교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   사람의 기도는 점액으로 덮여져 있고 기도에서 생산되는 점액의 양은 그 생산율과 제거율(흡수, 증발, 섬모에 의한 이동)에 의해서 균형을 이루게 되며, 많은 임상적인 문제들은 이 균형이 깨어져 발생한다.¹⁾ 기도 보호에 중요한 기도상피의 분비 조절기전은 아직까지 충분히 알려져 있지 않으나, 여러 가지 자극과 억제효과를 가진 매개체에 의해 조절된다. 이러한 매개체 중 펩타이드가 기도 점액의 분비에 관여한다²⁾는 것은 알려져 있으나, 펩타이드 점액유전자와의 관계나 혹은 그 조절 기전은 명확하지 않다.
   최근 연구에 의하면 펩타이드 중 하나인 vasoactive intestinal peptide(VIP)는 점액분비에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다.³⁾ VIP는 높은 수준의 sequence homology를 가진 펩타이드로 여러 조직에서 분비되어 기도로 이동하며, 일부는 기도에 직접 분포하여 점액분비에 영향을 준다.⁴⁾ 그러나 이와 같이 VIP가 점액의 분비에는 관여한다는 보고는 있으나, VIP가 점액유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는가 하는 연구는 미미한 실정이다.
   한편 지금까지 알려진 점액유전자 중, 중요한 호흡기 점액유전자는 MUC2, 4, 5AC, 5B, 6, 7과 8 등이다.^{1)5)6)7)8)9)10)} 특히 MUC2, 5AC, 5B, 6 유전자는 모두 염색체 11p15.5에 존재하며 gel forming 점액유전자로 기도 상피의 보호와 윤활작용에 필수적인 점액을 생산한다.¹¹⁾ MUC2는 인간의 장과 기도에 주로 존재하고 만성기관지염이나 섬유성낭종에서 증가하는 것으로 밝혀져 있으며, MUC5AC와 MUC5B는 인간 기도에서 분비되는 점액의 대부분을 구성하고 있다.⁶⁾⁷⁾
   이에 저자는 기도점액 분비에 중요한 역할을 한다고 알려진 VIP가 기도상피에서 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액생성에 어떠한 영향을 끼치며 또 그 기전과 또한 VIP가 점액유전자와 점액을 상향 조절한다면 스테로이드가 어떠한 역할을 하는지를 알고자 하였다.

재료 및 방법

세포배양 및 실험 디자인
   사람 호흡기 상피세포인 human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line(NCI-H292 cells, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 6개의 실험판에 1×10⁶ 세포의 농도로 배양하고, 95%의 공기와 5%의 이산화탄소가 가습화된 대기에서 37℃의 온도로 RPMI 1640 배지(10% fetal calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 추가)에 배양하였다.
   배양이 어느 정도 이루어지면 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고, phosphate buffered saline(PBS)에 헹구어낸 후 VIP(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 각각 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6 M 농도로 6시간 동안 처리하였다. 또 전사억제제인 actinomycin D와 후전사억제제인 cycloheximide를 1시간 동안 전처치한 후 VIP를 10^-9 M 농도로 6시간 동안 처리하였다. 몇 개의 배양세포에 VIP를 투여하기 전에 1시간 동안 budesonide(Sigma Chemical Co.)와 glucocorticoid receptor antagonist 인 RU-486(Sigma Chemical Co.)을 전처치하였다.
   점액유전자의 분석을 위하여 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 전체 세포의 RNA를 추출하였다. 시료를 처리한 NCI-H292세포에서 점액의 분비양상을 분석하기 위해 lysis buffer(50 mM Tris·HCl, pH 7.5, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하였다. 대조세포군은 처치를 하지 않았고, VIP는 증류수에, budesonide는 에탄올에 용해하였다. 에탄올과 다른 용매의 최종농도는 0.1% 이하로 유지하였다.

MUC2/5AC 점액유전자의 RT-PCR 분석
   MUC2와 MUC5AC mRNA의 측정은 변형된 RT-PCR 방법을 이용하였다.¹²⁾¹³⁾ 요약하면, 전체 RNA는 무작위 hexanucleotide primer와 MMLV 역전사효소(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. MUC2와 MUC5AC 점액유전자의 PCR 과정은 초기 가열을 95℃에서 3분간 실시한 후 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분간을 각각 34 cycle과 32 cycle을 실시하고 신전을 72℃에서 20분간 실시하였다. PCR의 산물은 1% Tris-boric acid 완충용매에 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하였다. 띠의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다.
   RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 인체 MUC2와 MUC5AC 점액유전자의 sense와 antisense를 사용하였다. 인체 MUC2 점액유전자의 primer염기서열의 sense는 5'：TGC CTC GCC CTG TCT TTG이며, antisense는 3'：CAG CTC CAG CAT GAG TGC이다. MUC5AC 점액유전자의 sense는 5'：ATC ACC GAA GGC TGC TTC TGT C이며, antisense는 3'：GTT GAT GCT GCA CAC TGT CCA G이다. 점액유전자에 대한 결과치는 여러번의 실험 중 대표적인 결과를 선택하였다.

면역분석법을 이용한 MUC2/5AC 점액의 분석
   점액의 함량을 측정하기 위하여 시료를 처리한 NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·HCl, pH 7.5, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well에 첨가하고 40℃에서 4시간 이상 방치하여 젤판에 단백을 적응하였다. PBS용액으로 세 번 씻어내고, 2% bovine serum albumin으로 1시간 동안 실온에서 차단한 후, PBS용액으로 다시 한 번 씻어냈다. MUC2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 MUC5AC(NeoMarkers Inc., Fremont, CA) 일차항체(1：100)를 첨가하여 1시간 동안 배양시킨 후, 이차항체인 horeseradish peroxidase-goat anti-mouse IgG conjugate(1：10,000)를 첨가하여 1시간 동안 배양시켰다. PBS로 세번 씻은 후 3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색반응을 시켜서 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다. 실험세포군에서 측정된 MUC2/5AC 점액의 양은 VIP를 처리하지 않은 대조세포군에서 검출된 양을 초과하는 만큼의 양을 백분율(% above control)로 나타내었다. 점액에 대한 결과치는 각각 적어도 3회 이상의 실험 결과에 대한 평균값이며 표준편차를 함께 사용하였다.

결     과

VIP에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비
   NCI-H292 세포를 VIP가 10^-10-10^-6 M의 농도로 포함된 배지에서 37℃로 6시간 동안 배양하였다. 10^-10 M의 VIP농도에서 MUC2 점액유전자가 최대로 발현되었으며, 그 농도가 증가함에 따라 MUC2 점액유전자의 발현정도는 감소되는 양상이었다. MUC5AC 점액유전자의 발현정도 역시 같은 양상을 보였다(Fig. 1). MUC2와 MUC5AC 점액의 분비도 점액유전자의 발현과 유사한 양상을 보였다(Fig. 2).

VIP에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현에 있어서 actinomycin D와 cycloheximide의 효과
   VIP에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현이 전사단계에서 조절되는지 아니면 후전사단계에서 조절되는지를 알아보기 위하여 actinomycin D와 cycloheximide를 전처치하였다.
   전사단계 억제제인 actinomycin D 투여 시 VIP자극에 의한 MUC2 및 MUC5AC 점액유전자의 발현은 억제되었으나, 후전사단계 억제제인 cycloheximide 투여 시에는 VIP자극에 의한 두 점액유전자의 발현이 억제되지 않았다(Fig. 3).

VIP에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비에 있어서 budesonide와 RU-486의 효과
   Budesonide를 전처치하였을 경우 VIP에 의한 MUC2와 MUC5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비가 억제되었으며, glucocorticoid receptor antagonist인 RU-486에 의해 이 효과는 복원되었다(Figs. 4 and 5).

고     찰

   신경전달물질 중 VIP, VIP-related peptides(PHI, PACAP, GLP-I, Exendin), substance P, nerokinin A와 nerokinin B 등의 펩타이드들이 기도점막의 점액분비를 조절하는데 중요한 역할을 한다. Wagner 등⁴⁾은 VIP 펩타이드군에 의해 점액분비가 증가되는 것을 관찰했으며, 이 중에 PACAP-27이 가장 강력한 자극 물질이라고 하였다. 한편, tachykinin 펩타이드군의 연구에서는 자극 물질의 농도에 비례하여 점액분비가 증가했으며, 이 중 substance P가 neurokinin A, neurokinin B 보다 더 많은 점액을 분비하였다.¹⁴⁾
   VIP는 점액분비 자체를 증가시킬 뿐만 아니라 콜린성 점액분비를 증폭시킨다.¹⁵⁾ 면역조직화학 연구에 의하면 VIP는 주로 기도와 혈관에 존재하는 뉴런과 신경종말에 분포한다. 이러한 신경들은 점액과 장액선, 평활근 주위 혈관에 주로 존재하며 기도분비에 있어 VIP는 수분과 Cl- 분비를 촉진시키는 반면, 고분자 물질의 분비는 억제한다.¹⁶⁾ 최근에 VIP를 함유하는 peptidergic 신경이 인간의 점막하선의 분비세포와 인접해있다는 것이 알려졌으며, Reid 등¹⁷⁾은 in vitro 연구에서 VIP가 장액 및 점액세포 모두에서 분비를 줄이지만 기도상피에서는 그러한 작용이 없다고 하였다.
   한편 점액분비의 억제에 관여하는 물질로는 스테로이드가 대표적이며 세포질내 glucocorticoid receptor를 통해 유전자의 전사과정을 조절한다.¹⁹⁾ Kim 등¹³⁾의 연구에 의하면 스테로이드가 IL-1β에 의하여 유도된 MUC2 점액유전자 발현과 점액생산을 억제하고 glucocorticoid receptor antagonist인 RU-486에 의해 IL-1β의 작용이 복원된다고 하였다. 또한 Koo 등¹²⁾은 retinoic acid receptor α antagonist가 IL-1β에 유도된 점액을 억제하였다. 이러한 여러 연구들에도 불구하고 점액분비의 자세한 조절 기전은 아직까지 확실하게 알려져 있지 않은 상태이다.
   이번 연구에서 저자들은 NCI-H292 세포에서 MUC2 및 MUC5AC 점액유전자와 점액이 VIP의 농도가 증가함에 따라 발현과 생성이 감소되는 것을 관찰하였다. 전사억제제인 actinomycin D에 의하여 VIP에 의한 점액유전자 발현이 차단되고, 후전사억제제인 cycloheximide는 VIP에 의한 점액유전자의 발현에 영향을 주지 못하였다. 이러한 결과로 보아 VIP에 의해 발현되는 MUC2와 MUC5AC 점액유전자는 전사단계에서 조절되는 것으로 생각된다. 또한 스테로이드인 budesonide가 VIP에 의해 발현되는 MUC2 및 MUC5AC 점액유전자의 발현과 점액의 생성을 억제하는 것을 관찰할 수 있었고, 이는 glucocorticoid receptor antagonist인 RU-486에 의해 복원되었다. 따라서 스테로이드는 점액분비를 억제하는데 유용한 약제로 생각된다.
   VIP의 농도에 비례한 점액 생산의 감소는 Coles 등¹⁹⁾의 결과와 일치하며, 쥐 기도를 대상으로 한 Wagner 등⁴⁾과는 상반되는 결과였다. 이와 같이 본 연구 결과와 Wagner 등⁴⁾의 연구 결과가 서로 상반되는 것은 아마도 종에 따른 점액유전자 및 점액분비 기전의 차이에서 오는 것으로 생각된다. Coles 등¹⁷⁾은 정상적인 기도점막 표본에서 VIP(10 ng-1 μg/ml)가 점액과 lysozyme의 기저치 분비와 metacholine 자극시 분비를 용량 의존적으로 억제한다고 하였다.¹⁹⁾ 이 연구는 단순히 정성적 자가방사선법(quantitative autoradiography)를 이용하여 macromolecule의 분비만을 측정했으나, 본 연구는 VIP에 의한 점액의 분비뿐만 아니라 점액유전자의 발현 양상까지 측정함으로써 VIP의 농도에 따른 점액유전자의 발현과 점액분비의 양상을 관찰할 수 있었고, 또한 스테로이드에 의해서 점액분비에 대한 VIP의 자극이 억제되는 것 역시 확인할 수 있었다.
   여러 병소와 자극물질이 점액유전자의 상향조절을 하는 정확한 기전은 아직까지 알려져 있지 않지만, 아마도 점액유전자 전사율 증가 또는 분해율 감소 때문이라고 생각되어지고 있다.¹⁹⁾ 아직도 어떤 점액 유전자가 점액분비에 중요한 역할을 하는지는 확실하지 않으나 점액분비가 있기 전에 점액유전자가 발현되는 것으로 생각되며 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 그러나 VIP가 어떠한 신호전달체계를 거쳐 점액유전자와 점액을 생성하는지에 대한 연구가 더 지속되어야 할 것으로 생각되며, 정상 호흡기 상피세포 뿐만 아니라 여러 다양한 병적인 상피세포에서도 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

결     론

   호흡기 상피세포에서 VIP에 의한 MUC2 및 MUC5AC 점액유전자의 발현과 점액생성은 전사단계에서 조절되며, VIP에 의한 점액조절은 스테로이드 수용체를 통해 스테로이드에 의해 억제되었다. 한편 VIP 자극에 의해 발현 생성된 MUC2 및 MUC5AC 점액유전자와 점액이 budesonide에 의해 억제되는 것을 관찰하였다. 

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