교신저자：김상윤, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(02) 3010-3710 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：sykim2@amc.seoul.kr

서     론

   두경부 악성종양은 발생 빈도는 전 세계적으로 모든 악성종양 중 5위를 차지하며 미국의 경우 매년 약 40000명의 환자가 발생하며 12,000여명이 이 질환으로 사망하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 한국인의 경우 2001년 보건복지부가 제시한 자료에 의하면 두경부 악성 종양으로 인한 사망이 한해에 약 2200여명이다. 장기적인 흡연과 음주가 두경부 악성종양의 발생에 주된 역할을 하는 것으로 알려져 있으며,²⁾³⁾ 그 외 바이러스 감염, Vitamin A, C와 같은 영양 결핍, 직업적 노출에 의한 먼지나 광물의 흡인 등이 두경부 악성종양의 발생과 관련된 인자로 알려져 있다.⁴⁾ 그러나 두경부 악성종양의 발생이 지역간에 현저한 차이를 보이며 발병의 지역적 차이가 흡연 및 음주량의 차이와 크게 관련성을 보이지 않는다. 이런 차이의 원인으로 지역간의 흡연과 음주의 형태 및 종류의 차이, 식습관과 지역적인 감염성 질환의 차이 등을 생각할 수 있으나 최근 유전적 인자의 차이가 가장 가능성 있는 원인으로 대두되고 있다.⁵⁾
   단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이란 어떠한 유전자의 단일염기가 치환되는 것을 말하며 이차적으로 유전자의 기능적 변화를 초래해 발암물질(carcinogen)의 대사나 DNA복구에 장애를 가져온다. 이는 결과적으로 숙주(host)의 환경적 요인에 대한 감수성(susceptibility)에 영향을 주게 되어 암을 유발할 수 있다. 흡연 및 음주와 관련되어 발암 기전에 영향을 줄 수 있는 단일염기다형성은 cytochrome P450(CYP), glutathione S-transferase(GST), excision repair cross-complementation 1(ERCC1), p53, XRCC1, ras 등의 다형성이 있으며 이들은 폐, 방광, 대장, 자궁 같은 인체 내의 다른 장기에서도 발암의 위험도(risk)를 변화시키는 것으로 알려져 있다. 흡연에 의해 발생하는 중요한 발암물질로는 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAH) 등이 있으며 PAH를 포함한 대부분의 발암물질은 CYP와 같은 phase I 효소에 의해 활성화되어 독성을 지니게 되며 GST와 같은 phase II 효소에 의해 해독화(detoxification)된다. 따라서 CYP, GST의 유전적 다형성은 발암물질에 대한 촉매 활성(catalytic activity), 혹은 대사 작용에 변화를 초래해 발암에 영향을 미칠 수 있다.⁶⁾ ERCC1은 DNA 복구 유전자로 nucleotide-excision repair pathway를 통해 손상된 DNA를 복구한다. ERCC1의 유전적 다형성은 DNA 손상 후 적절한 복구 혹은 세포자멸사를 유도하지 못해 비정상적인 세포 성장 및 발암을 유발할 수 있다.⁷⁾ 종양억제유전자(tumor suppressor gene)인 p53은 DNA 손상에 반응하여 세포 주기를 조절하는 중요한 역할을 담당한다. DNA 손상이 발생하면 p53의 생산이 증가되어 세포 주기를 G1/S 접합부(junction)에 고착시키고 손상된 부분의 복구를 유도하는데 만약 이 손상이 치유 불가능하다면 세포자멸사를 통한 세포사로 유도하게 된다. p53의 유전적 다형성으로 세포 주기의 이상이 초래되면 DNA 복구의 장애와 잠재적인 돌연변이(potential mutation)의 증가로 숙주의 감수성을 변화시킬 수 있다.⁸⁾
   본 연구에서는 흡연과 음주와 관련되어 발암 기전에 영향을 미친다고 알려진 유전자에서 발생하는 유전적 다형성을 분석하여 유전적 요소가 두경부 악성종양의 발암 기전에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   1992년 4월부터 2003년 3월까지 서울아산병원 이비인후과에서 병리학적 진단으로 후두 및 하인두 편평상피암종으로 진단받은 남자 환자 중 흡연력이 있는 135명과 2002년 7월부터 2003년 3월 사이의 이비인후과 외래 진료 환자 중 악성종양의 병력이 없으며 흡연력이 있는 남자 123명을 대상으로 환자-대조군 연구를 시행하였다. 평균 연령은 환자군 63.5(35~83)세, 대조군에서 51.3(22~73)세였고 환자군 중 91명(67.4%), 대조군 중 87명(70.7%)에서 음주력이 있었다. 환자군 135명 중 76명(56.3%)은 성문암, 33명(24.4%)은 성문 상부암이었고 26명(19.3%)는 하인두암이었다(Table 1).

방  법

DNA Preparation
   환자 및 대조군에서 10 cc씩의 전혈(whole blood)을 채취한 후 B형 림프구를 분리하여 DNA를 추출하는 방법을 사용하였다. 전혈 300 μl에 적혈구 용혈 용액 900 μl를 넣어 적혈구를 제거한 후 cell lysis solution 300 μl, RNAse 1.5 μl를 넣고 반응시켰다. 그 후 protein precipitation solution 100 μl를 넣어 1분 동안 13,200 rpm으로 원심 분리하여, DNA를 포함하고 있는 상층액만을 채취하였다. 상층액에 isopropanol 300 μl와 섞어 원심 분리한 후 70% Ethanol 300 μl로 washing하였고 1분 동안 13,200 rpm으로 원심 분리하여 DNA를 침전시킨다. 침전된 DNA는 실온에서 20분간 건조하고, Hydration solution 100 μl에 녹여 사용하였다. 이 과정은 DNA Purification kit(GENTRA, Minneapolis, MN55447 USA)사용하여 이루어졌다.

PCR Technique
   중합효소연쇄반응을 통해 Cytochrome P450 1B1 Arg48Gly, Val432Leu, glutathione S-transferase P1 Ile105 Val, ERCC1 Asn118Asn, p53 11827(nt), Arg72Pro의 6가지 SNP에 대해 분석하였다. 0.5 ul buffer solution, MgCl2 106 ul, dNTP 0.125 ul, primer 0.025 ul, AmpliTaq Gold 0.025 ul, dH2O 3.7 ul가 포함된 용액에 DNA 10ng을 넣어 Primus multiblock PCR-MWG(95℃-10 minutes, 95℃-30 seconds, Tm℃ 1 minute, 72℃ 1 minute：35 cycles, 72℃-7 minutes)에 따라 연쇄 반응을 시행하였다(Table 2).
   이렇게 얻어진 산물 4 ul를 shrimp alkaline phosphatase(1 unit/ul) 2 ul, exonuclease I(10 unit/ul, Amersham Pharmacia, USA) 0.2 ul와 함께 섞어 deionized water를 넣어 37℃에서 1시간, 72℃에서 15분을 반응시켜 정제하였다. 정제 과정을 거친 산물은 one base extension을 위한 중합효소연쇄반응을 거쳤다. 이때, dideoxynucleotieds(terminator)는 A, C, G, T 각각에 대하여 dR6G(green), dTAMRA(black), dR110(blue), dROX(red)의 dye label을 시행하였다. 이를 SNaPshot Ready Reaction Premix 5 ul, primer(0.15 pmol/ul) 1ul, template(0.15 pmol/ul) 1 ul, deionized water 3 ul와 함께 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 30초 동안 반응시키는 과정을 25회 반복하였다. 이때 terminater가 DNA 나선에 끼어 들어가면 더 이상 반응이 진행되지 않는 원리를 이용하였다(SNaPshot Reaction).
   이후 반응하고 남은 oligonucleotide를 제거한 후 얻어진 산물을 1% agarose gel에 올려 ETBR 염색하여 GelDoc(Bio-Rad) system으로 band의 유무를 확인하였다(Fig. 1).

통계학적 분석
   CYP1B1 Arg48Gly, Val432Leu, GST P1 Ile105Val, ERCC1 Asn118Asn, p53 11827(nt), Arg72Pro 단일염기다형성에서 정상 대조군의 대립유전자 빈도는 Hardy-Weinberg 평형(equation)에 합당하였다. 환자 및 대조군에서 염기의 치환이 없는 경우, 1개의 대립 유전자에서 염기가 치환된 경우, 2개의 대립 유전자에서 염기가 치환된 경우의 세 가지 집단으로 나누어 dosage-effect와 dominant-recessive mechanism에 대한 분석 및 각각의 핵산을 독립 변수로 한 분석을 시행하였고 logistic regression 모델을 사용하였다. 이때 p-value가 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 차이가 있다고 하였으며, 95% 신뢰 구간을 구하였다. 또한 6가지 단일염기다형성에 대해 흡연량(pack year), 음주력 및 연령을 변수로 한 다변수 분석(multivariate analysis)을 시행하였다.

결     과

후두 및 하인두 편평상피암종 발생과 단일염기다형성
   CYP1B1 Arg48Gly, Val432Leu 2가지의 다형성에서 wild type은 cytosine이며 단일 대립유전자의 SNP로 cytosine이 guanine으로 치환된 경우는 환자군에서 25.9%, 17.8%이었고 대조군에서 30.9%, 17.9%로 양군 간에 통계적으로 의미 있는 차이가 없었으며 2개의 대립유전자에서 모두 guanine으로 치환된 48Gly와 432Leu homozygote의 빈도는 환자군에서 5.2%, 0.7%이었고 대조군에서 9%, 0.8%로 양군 간에 통계학적으로 의미 있는 차이는 없었다.
   GST P1 Ile105Val 다형성에서 wild type은 adenine이며 단일 대립유전자의 SNP로 adenine이 thymine으로 치환된 경우는 환자군에서 34.8%, 대조군에서 32.5%이었고 2개의 대립유전자에서 치환이 일어난 105Val homozygote의 빈도는 3%와 3.3%로 양군 간에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다.
   ERCC1 Asn118Asn 다형성에서 wild type은 cytosine이며 단일 대립유전자의 SNP로 cytosine이 thymine으로 치환된 경우는 환자군에서 40.7%, 대조군에서 40.7%이었고 2개의 대립유전자에서 모두 thymine으로 치환된 118Asn homozygote의 빈도는 4.5%와 4%로 양군 간에 통계학적으로 의미있는 차이는 없었다.
   p53 11827(nt), Arg72Pro 2가지의 다형성에서 wild type은 guanine이며 단일 대립유전자의 SNP로 guanine이 cytosine으로 치환된 경우는 환자군에서 모두 53.3%이었고 대조군에서 모두 48%로 양군 간에 차이가 없었으며 2개의 대립유전자에서 모두 cytosine으로 치환된 homozygote의 빈도는 환자군에서 9.7%, 9.7%였고 대조군에서 14.6%, 13.8%로 양군 간에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(Table 3).
   또한 6가지 단일염기다형성에서 각각의 염기에 대한 dominant-recessive mechanism에 대한 분석과(Table 4 and 5), 각각의 염기를 독립 변수로 한 분석을 시행하였으며(Table 6) 환자군과 대조군 간에 통계학적으로 의미있는 차이는 없었다.

흡연량, 음주력 및 연령과 단일염기다형성
   CYP1B1 Arg48Gly, Val432Leu, GST P1 Ile105Val, ERCC1 Asn118Asn, p53 11827(nt), Arg72Pro의 6가지 단일염기다형성에 대해서 흡연량(pack year), 음주력 및 연령을 변수로 한 다변수 분석을 시행하였으며 환자군과 대조군 간에 의미 있는 차이는 나타나지 않았다.

고     찰

   두경부 악성종양은 장기간의 흡연 및 음주와 연관되어 발생하는 것으로 알려져 있으며 보고에 따라 모든 악성종양의 5~35%를 차지하고 있다.⁹⁾ 두경부 악성종양의 발병 위험의 환경적 요인에 대한 연구는 광범위하게 이루어졌으나 숙주 및 유전적 요인이 두경부 영역의 발암에 미치는 영향은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 흡연자에서 구강내 종양이나 후두종양의 위험성이 높으며 담배에 노출된 시간, 즉 하루에 얼마를 피웠는지, 얼마나 오랫동안 피웠는지가 중요하다. 하루에 40개피 이상 피운 흡연자는 비흡연자에 비해서 통상 24배, 후두암은 32배, 구강암은 12배정도 발병률이 높다고 한다. 심한 음주자에서도 구강, 인두, 후두, 식도에서의 암 발생률이 높다는 근거가 많이 발표되고 있다. 술과 담배는 서로 상승작용을 하여 상부식도나 상기도암의 75%에서 연관 인자로 작용한다고 한다.¹⁰⁾ 그러나 두경부 악성종양의 발생이 지역적으로 큰 차이를 보이며 흡연 및 음주량과도 반드시 일치하지 않는다. 따라서 추가적인 요인으로 유전적 요인의 역할을 고려할수 있겠으며 두경부 영역 이외의 다양한 장기에서 발암의 위험도를 증가시키는 것으로 알려져 있는 단일염기다형성에 대한 관심이 높아지고 있다.
   Cytochrome P450의 동종효소인 CYP1B1은 염색체 2p21에 위치하며 3 exon과 2 intron을 갖는 약 10 kb DNA로 구성되어 있다. CYP1B1은 polycyclic aromatic hydrocarbons(PAH), arylamine, nitroaromatics등의 다양한 발암 물질을 활성화하는 phase I 효소이며 특히 흡연과 관련된 PAH 대사는 두경부 영역에서 국소적인 악성종양 발생에서 중요한 역할을 하고 있다. CYP1B1은 흡연 중 발생하는 PAH의 dihydrodiol을 환원시킨 후 강력한 발암 인자인 dihydrolepoxide로 산화시키는 작용을 한다.¹¹⁾ 따라서 CYP1B1에서 발생하는 유전적 다형성은 악성종양의 발생에 영향을 미치게 된다. Position 48에서의 Arg의 Gly으로의 변화(CYP1B1-R48G), position 432에서의 Val의 Leu로의 변화(CYP1B1-V432L) 등에 대한 연구가 시행되었고, 이 중 CYP1B1-V432L은 효소의 환원력에 큰 영향을 미쳐 두경부 악성종양 및 대장암에 대한 감수성(susceptibility)을 변화시키는 것이 알려졌다.¹²⁾¹³⁾ 또한 유방암 환자에서 CYP1B1의 변화가 스테로이드 호르몬 수용체의 증가와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾ 한국인 두경부 편평상피암종 환자에서 시행된 Cytochrome P450의 다른 동종효소인 CYP1A1의 Msp I 제한효소 인식부위 유무와 관련된 유전적 다형성에 대한 연구가 이루어졌으며, 대립유전자 둘 모두에서 인식부위가 없는 경우에 비해 대립유전자 하나만 인식부위가 없는 경우 두경부암의 상대적 위험도가 1.39배, 둘 모두 있는 경우의 그것은 1.63배인 것으로 보고 되었으며, CYP1A1 exon 7의 유전적 다형성에서는 두경부 편평상피암종 환자군에서 두개의 대립유전자가 valine으로 치환된 유형의 빈도가 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 높았다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 또한 CYP1A1, CYP2E1 및 NAT2 효소 유형의 조합에서 Val/Val과 C1/C2, C2/C2와 fast acetylator, Val/Val과 fast acetylator 유형의 조합이 한국인의 두경부암 발생에 있어 유전적 감수성이 높다고 보고되었다.¹⁷⁾ 본 연구에서 CYP1B1-R48G 다형성은 cytosine과 guanine 각각의 염기를 대상으로 한 환자 및 대조군 비교(Table 6)에서 p-value 0.0836으로 통계적으로 유의하진 않지만 guanine이 종양발생에 대항하는 protective type으로, cytosine은 종양발생을 조장할 수 있는 cancer-prone type으로 생각해 볼 수 있었다.
   대부분의 PAH는 CYP와 같은 phase I 효소에 의해 활성화되고 phase II 효소에 의해 해독화(detoxification)되는 과정을 거치는데, 가장 대표적인 phase II 효소가 glutathione S-transferase이다. 이는 glutathione과 PAH 대사산물 등의 발암 물질간의 공유 결합을 유도하여 그 독성을 제거한다. 인간에서 GST효소는 Alpha(GSTA), Mu(GSTM), Pi(GSTP), Theta(GSTT), Zeta(GSTZ)의 5가지 종류로 나누어지며 그중 GSTP는 동물 실험을 통해 간의 전암성 병변 및 종양의 표지자로 알려진 이후 많은 연구가 진행되어 대장, 위, 방광, 자궁 경부, 식도, 폐 등에서 과발현되는 것이 밝혀졌다.¹⁸⁾ 한국인의 GSTM1 대립인자 결손에 관한 연구에서 두경부 암 환자에서 53.3%에서 결손이 있어 통계적 유의성은 없으나 대조군보다 높게 나타났으며 결손되지 않은 군에 비해 1.33배의 상대적 위험도를 보였다.¹⁵⁾ Ali-Osman 등¹⁹⁾에 의하면 GSTP1 유전자의 313번 nucleotide에서의 변화가 발암물질의 해독 능력을 감소시키는 것으로 보고하였다. 또한 최근의 연구에 따르면 인두에서 발생하는 두경부 악성종양은 GSTP1-I105V의 homozygote에서 증가하는 것으로 알려져 있다.²⁰⁾
   DNA 손상을 복구하는 기전은 적어도 크게 4가지로 나눌 수 있다. 첫 번째는 base-specific DNA glycosylase를 이용하여 산화 또는 환원된 몇 개의 염기만을 복구하는 기전(base-excision repair)이 있고, 둘째로는 광자나 화학물질 같은 유발 물질에 의해 수십 개의 핵산에 걸쳐 발생하는 이복합체 등을 제거 및 복구하는 기전(nucleotide-excision repair)이 있으며, 세 번째는 내인성 복제 장애나 방사선 조사 등에 의해 DNA 이중 나선 구조의 손상이 있을 때 작용하는 기전(double-strand-break repair)이고, 마지막으로 DNA polymerase 장애로 발생하는 염기간의 복제 손상을 복구하는 기전(mismatch repair)이 있다.²¹⁾ 이중 핵산 절제(nucleotide-excision repair)를 통해 유전적 손상의 복구에 관여하는 ERCC1 단백질은 xeroderma pigmentosum complementation group F(XPF)와 복합체를 형성하여 손상된 단일 나선 유전자를 절제한다. ERCC1에 발생하는 유전적 다형성은 유전자 손상에 대한 복구 기전에 대한 이해가 깊어지면서 많은 종양의 발암 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.²²⁾ ERCC1 position 118의 유전적 다형성에 대한 연구는 흑색종(melanoma), 신경교종(glioma), 핍지교종(oligodendroglioma) 등에서 시행 되었고, 두경부 영역에서 흡연에 의한 발암 물질에 의한 DNA 손상은 ERCC1 등이 관여하는 핵산 절제(nucleotide-excision repair)를 통해 복구되는데 ERCC1의 유전적 다형성은 악성종양의 발생에 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다.²³⁾
   두경부 악성종양에서 흔히 발견되는 유전적 변화중 하나인 p53 경로의 붕괴는 돌연변이, 이종성의 소실, 바이러스 단백과의 상호 작용 등을 초래한다. 염색체 17p13에 위치하는 p53은 정상적으로 세포나 유전자에 손상이 발생하는 경우 세포 주기가 G1 이후에 멈추도록 하는 기능이 있어 손상의 복구가 불가능할 경우 손상된 세표가 자연사하도록 유도하는 종양억제유전자이다.⁸⁾ 발암 과정 초기에 나타나는 이런 정상 기능의 소실은 잠재적 돌연변이의 증가시키며 흡연, 음주 및 인간 유두종 바이러스 등과 관계있는 것으로 밝혀졌다. p53 유전자의 돌연변이는 모든 악성종양의 50% 이상, 두경부 악성종양의 30~60%에서 발견된다고 알려져 있고, 흡연자에서 비흡연자에 비해 두 배의 빈도로 나타나며, 음주력이 있는 경우 3.5배 이상 높이 나타난다. 특히 p53 유전자 exon 4의 codon 72에서 발생하는 단일염기다형성으로 Arg이 Pro으로 치환된 경우 구강암 발생의 위험도를 증가시키는 것으로 알려져 있다.²⁴⁾
   본 연구에서 후두 및 하인두 편평상피암종 환자 135명과 악성종양의 병력이 없는 대조군 123명을 대상으로 흡연 및 음주와 관련되어 단일염기다형성을 통해 발암의 위험도를 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 6가지의 유전적 다형성을 비교하였으나 통계학적으로 의미있는 차이는 나타나지 않았다. 그러나 본 연구는 비교적 적은 수의 환자 및 대조군을 대상으로 이루어져 통계학적으로 신뢰구간이 넓으며 또한 다변수 분석(multivariate analysis)을 충분히 시행할 수 없었음을 고려해야 한다. 보다 많은 수의 환자를 대상으로 한 지속적인 연구가 필요하며 나이, 연령, 성별 등의 변수를 고려한 상태에서 음주 및 흡연 등의 환경적 요인과 유전적 다형성간의 다양한 분석이 요구된다. 또한 단일염기다형성 뿐 아니라 haplotype을 통한 유전적 요소의 연구가 필요하다.

결     론

   흡연 및 음주와 관련되어 단일염기다형성을 통해 발암의 위험도를 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 Cytochrome P450 1B1 Arg48Gly, Val432Leu, glutathione S-transferase P1 Ile105Val, ERCC1 Asn118Asn, p53 11827(nt), Arg72Pro의 6가지 유전적 다형성에 있어서 후두 및 하인두 편평상피암종 환자군과 대조군사이에 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 그러나 본 연구는 비교적 적은 수의 환자 및 대조군을 대상으로 하여 다변수 분석(multivariate analysis)이 충분히 이루어지지 않아 추후 많은 수의 환자 및 대조군을 대상으로 한 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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