물을 15% SDS-PAGE minigel에서 25 mA의 고정전류로 전기영동하였다. Polypeptide를 전이막인 Immobilon-P(Millipore corporation, Bedford, MA)에 70 V에서 2시간동안 전이하였다. 차단용액(5% 탈지분유, 0.1% Tween-20, 137 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.6)으로 전이막의 비특이적 결합을 차단하고 1：400으로 희석한 p27^Kip1 mouse monoclonal 항체에 섭씨 4도에서 하룻밤동안 반응시켰다. 3회 세척한 후, 1：5,000으로 희석한 horseradish peroxidase(HRP)가 붙은 anti mouse IgG 항체(Pierce chemical company, Rockford, IL)에 2시간 동안 상온에서 흔들면서 반응시켰다. 다시 세척한 후 ECL kit(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 화학발광시켰다.

통계처리
   겐타마이신 투여 후 생존 기간에 따른 팽대부에서 TUNEL 양성 세포 수, 유모세포 생존률, p27^Kip1 양성률 변화의 차이를 검증하기 위하여 ANOVA(Fisher's Protected Least Significant Difference)를 사용하였다. 통계학적인 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우로 하였다.

결     과

TUNEL 염색
   TUNEL 염색의 음성대조 염색에서 염색된 핵은 없었고, 양성대조 슬라이드에서는 모든 핵이 양성으로 관찰되었다. 실험군인 1일, 3일군의 유모세포에서 양성세포가 관찰되었으나 지지세포에서는 양성 세포는 관찰되지 않았다(Fig. 1B and C). 정상군에서는 양성세포가 관찰되지 않았다(Fig. 1A). 겐타마이신 투여 후 1일군에서는 TUNEL 양성세포가 10±3.5개, 3일군에서는 43±5.7개가 관찰되어 gentamicin 투여 후 시간 경과에 따라 유모세포의 고사가 통계학적으로 의미 있게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 2).

p27^Kip1 면역조직화학염색
   겐타마이신 투여 후 시간 경과에 따라 일부 유모세포의 손실이 관찰되었다(Fig. 3E and F). 정상군에서 p27^Kip1은 대부분의 지지세포들이 강한 양성반응을 보였고, 유모세포에서는 관찰되지 않았다(Fig. 3A). Gentamicin 투여군에서 p27^Kip1 양성세포는 지지세포에서 관찰되었고 유모세포에서는 관찰되지 않았다. 또한 겐타마이신 투여군에서 시간경과에 따라 p27^Kip1 양성 지지세포 수가 감소하였다(Fig. 3B and C). Gentamicin 투여 후 유모세포 생존률은 1일군에서 0.81±0.10, 3일군에서 0.42±0.04로 정상군과 비교하여 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 4). 지지세포에서 p27^Kip1 양성률은 gentamicin 투여 후 1일군에서 0.59±0.08, 3일군에서 0.18±0.03로 역시 통계학적으로 의미 있게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 4).

p27^Kip1 단백면역전기영동
   각 실험군과 정상군의 팽대부에서 추출한 단백에서 p27^Kip1의 발현을 관찰하였다. Gentamicin 투여 후 1일군에서의 발현은 정상군과 차이가 없었고 3일군에서의 발현이 현저히 감소하였다(Fig. 5).

고     찰

   Aminoglycoside의 부작용 중 대표적인 것은 신독성과 이독성이다. 신독성에 비하여 이독성은 비가역적으로 영구적인 청력 및 전정기능의 손실을 초래하는 경우가 많다. 와우와 전정 기능의 평가방법들이 다르고, 각기 다른 aminoglycoside에 대한 여러 가지 결과보고 때문에 이독성의 발생율은 일반화하기엔 어렵다. 기준에 따라 다르지만 이독성의 유병율은 0.6~30%이며 전정 독성은 0~75%이고 전반적으로 볼 때 7.5%로 보고되고 있다.¹¹⁾ 동물 실험에서의 병리 소견은 인간에서의 경우와 매우 흡사하다. 와우의 독성은 기저회전부위부터 첨단부로 파급되며 외유모세포의 제 1 열이 가장 먼저 심한 손상을 받으며 차례로 제 2 열, 제 3 열이 손상된다. 전정기관의 독성은 팽대부나 반(macula)의 유모세포 소실로 나타나며 주로 제 1 형 유모세포가 손상되고 지지세포는 이독성의 영향을 잘 받지 않는다.¹²⁾ 이와 같이 aminoglycoside에 의한 이독성에서 와우 및 전정 유모세포의 세포고사가 주된 역할을 한다.¹³⁾ 본 실험에서도 겐타마이신에 의한 팽대부 유모세포의 세포고사를 확인 할 수 있었다. Aminoglycoside에 의한 이독성 기전은 철과 결합(chelate)하여 산화성(oxidative property)을 갖는 복합체를 형성하며,⁷⁾ 이렇게 생긴 활성복합체는 유리기의 생성을 촉진하는 것과, 글루타메이트에 의해 작용되는 NMDA 수용체에 작용하여 세포내 칼슘 유입을 조장하여 세포의 퇴행성 변화를 유발하는 것들이 알려져 있다.⁸⁾
   p27^Kip1은 처음에 TGF-β(transforming growth factor-β)나 접촉 억제(contact inhibition)의 자극에 의한 cyclin E-CDK2 복합체와 결합된 비활성인 형태로 발견되었고, 주 역할은 세포주기의 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 CDKI로 알려져 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ p27^Kip1 표현의 감소는 세포주기를 G1기에서 S기로 진행시켜 세포증식 또는 세포고사의 유도와 관련이 있다.¹⁵⁾ 내이의 발생과정에서 p27^Kip1은 태생 12일에서 태생 14일 까지 원시 코티기관의 유모세포 및 지지세포에 발현되어 세포주기를 정지시켜 유모세포 및 지지세포의 증식을 조절하고 그 이후는 지지세포에서만 발현된다.⁵⁾ p27^Kip1 결손 쥐에서는 태생 14일 이후에도 전구세포의 증식이 지속되어 과다 유모세포 및 지지세포의 형성이 관찰되었다.⁵⁾¹⁶⁾ 조류에서는 포유류와 달리 p27^Kip1가 성숙 내이의 유모세포, 지지세포 모두에서 발현되며 gentamicin 투여 시 유모세포의 p27^Kip1이 감소되어 유모세포 고사를 유도한다.⁶⁾ p27^Kip1는 C57BL/6 쥐의 나선신경절 세포에서 발현하며 cisplatin에 의한 나선 신경절 변성 시에 p27^Kip1이 감소한다.⁶⁾ 이상의 연구들에서 p27^Kip1가 내이에서 세포증식의 조절과 세포고사의 예방이라는 중요한 역할 함을 알 수 있다. 본 실험에서는 정상군과 gentamicin 투여군 모두 전정 유모세포에서의 p27^Kip1 표현을 관찰 할 수 없었다. 따라서 p27^Kip1이 조류의 유모세포고사 및 C57BL/6 쥐의 나선신경절 세포고사와는 다르게 포유류 전정 유모세포 고사의 조절에는 직접 관여하지 않는 것으로 생각된다.
   조류 및 포유류에서 손상 후 전정 유모세포의 재생이 알려져 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾
   전정기관에서 지지세포가 손상된 유모세포의 재생에 중요한 역할을 하며 그 기전은 지지세포의 증식 및 유모세포로의 분화(transdifferentiation) 등이 알려져 있다.¹⁹⁾²⁰⁾ 본 실험에서는 p27^Kip1가 지지세포에서만 표현되며 유모세포 손상에 비례하여 p27^Kip1 양성 지지세포 수가 감소하였다. 겐타마이신에 의한 팽대부 유모세포 손상 후 지지세포의 p27^Kip1 표현 감소는 지지세포를 세포주기 G1기에서 S기로의 진행하게 하여 지지세포 증식 및 분화를 증가시켜 유모세포 재생에 관여 할 것으로 생각된다.
   효과적인 내이 유모세포 재생을 위하여 향후 p27^Kip1 표현을 조절하는 기전에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   C57BL/6쥐를 이용한 본 실험에서 정상 쥐에서의 p27^Kip1 단백 발현은 팽대부 지지세포에서만 관찰되었고 유모세포에서는 관찰되지 않았다. 이들 쥐에 겐타마이신을 국소 주사한 경우 팽대부 유모세포의 고사가 유도되었고, p27^Kip1 단백의 팽대부 지지세포에서의 발현이 감소하였다.
   이를 통하여 겐타마이신에 의한 전정 이독성에서 p27^Kip1은 유모세포 고사의 조절보다는 유모세포 손상 후 세포 증식 및 분화에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.

1. Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer II: Cyclin D and CDK inhibitors come of age. Cell 1994;79:573-82.

2. Hirai H, Roussel MF, Kato JY, Ashmun RA, Sheer CJ. Novel INK4 proteins, p19 and p18, are specific inhibitors of the cyclin D-dependent kinases CDK4 and CDK6. Mol Cell Biol 1995;15:2682-8.

3. Polyak K, Lee MH, Erdjument-Bromage H, Koff A, Roberts JM, Tempst P, et al. Cloning of p27, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals. Cell 1994;78:59-66.

4. Sheer CJ, Roberts JM. Inhibitors of mammalian G1 cyclin-dependent kinase. Genes Dev 1995;9:1149-63.

5. Chen P, Segil N. p27 (Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development 1999;126:1581-90.

6. Endo T, Nakagawa T, Lee JE, Dong Y, Kim TS, Iguchi F, et al. Alteration in expression of p27 in auditory epithelia and neurons of mice during degeneration. Neurosci Lett 2002;334:173-6.

7. Pruiska EM, Schacht J. Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin complex. Biochem Pharmacol 1995;50:1749-52.

8. Segal JA, Skolnick P. Polyamine-loke actions of aminoglycoside and aminoglycoside derivatives at NMDA receptor. Eur J Pharmacol 1998;24:311-7.

9. Dehne N, Rauen U, de Groot H, Lautermann J. Involvement of the mitochondrial permeability transition in gentamicin ototoxicity. Hear Res 2002;169:47-55.

10. Nakagawa T, Kim TS, Murai N, Endo T, Iguchi F, Tateya I, et al. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res 2003;176:122-7.

11. Lesar TS. Drug induced ear and eye toxicity. In: Di Piro JT, Talbert RL, Hayes PE, editors. Pharmacotherapy. 2nd ed. chap 82. Norwalk (CN): Appleton & Lange;1993. p.1349-63.

12. Forge A, Schacht J. Aminoglycoside antibiotics. Audiol Neurootol 2003;5:3-22.

13. Nakagawa T, Yamane H, Shibata S, Nakai Y. Gentamicin ototoxicity induced apoptosis of the vestibular hair cells of guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol 1997;254:9-14.

14. Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, Sherr CJ, Massague J, Roberts JM, et al. p27, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-β and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev 1994;8:9-22.

15. Katayama N, Mahmud N, Nishii K, Ohishi K, Masuya M, Mitani H, et al. Bcl-2 in cell-cycle regulation of hematopoietic cells by transforming growth factor-beta1. Leuk Lymphoma 2000;39:601-5.

16. Lowenheim H, Furness DN, Kil J, Zinn C, Gultig K, Fero ML, et al. Gene disruption of p27 (Kip1) allows cell proliferation in the postnatal and adult organ of Corti. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:4084-8.

17. Cruz RM, Lambert PR, Rubel EW. Light microscopic evidence of hair cell regeneration after gentamicin toxicity in chick cochlea. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1987;113:1058-62.

18. Forge A, Li L, Corwin JT, Nevill G. Ultrastructural evidence for hair cell regeneration in the mammalian inner ear. Science 1993;259:1616-9.

19. Staecker H, Van De Water TR. Factors controlling hair-cell regeneration/repair in the inner ear. Curr Opin Neurobiol 1998;8:480-7.

20. Walshe P, Walsh M, McConn Walsh R. Hair cell regeneration in the inner ear: A review. Clin Otolaryngol 2003;28:5-13.