교신저자：왕수건, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(051) 240-7671 · 전송：(051) 246-8668 · E-mail：voicelee@yahoo.co.kr

서     론

   연골은 혈관이나 신경 조직이 없는 독특한 조직으로 손상을 받았을 때 재생이 잘 일어나지 않는다.¹⁾ 이러한 연골 손상에 대한 조직 공학(tissue engineering)적 치료가 활발하게 시도되고 있는데 일반적으로 환자의 자가 연골에서 연골세포를 획득, 배양한 후 3차원 담체(scaffold)와 결합시킨 뒤 주사 또는 이식하는 것이 주된 방법으로 이개연골, 기관연골, 관절연골의 결손에 이용된다.²⁾³⁾ 하지만 자가연골을 획득하기 위해서는 주변의 정상 연골에 침습적인 시술을 가하여 영구적인 결손을 남기게 되며 획득되는 양이 적은 문제점으로 인해 임상적용에 많은 어려움이 있는 실정이다.¹⁾⁴⁾
   따라서 정상 연골조직에 손상 없이 연골세포를 획득하기 위한 방법이 필요한데 최근에 조직공학에 도입되고 있는 다혈통 줄기 세포(multilineage stem cells)들이 그 대안이 될 수 있다.⁵⁾ 골수는 중배엽 기원으로서 기질내에 다혈통 줄기 세포의 일종인 중간엽 줄기 세포(mesencymal stem cells)를 함유하고 있는데 이는 지방세포, 연골세포, 근육모세포, 골모세포 등으로 분화가 가능한 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 하지만 골수에서 이를 획득하기 위한 시술이 고통스럽고 전신 또는 척추마취가 필요하며 획득할 수 있는 중배엽 줄기세포의 양이 적다는 문제가 있다.
   Zuk 등⁵⁾은 지방조직에서 지방세포, 연골세포, 근육세포, 골세포로 분화가 가능한 다혈통 줄기세포를 분리하였고, 지방조직이 골수를 대체할 수 있는 근원이 될 수 있다고 보고하였다. 이에 저자들은 동물실험에서 획득한 지방조직 내에 다혈통 줄기세포군(multipotent stem cell population) 존재 유무를 확인하고 이를 이용하여 연골로 분화가 가능한지를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

개의 지방조직 획득 및 줄기세포 분리
   10 kg 가량의 성견을 ketamin으로 마취한 뒤 서혜부에 절개를 가한 후 50 g 가량의 지방조직을 획득하였다. 기질세포를 분리하기 위해 phosphate-buffered saline(PBS)로 세척하여 잘게 자른 후 자른 지방조직과 동량의 0.075% collagenase(type Ⅰ；Sigma, St. Louis, MO)를 37℃, 5% CO₂ 환경에서 30분간 처리하였다. 처리된 지방조직은 10 ml pipette으로 여러 번 섞어준 후 1200×g 속도로 10분간 원심분리하여 부유물은 버리고 가라앉은 세포를 획득하였다. 다시 이를 PBS로 두 번 세척한 뒤 100 μm nylon mesh에 걸려서 부유물을 제거하고 배지(α-MEM, 20% fetal bovine serum, 1% Penicillin G/streptomycin solution)에 접종하여 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배양하고 다시 PBS로 세척하여 남아있는 적혈구 세포를 제거하였다. 이러한 과정으로 획득한 adipose tissue stem cells (ATSC)은 동일한 배지에서 동일한 조건으로 10⁶ cells/cm²가 될 때까지 배양하였다. 실험에 이용된 성견은 3마리였다. 

ATSC의 기원 확인을 위한 표면 표시자(surface marker) 확인
   배양된 ATSC 세포를 PBS로 세척하여 4℃에서 5분간 원심분리 후 수확하였다. 수확된 세포는 4% paraformaldehyde로 실온에서 10분간 고정한 후 0.1% Triton X-100/ PBS로 세척하였다. 세포는 poly-L-lysine으로 coating된 slide에 실온에서 1시간동안 incubation하여 slide에 부착하였다. 세포는 비 특이적인 반응을 제거하기 위해 PBS, 1% BSA, 11% serum로 구성된 blocking buffer로 30분간 incubation하였다. 세포는 blocking buffer에 적정량(1 ug/ml) 희석된 fluorescein이 부착된 anti-CD29, CD44, AC133, CD34, CD14의 단클론항체(BD Biosciences, San Jose, CA)를 처리하여 1시간동안 실온에서 반응시킨 후 0.3% BSA가 포함된 PBS로 3번 세척하였다. 세포는 mounting된 후 형광현미경하에서 100배율로 관찰하였다.

ATSCs의 분화 유도 및 확인
   micromass culture technique을 이용하여 ATSCs의 연골세포로의 분화를 유도하였다.⁷⁾ 즉 배양한 ATSC를 0.05% trysine으로 2분간 처리하여 세포를 뗀 후 4℃에서 5분간 원심분리 하여 세포를 획득하였다. 이렇게 획득한 세포를 10 μl 당 3×10⁵ cells이 되게 한 후 12 well culture dish에 떨어뜨려 37℃에서 2시간 동안 흡착시켜 micromass형태로 만든 다음, chondrogenic medium⁴⁾(α-MEM, 10 ng/mL TGF-β1, 10^-7 M dexamethasone, 50 μg/ml ascorbate-2-phosphate)을 처리하여 2주 동안 배양하였다.
   연골세포로의 분화는 연골에 특이적인 collagen type Ⅱ의 발현 및 toluidine blue staining으로 확인하였다. collagen type Ⅱ의 발현을 확인하기 위한 과정을 간략히 서술하면 배양된 micromass를 10 μm로 박절하여 실온에서 15분간 4% paraformaldehyde를 이용하여 slide에 고정하였다. 다시 PBS로 세척한 후 3% hydrogen peroxide을 10분간 처리하여 endogenous peroxidase의 작용을 억제하였다. PBS로 세척한 후 blocking buffer(PBS, 10% horse serum)를 3시간 동안 처리 후 human collagen type Ⅱ (ICN Biomedical, CostaMesa, CA)의 항체가 포함된 PBS buffer를 1시간 동안 다시 처리하였다. 다시 PBS buffer로 세척한 후 VectaStain ABC kit(Vector Labs Inc., Burlingame, CA)를 이용하여 collagen type II의 발현을 확인하였다. Toluidine blue 염색은 0.05% aqueous toluidine blue를 몇 방울 검체에 떨어뜨려 2~4분 정도 염색시킨 후 증류수로 씻어낸 후 현미경으로 염색 여부를 확인하였다.

결     과

ATSC 분리
   개의 지방조직으로부터 중배엽 줄기 세포를 획득하여 이를 배양할 수 있었다. 세포는 in vitro에서 쉽게 확장되었으며 섬유모세포와 유사한 형태를 보였다(Fig. 1).

ATSC의 기원 확인을 위한 표면 표시자 확인
   분화가 이루어지지 않은 상태에서 CD29, CD44, CD34, CD14, AC133에 대한 항체 이용한 면역조직화학염색을 시행하여 ATSC의 표면 표시자 발현을 알아보았다. 이 세포들에서 중배엽 줄기 세포의 표지자인 CD29와 CD44에는 양성 반응을 보였으나, 조혈모세포의 표지자인 CD34, CD14, AC133에는 음성 반응을 보였다(Fig. 2).

ATSCs 분화유도 및 확인
   연골세포로의 분화를 micromass culture technique으로 in vitro에서 시도한 결과 세포가 응축된 micromass를 획득할 수 있었다(Fig. 3). micromass 상태에서 type Ⅱ collagen에 대한 immunostain과 toluidine blue stain에 양성반응을 보였다(Figs. 4 and 5).

고     찰

   연골은 연골 세포와 연골 세포에 의해 합성되는 세포외 기질(extracellular matrix)로 이루어져 있다. 이러한 세포외 기질은 연골의 종류에 따라서 약간의 차이가 있으나 2형 교원질(type Ⅱ colagen), 섬유, 탄성 섬유(elastic fiber), proteoglycan 그리고 hyaluronic acid, chondroitin sulfate, keratan sulfate와 같은 glycosaminoglycan(GCG)으로 이루어져 있다. 세포에 비해 세포외 기질이 풍부하며 구조적 기능을 수행하는 초자 연골은 늑골, 기관지, 관절 등에 존재한다. 형태적 기능을 수행하는 탄성 연골(elastic cartilage)은 귀와 외이도 등에서 존재하며 탄성을 부여하는 탄성 섬유가 세포외 기질에 다량 분포하고 있으며 초자 연골에 비해 세포외 기질이 적은 것으로 알려져 있다. 그 외 1형 교원질(type 1 collagen)을 다량 발현하는 섬유 연골(fibrous cartilage)은 추간판이나 관절반월의 일부에서 볼 수 있다.⁸⁾ 
   연골은 손상을 받았을 때 재생이 잘 일어나지 않으므로 연골 결손 치료에는 많은 어려움이 있다. 현재까지 동종 혹은 자가 연골 이식이 가장 이상적인 것으로 알려져 있으나 공여부가 제한되어 있고 원하는 모양대로 다듬어 이식하기가 힘들며 공여부의 연골이 수혜부의 연골의 종류와 다를 수 있다는 단점이 있다.¹⁾⁹⁾ 이러한 제한점을 극복하기 위한 노력으로 조직 공학을 이용한 연골의 형성에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 주로 3차원 고분자 담체에 배양된 자가 세포를 이식하여 원하는 조직을 형성시키는 방법으로, 동물실험에서 초자 연골(hyaline cartilage)을 이용한 연골 재생이 성공적으로 이루어졌다.¹⁰⁾ 하지만 실제 임상에 적용하기에는 이용할 수 있는 연골은 제한적이고 충분한 양의 연골세포를 획득할 수 없다는 문제가 있다.¹¹⁾ 따라서 연골세포의 새로운 근원이 필요한데 이런 면에서 여러 가지 세포로 분화가 가능한 다형질 줄기 세포(multilineage stem cells)가 최근 주목을 받고 있다.
   임상적으로 적용이 가능한 다형질 줄기세포에는 2가지 종류가 있는데 즉 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)와 자가줄기세포(autologous stem cells)이다. 이 중 ESCs는 세포 조절(cell regulation)의 어려움과 윤리적인 문제로 인해 사용에 제한이 있는 반면 자가줄기세포는 면역학적 거부반응과 윤리적 문제가 없다.
   중배엽기원의 조직에 대한 조직공학을 위해서는 골수에서 획득한 자가줄기세포가 유용하다. 골수는 발생시 중배엽에서 유래한 것으로 그 기질은 구성면에서 동질성을 가지고 있으며 몇 가지 세포군을 가지고 있는데 그 중 하나가 중배엽줄기세포(MSCs)이다. MSC는 지방세포(adipocyte), 연골세포(chondrocyte), 근모세포(myoblast), 골모세포(osteoblasts) 등으로 분화하는 것으로 알려져 있다.^5)6)12) 하지만 골수에서 이를 획득하기 위한 시술은 고통스럽고 전신 또는 척추마취가 필요하다. 또한 획득되는 중배엽줄기세포의 양이 혈구세포(hematopoietic cell)의 1/10⁵ 정도로 적어 임상적으로 충분한 양이 되도록 배양하는 과정이 필요한데 그 과정이 많은 시간과 비용이 소모되며 감염과 세포 손실의 위험성이 높다.¹³⁾
   자가줄기세포의 새로운 source로 지방조직이 최근 연구되고 있다. 지방조직은 골수처럼 중배엽 기원이며 이형성 줄기세포군(heterogenous stromal cell population)을 함유하고 있다. 이전의 연구에서 Zuk 등⁵⁾은 인간의 지방조직에서 골이나 연골조직으로 분화 가능한 줄기세포를 분리하였으며, 국내에서도 Jeong 등¹⁴⁾이 인체지방 조직에서 연골세포로 분화될 수 있다고 보고하였다.
   두경부 영역에서 연골에 대한 조직공학 연구는 기관이나 후두에 관심이 있다. 기관이나 후두에 대한 연골 조직공학 연구는 nude mice에서 실험하기가 곤란하며, 인체에 적용하기 전에 인간의 기관과 후두구조가 비슷한 개에서 하는 것이 좋을 것으로 생각하였다. 그리하여 저자들은 개의 지방세포에서 유래한 ATSC에서 연골로 분화되는지를 알고자 하였다.
   본 연구에서 저자들은 개의 지방세포에서 다형질 중배엽 줄기세포를 분리할 수 있었으며 이는 중배엽 기원의 표시자인 CD24, CD44에 양성을 보였고 조혈모세포의 표시자인 CD34, CD14, AC133에는 음성소견을 보여 지방조직에 있는 혈액에서 유래했을 가능성을 배제할 수 있었다.
   미분화된 중배엽줄기세포를 연골세포를 분화시키는 데는 여러 배양조건과 다양한 chondrogenesis promoting factors가 시도되었는데 bone morphogenetic protein(BMP), insulin-like growth factor-1(IGF-1), transforming growth factor-β(TGF-β), fibroblast growth factor(FGF) 등이 대표적인 promoting factor이다.¹⁵⁾ 본 연구에서는 지방에서 유래한 중배엽줄기세포를 연골로 분화시키기 위해 TGF-β1을 사용하였다. 여러 promoting factor의 영향에 대하여는 추가적인 연구가 필요할 것이다.
   본 연구에서 연골 분화를 확인하기 위한 특수 염색으로 collagen type Ⅱ, toluidine blue stain을 사용하였다. 지방에서 유래한 중배엽 줄기세포에서 분화된 조직에서 collagen type Ⅱ, toluidine blue stain에서 양성 소견을 보여 연골로 분화된 것을 알 수 있었다. Collagen type Ⅱ의 발현은 세포간 기질에 연골 세포에 특이적 기질인 proteoglycan 성분이 존재한다는 것을 의미한다. 이는 지방에서 분화된 연골세포가 연골세포와 형태학적으로는 차이가 있으나 동일한 기질을 만든다는 것을 알 수 있다.
   이러한 연골을 이용한 조직공학은 이비인후과, 정형외과, 비뇨기과 등에서 주된 관심분야이며 이비인후과 영역중 소이증(microtia), 비중격 결손, 비성형, 기관재건술 등에 적용될 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서 저자들은 개의 지방조직 내에서 중배엽 기원의 줄기 세포를 획득할 수 있었으며 이를 분화시켜 cartilage matrix molecules를 분비하는 세포들을 획득할 수 있었다. 따라서 지방조직이 조직 공학에 이용되는 중배엽 줄기 세포의 새로운 source로 이용될 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 조직공학의 연구는 연골이 손상된 많은 질환에 도움이 될 것으로 생각된다.

1. Shin DP, Ha EH, Park JW, Kim SY, Kim DW, Suh IS, et al. Tissue engineered cartilage formation using human hyaline chondrocytes and elastic chondrocytes. J Korean Soc Plast Reconstr Surg 2001;28:233-40.

2. Megerian CA, Weitzner BD, Dore B, Bonassar LJ. Minimally invasive technique of auricular cartilage harvest for tissue engineering. Tissue Eng 2000;6:69-74.

3. Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, Upton J, Vacanti CA. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg 1997;100:297-304.

4. Erickson GR, Gimble JM, Franklin DM, Rice HE, Awad H, Guilac F. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2002;290:763-9.

5. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cellbased therapies. Tissue Eng 2001;7:211-28.

6. Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1991;9:641-50.

7. Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS. Formation of cartilage-like spheroids by micromass cultures of murine C3H10T1/2 cells upon treatment with transforming growth factor-β1. Defferentiation 1995;59:25-34.

8. Cardenas-Camarena L, Gomez RB, Guerrero MT, Solis M, Guerrerosantos J. Cartilaginous behavior in nasal surgery: Comparative observational study. Ann Plast Surg 1998;40:34-8.

9. Rodriguez A, Cao YL, Ibarra C, Pap S, Vacanti M, Eavey RD, et al. Characteristics of cartilage engineered from human pediatric auricular cartilage. Plast Reconstr Surg 1999;103:1111-9.

10. Freed LE, Marquis JC, Nohria A, Emmanual J, Mikos AG, Langer R. Neocartilage formation in vitro and in vivo using cells cultured on synthetic biodegradable polymers. J Biomed Mater Res 1993;27:11-23.

11. Park DJ, Paik SI, Bong JP, Park SY, Yu GW, Lee JG. Expansion and new creation of human septal cartilage from biopsied fragment: Using in vivo 3D culture of chondrocyte. Korean J Otolaryngol Head Neck Surg 1997;40:1274-9.

12. Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res 1998;238:265-72.

13. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Musca JD, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-7.

14. Jeong JH. Chondrogenic differentiation of human adipo-derived precursor cell. J Korean Soc Plast Reconstr Surg 2000;27:136-42.

15. Kawamura M, Urist MR. Growth factors, mitogens, cytokines, and bone morphogenetic protein in induced chondrogenesis in tissue culture. Dev Biol 1988;130:435-42.