교신저자：장용주, 138-736 서울 송파구 풍납2동 388-1 울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   바이러스에 의한 급성상기도염은 빈도가 매우 높은 감염성 질환으로 특히 이비인후과 영역에서는 중이염이나 부비동염 등의 합병증을 일으킨다는 점에서 임상적으로 중요하다고 할 수 있다.¹⁾ 바이러스성 상기도염 환자에서 가장 흔히 발견되는 바이러스로 rhinovirus, coronavirus, influenza virus, parainfluenza virus, adenovirus, respiratory syncytial virus 등이 있는데 이 중 rhinovirus에 의한 감염이 50% 이상을 차지한다.²⁾ Rhinovirus 감염은 비강, 비인강점막 상피세포의 접착분자 ICAM-1 수용체와 결합하여 바이러스가 세포 내로 진입하여 이루어진다.³⁾ 감염된 상피세포에서는 IL-6와 IL-8 같은 cytokine이 분비되고 그에 따르는 호중구의 화학주성(chemotaxis) 등을 포함한 일련의 염증반응으로 감기에서 특징적으로 나타나는 증상이 발현된다.⁴⁾⁵⁾ Rhinovirus 감염에서는 IL-6와 IL-8 이외에도 IL-1β, TNF-α, RANTES, MIP, IL-11 등도 분비되며 이러한 여러 cytokine들도 감염시 나타나는 염증반응의 형성에 기여한다.⁶⁾
   Rhinovirus 감염에 의한 병태생리학적 변화를 이해하기 위하여 적절한 연구모델이 필요하다. Rhinovirus는 인체의 비강과 비인강 점막에서만 특이적으로 감염을 일으키므로 집쥐나 생쥐 등의 실험동물을 이용할 수 없는 단점이 있다. 그러므로 rhinovirus 감염 후에 나타나는 병태생리학적 변화에 대한 연구는 지금까지 크게 두 가지 방법으로 행해져 왔다. 하나는 자원자를 모집하여 비강점막에 rhinovirus를 주입하여 감염이 확인된 자원자의 비강세척액이나 점막 생검조직을 채취하여 연구하는 방법이다.⁷⁾⁸⁾ 또 다른 하나는 기관상피세포의 세포주 또는 사체나 생체로부터 얻어진 점막상피세포의 일차배양모델에 rhinovirus 감염을 유도하여 생리적 변화를 관찰하는 것이다.⁹⁾¹⁰⁾ 이러한 기존의 연구방법에는 제한점이 있다. 먼저 자원자에 대한 생체실험은 자원자에게 인위적인 감염을 시켜야 한다는 윤리적인 문제점을 내포하고 있다. 또한 기도점막 상피세포주, 특히 하기도 상피세포주를 이용한 연구는 rhinovirus 감염이 주로 일어나는 상기도의 비강이나 비인강 점막상피세포가 아니라는 점에서 rhinovirus 감염이 일으키는 생리적 변화를 정확히 반영할 수 있을까 하는 의문이 제기된다. 아울러 비강점막이나 기관점막의 일차배양을 이용한 연구에서는 상피세포층만을 배양하여 감염시키므로 상피층과 고유층의 상호작용에 의하여 나타나는 전체적인 점막반응의 양상을 모두 반영하지 못한다는 단점이 있다.
   본 연구에서는 rhinovirus 감염시 나타나는 병태생리를 이해하기 위하여 기존의 연구방법의 한계를 극복한 더욱 바람직한 연구방법을 개발하고자 하였다. 그러한 목적으로 비내수술 시 채취한 비갑개 점막의 상피층과 고유층을 모두 포함한 장기배양(organ culture)이 rhinovirus 감염의 연구에 적절한 실험모델이 될 수 있는가를 알아보고자 이러한 모델에 rhinovirus가 실제 감염이 되는지, 감염이 된다면 생체에서 나타나는 cytokine 분비와 같은 반응을 보이는지 확인 하였다.

재료 및 방법

조직의 채취
   연구에 사용된 조직은 14예의 비중격성형술 시 동시에 실시된 만곡 반대측 하비갑개에 대한 비갑개성형술 시 절제된 점막이었다. 연구에 포함된 환자들은 최근 2개월 이내에 코감기의 병력이 없었던 환자들이었고, 수술 전 1달 이내에 항히스타민제나 항생제 등의 투약경력이 없었으며 최근 6개월간 부비동염의 병력이 없었다. 환자군은 방사선 단순촬영에서 부비동염의 소견을 보이지 않았고 11종의 흔한 흡입항원(Bencard TM, Brentford, England)에 대한 피부단자검사상 음성을 보였다. 조직이 채취된 환자군의 나이는 평균 27세이었고 남녀비는 6：4 이었다. 수술 시 1% lidocaine과 epinephrine(1：1000)으로 혼합된 용액을 적신 거즈로 탐폰 마취하고, 10분 경과 후 epinephrine(1：100,000)과 1% lidocaine이 혼합된 마취액을 국소주사 하였다. 비갑개성형술 시 하비갑개 점막의 피판을 하비갑개 골에서 분리하여 수술가위로 절제하였다.

기관배양과 Rhinovirus 감염
   환자로부터 적출한 점막조직 전체를 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml fungizone을 포함하는 Minimum essential media(MEM)(GIBCO, Grand Island, NY)를 배양액으로 하여 4℃에서 4시간 담가두었다. 그 후 항생제가 포함되지 않은 MEM 배지에 1시간 동안 담그었다. 24 well plates(Nunclon；Nunc, Roskilde, Denmark)에 gelfoam(Johnson & Jonson, Gargrave, U.K)을 5×5 mm의 크기로 잘라서 1.5 ml의 배양액에 겨우 잠기도록 하고 gelfoam 위에 4×4 mm 크기로 자른 점막편을 올려놓았다. 10예에서 채취한 점막조직은 크기가 충분한 경우 2조각 이상으로 절제하여 1개의 조직은 대조군으로, 다른 조직편은 감염군에 사용하였다. 조직의 상피면은 공기에 접하게 되고 아래 면 즉 점막하 고유층은 배양액에 적셔진 gelfoam 위에서 측면과 하면으로부터 배양액의 영양공급을 받는 air-liquid interface 상태가 되었다(Fig. 1). 조직의 두께가 충분하면 점막표면에 배양액이 접촉되지 않도록 gelfoam을 충분히 담그었고, 조직의 두께가 얇을 때는 점막표면에는 배양액이 접촉되지 않도록 배양액의 높이를 gelfoam 높이보다 약간 낮도록 유지하며 배양하였다. 조직배양은 95%의 공기, 5% CO₂, 33℃의 항온, 항습조건에서 행해졌다. 다음날 Human rhinovirus(HRV)-16(ATCC, Manassac, VA) 10⁶ TCID/ml stock을 점막면에 골고루 퍼질 수 있는 최소의 양인 30 μl를 실험군 조직의 점막표면에 점적하였다. 대조군에는 동량의 PBS를 점적한 다음 동일 배양조건에서 4시간 배양하여 상피세포에 바이러스 감염을 유발시켰다. 그 후 점막표면에 잔존해 있는 바이러스를 제거하기 위해 phosphate buffered saline(PBS)으로 4회 세척한 후 다시 새로운 gelfoam 위로 조직을 옮겨 48시간 배양하였다. 48시간 경과 후 점막표면액을 10 ml의 PBS로 세척하고 바이러스 증식 여부를 보기 위한 semi-nested RT-PCR을 위하여 -70℃ 냉동고에 보관하였다. Cytokine의 시간에 따른 분비를 관찰하기 위한 실험에서는 추가적으로 4예의 하비갑개 점막조직을 각각 5등분하여 바이러스를 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 연속 처치한 군과 바이러스 감염 없이 24시간 배양한 대조군으로 나누어 배양하였다. 배양에서 실험군별로 정해진 시간 경과 후 배양액을 수집하여 IL-6와 IL-8의 분비의 시간경과에 따른 변화를 보았다. Rhinovirus는 상피세포 내에서 증식하여 세포외부로 배출되지만 세포 내에서 증식 중인 바이러스도 존재한다. 그러한 세포 내 바이러스를 증명하기 위하여 바이러스에 24시간 연속노출 된 4예의 배양된 점막을 in situ hybridization을 위하여 냉동보관 하였다. 

Rhinovirus 검출을 위한 semi-nested 역전사중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction：RT-PCR)
   점막표면 세척액 200 μl에 Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA)용액 1 ml씩을 첨가하고 15초간 vortex 한 후 chloroform 200 μl를 첨가하여 충분히 혼합하였다. 그 후 4℃, 15,000 rpm의 조건으로 15분간 원심분리하여 상층에 있는 RNA 부유액을 채취하였다. 얻어낸 부유액을 동량의 isopropanol로 처리한 후 동일조건으로 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었고, 75% ethanol로 세척한 후 0.1% DEPC 희석 증류수에 용해시켰다. 용해된 RNA의 농도와 순도를 확인하기 위해 spectrophotometer(Parmacia, Uppsala, Sweden)로 260 nm 및 280 nm에서의 optical density를 측정하였다. HRV-16의 특이적인 검출을 향상시키기 위하여 먼저 picornavirus에 대한 RT-PCR을 실시한 후 그 반응산물로부터 semi-nested RT-PCR을 시행하였다. 반응액 총량은 20 μl로, 8.8 μl RNA에 2×reaction buffer(0.4 mM dNTP, 2.4 mM MgSO4)10 μl, 각각의 시발체(100 mol/μl ) 0.5 μl와 PlatinumTaq(Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA) 0.4 μl를 혼합하여 thermal cycler(Perkins Elmer 9600 thermal cycler, Boston, MA)에서 one-step RT-PCR을 시행하였다. cDNA 합성은 50℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후 94℃에서 2분간 변성, 94℃에서 30초간의 변성 반응, 55℃에서 30초간의 결합 반응, 68℃에서 30초간의 연장 반응으로 실시되었다. 이 반응을 PCR 자동화 장치에서 36회 반복 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR에 이용한 picornavirus RNA의 증식에 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-GCACTTCTGTTTCCCC-3'이고 antisense primer의 염기서열은 5'-CGGACACCCAAAGTAG-3'이며 반응물의 크기는 388 bp였다.
   Picornavirus의 PCR 산물 5 μl와 2×reaction buffer(0.4 mM dNTP, 2.4 mM MgSO4) 10 μl, 각각의 시발체(100 pmol/μl) 0.4 μl와 AmliTaq1 unit(Appllied Biosystems, Foster City, CA)를 혼합하여 thermal cycler에서 RT-PCR을 시행하였다. 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 30초의 조건으로 36 cycle의 PCR을 실시하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR에 이용한 HRV-16의 sense primer의 염기서열은 5'-GCACTTCTGTTTCCCC-3'이고 antisense primer의 염기서열은 5'-CATTCAGGGGCCGGAGGA-3'이고 반응물의 크기는 292 bp였다. 반응물은 size marker와 함께 1.5% agarose gel에서 100 V, 70 mA로 전기영동한 후 자외선 상에서 판독하고 polaroid카메라로 촬영하였다. Semi-nested RT-PCR은 증류수를 이용한 RT-PCR의 음성대조군, 감염시키지 않았던 점막표면액, 4시간 rhinovirus 감염 직후의 점막표면액, 4회째의 세척액, 배양액, 48시간 후의 점막표면 세척액, 양성 대조군으로 106 TCID/ml의 HRV-16에 대해서 시행하였다. 4시간 rhinovirus 감염 직후의 점막표면액은 상피세포 표면에 잔존해 있는 바이러스를 검출하기 위해, 4회째의 세척액은 4시간 감염 직후 바이러스가 완전히 세척되었는지 확인하기 위하여 실시하였다. 배양액의 검사에서는 48시간 후에 바이러스가 세포배양액에서 증식되었는지 확인하고자 하였다. 상피세포에서 감염이 일어났고 그에 따라 증식된 바이러스가 세포표면으로 배출되었는지를 관찰하기 위해서는 48시간 후의 점막표면 세척액을 검사하였다.

In situ hybridization
   냉동 절삭기에서 미리 -20℃로 냉각시킨 쇠판 위에 절삭용 고정액 OCT액을 떨군 후 그 위에 점막조직을 올려 넣고 다시 OCT 액을 첨가하여 굳힌 후 절삭기를 이용하여 4 μm의 두께로 잘라 미리 polylysine으로 표면이 처리된 슬라이드 위에 붙였다. 조직이 붙은 슬라이드를 37℃ 건조대 위에서 10분 정도 건조시킨 후 건조된 슬라이드를 아세톤에 5분간 담근 후 흐르는 물에 세척하고 공기 중에서 건조시켜 -70℃에 보관하였다. 전보합 결합(prehybridization)을 위해 -70℃에 보관해 두었던 슬라이드를 꺼내어 0.1% DEPC 용액에 5분간 처리한 후 100 mM glycine에서 10분간 처리 후 PBS로 5분간 세척하고 0.3% Triton ×100에 15분간 처리 후 PBS에 5분간 담궜다. 그 후 proteinase K(Oncogene, Boston, MA) 용액에서 37℃의 온도로 30분간 처리하였다. 그 후 5분간 PBS로 세척하였고, 4℃의 4% paraformaldehyde 용액으로 5분간 다시 고정한 다음 5분간 세척하였다. 슬라이드를 acetic anhydride/triethanolamine에 10분간 담가둔 후 PBS에서 5분간 세척하였고, 37℃의 전보합결합용액을 한 슬라이드 당 30 μl씩 넣고 10분간 반응시켰다. 사용한 oligonucleotide의 염기서열은 PB4(5'-CAGGGGCCGGAGGACTCAAGATGAGCACACGCGGCTC-3')와 PB5(5'-TGCAGGCAGCCACGCAGGCTAGAACTCCGTCGCCG-3')였다. 보합결합(hybridization)을 위해 보합결합 용액을 Eppendorf tube에 1 ml씩 분주하여 -20℃에 보관하여 두었던 보합결합 용액을 녹여 소식자를 넣고, 슬라이드 위에 조직이 잘 보이도록 하여 50 μl의 보합결합 용액을 골고루 떨군다. Cover glass를 한쪽부터 덮어 기포가 들어가지 않도록 덮고 37℃에서 15시간 이상 반응 시켰다. 다음날 37℃의 2×SSC 용액을 충분한 양 staining dish에 준비하여 보합결합이 끝난 후 슬라이드를 이 용액에 담근 상태에서 cover glass가 천천히 분리되도록 하였다. 2×SSC 용액에서 슬라이드를 15분간 2회 씻은 후 1×SSC 용액(동일온도)으로 옮겨 다시 15분간 2회 세척하였다. Shaking plate를 이용하여 슬라이드를 buffer I에서 10분간 두 번 세척하였다. 그 후 Buffer II로 30분간 처리하였다. Anti-DIG-alkaline phosphatase(Fab fragment)를 buffer II에 1：100으로 희석하여 슬라이드 위에 올린 후 2시간 동안 상온에 보관하였다. 다음으로 Buffer III에 10분간 처리한 후 세척하였다. 그 후 4.5 μl NBT(nitroblue tetrazolium)와 3.5 μl BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)를 1 ml의 buffer III로 섞은 후 슬라이드 위에 올려 놓았다. Cover glass로 덮은 후 humid chamber안에서 2시간에서 24시간 동안 보관하였다. 이때 발색의 정도를 시간 간격을 두고 광학현미경으로 관찰하였다. 발색이 시작 된 후 30분에 TE buffer에 담그어 발색과정을 멈추게 하고 즉시 증류수에 담그어 헹구고 수용성 검경 용액을 떨구고 cover glass를 덮은 후 실온에서 건조시켰다. 보합결합이 종료된 슬라이드를 광학현미경 200배 시야에서 관찰하였다. 상피세포층의 전층에서 색을 보이는 점의 수를 센다. 각 슬라이드에서 진한 보라색으로 염색된 점들을 양성세포로 판독하여 양성인 점들의 평균을 계산하였다.

IL-6와 IL-8 측정을 위한 ELISA
   4예의 하비갑개 점막조직을 각각 5등분하여 바이러스를 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 연속 처치한 군과 바이러스 감염 없이 24시간 배양한 대조군으로 나누어 배양 후 실험군별로 배양액을 수집하여 -70℃에 보관한 후 ELISA를 시행하였다. IL-6와 IL-8의 양은 Elisa kit(Biosource Co, Nivelles, Belgium)을 이용하여 측정하였다. -70℃에 보관해 둔 조직배양액을 희석용액으로 300배 희석하여 100 μl씩 일차항체(MAb1)가 깔려있는 96 well ELISA plate에 넣고 각각의 well에 항IL-6, 항IL-8 conjugate를 50 μl씩 혼합한 후 horizontal shaker에서 700±100 rpm으로 흔들어 주었다. 그 후 세척 용액으로 3회 세척 한 후 신선한 발색용액을 각 well당 200 μl 넣고 빛이 없는 상태에서 700±100 rpm으로 30분간 반응 시킨 후 stop 용액(1.8N H2SO4)을 50 μl 넣고 자외선 분광 광도계(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리
   대조군과 rhinovirus 감염군에서 cytokine 분비의 차이는 Wilcoxon signed rank test를 이용하여 유의성을 검증하였다(p<0.05).

결     과

Semi-nested RT-PCR
   Semi-nested RT-PCR은 증류수를 이용한 음성대조군, 감염시키지 않았던 점막 표면액, 4시간 감염 직후 4회 째의 세척액, 48시간 후의 배양액에서는 음성을 보였다. 이는 4시간 배양 후 4회 세척이 rhinovirus를 완전히 제거하였음을 의미하며 배양액에서는 rhinovirus의 오염 및 증식이 일어나지 않았음을 나타내는 결과이다. 이들 각 시료 중 4시간 감염 후의 점막표면액에서는 rhinovirus를 나타내는 띠가 나타났다. 이는 표면에 점적한 rhinovirus가 잔존해 있음을 의미한다. 48시간 경과 후의 점막표면 세척액에서도 292 bp의 띠가 확인되었다(Fig. 2). 그러나 실험에 이용된 10예의 비갑개 점막 중 5예에서만 semi-nested RT-PCR에서 292 bp의 band가 확인되어 50%의 감염을 보였다.

In situ hybridization
   대조군 점막조직에서는 상피세포층에 진한 보라색을 보이는 양성신호가 관찰되지 않았다. 24시간 rhinovirus에 연속노출된 감염된 점막에서는 상피세포층에 분산되어 존재하는 양성신호가 관찰되었다(Fig. 3). 광학현미경의 200배 시야에서 감염의 양성을 보이는 점은 5예의 실험조직에서 평균 11.8±4.5개가 나타났다. 점막하 고유층에서는 뚜렷한 양성신호를 관찰할 수 없었다.

IL-6와 IL-8
   Il-6의 분비는 동일한 실험조건에서 rhinovirus에 노출되지 않았던 대조군 점막에서는 24시간 경과 후에 20±3 ng/ml의 분비를 보였다. 실험군 점막조직에서는 2시간 후에 평균 62±4 ng/ml, 4시간 후에 43±9 ng/ml, 8시간 후에 58±47 ng/ml으로 별 증가를 보이지 않았다. 24시간 경과 후에는 대조군에 비하여 유의하게 증가된 306±72 ng/ml의 분비가 있었다(p<0.05, Wilcoxon signed rank test)(Fig. 4). 이로부터 바이러스 감염점막조직에서 대조군에 비교하여 현저하게 IL-6의 생성이 증가되며 그러한 IL-6의 생성은 감염 후 24시간 경과 후부터 뚜렷함을 알 수 있다.
   배양액에서 확인된 IL-8의 분비는 대조군 점막에서는 24시간 후에 평균 5±3 ng/ml 이었다. 실험군 점막조직에서 2시간 후에 평균 12±4 ng/ml, 4시간 후에도 평균 12±6 ng/ml, 8시간 후에는 평균 17±3 ng 이었다. 
   24시간 후에는 평균 137±12 ng/ml이었고 대조군과 유의한 차이를 보였다(p<0.05, Wilcoxon signed rank test)(Fig. 5). 이 결과로부터 IL-8의 생성도 IL-6의 생성과 마찬가지로 실험군에서 크게 증가하였음이 관찰되며 특히 24시간 경과 후부터 그러한 현상이 확실하였다.

고     찰

   비강점막의 장기배양모델은 본 연구 이전에도 여러 연구에서 사용되었으나 본 연구에서처럼 rhinovirus의 감염연구에 이용된 연구는 없었다. 동물이나 사람의 조직을 이용한 장기배양 방법은 호흡기도상피층의 병태생리의 연구에, 특히 특정 물질의 효과를 보는 목적으로 사용되어 왔다.¹¹⁾¹²⁾ 장기배양에는 조직 전체를 배양액에 잠기게 하는 방법과 air-liquid interface 방법이 있는데 후자가 생체와 유사한 조건의 실험방법이다. Air-liquid interface 방법으로 배양할 때는 조직에 배양액을 어떻게 공급해 주는가 하는 면에 차이가 있다. 일부 연구에서는 여과지를 배양액에 담그고 조직을 그 위에 위치시키는 방법이 사용되었다.¹¹⁾ 저자의 연구에서는 Schierhorn 등¹³⁾의 방법과 동일하게 gelfoam을 배양액에 위치시켜 점막에 영양공급이 이루어지도록 하였다. Jackson 등¹²⁾의 연구에 따르면 배양액을 갈아주지 않았을 때는 air-liquid interface 장기배양에서 섬모운동횟수, 섬모의 수, 미토콘드리아와 핵의 이상이 배양 5일째부터 나타나며, 배양액을 매일 갈아주면 20일까지는 그러한 변화가 나타나지 않았다. 이번 저자의 연구에서는 전체 실험과정이 3~4일에 종료되므로 이러한 장기배양 방법이 의미 있는 연구결과를 도출해 내는데 유용한 방법이라 생각된다.
   배양 중인 점막조직에 대한 rhinovirus 감염은 점막표면에 4시간 동안 바이러스 점적 후 깨끗이 세척하고 다시 48시간 동안 33℃에서 항온배양하는 방법을 택하였다. 기존 연구의 기도상피세포의 1차배양에서는 바이러스를 1~2시간 노출시킨 후 24시간에서 72시간 후에 세포표면의 바이러스 타이터를 분석하여 감염의 정도를 파악하였다.⁹⁾¹⁴⁾ 그러나 저자의 연구에서는 감염의 가능성을 더욱 높이기 위하여 4시간 동안의 노출을 택했다. 점막상피세포에 바이러스 감염이 되어있는가의 확인은 상피세포 분쇄액에 대한 RT-PCR,¹⁵⁾ 조직에 대한 in situ hybridization, 면역염색반응으로 가능하다.¹⁶⁾ 저자의 연구에서 세포 내에 잔존해 있는 바이러스는 in situ hybridization으로 검출하였고, 그 결과 상피세포의 일부에서 rhinovirus가 발견되었다. In situ hybridization을 위해서는 세포 내의 바이러스의 존재를 밝히는데 연속적인 바이러스의 노출이 더욱 유리하리라 판단되어 24시간 연속노출의 방법을 택하였다. 연구 결과 상피세포층에 국한되어 매우 제한적인 숫자의 상피세포에서만 감염이 확인되었다. 이러한 소견은 rhinovirus가 점막에 감염을 일으키게 되면 점막상피세포중 일부의 상피세포에서만 감염이 일어난다는 기존의 연구와 일치하는 소견이다.¹⁶⁾ 면역염색반응은 rhinovirus에 대한 항체가 아직 상용화되지 않아 구할 수 없었기 때문에 실시할 수 없었다.
   이번 연구에서 상피세포에서의 rhinovirus 감염 여부는 상피세포 표면액을 세척하여 그 세척액에서 rhinovirus에 대한 RT-PCR을 실시하여 증명하였다. 이는 상피세포에서 rhinovirus 감염이 있을 때 수많은 세포 중 일부에서만 감염이 일어나고 감염이 발생한 세포에서는 바이러스가 세포 내에서 증식하여 세포를 공동화시키고 다시 점막표면으로 배출되므로 표면 세척액에서 RT-PCR로 바이러스의 존재확인이 가능한 것이다.¹⁶⁾ 저자의 방법은 기존의 연구들에서 세포표면액을 다시 fibroblast 등에서 배양하여 cytopathic effect를 관찰함으로써 바이러스의 titer를 정량한 것과는 다른 새로운 방법이었다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 저자의 방법은 바이러스 타이터를 측정할 때와 같은 정량적 분석을 정확히 할 수는 없다. 그러나 타이터 분석에 1주 이상의 세포배양이 필요한 것과는 달리 2~3일 이내에 PCR로 더욱 신속하게 바이러스의 감염 여부를 확인할 수 있다는 장점이 있는 방법이라고 할 수 있다. 이러한 과정에서 중요한 것은 rhinovirus를 4시간 동안 점막표면에 투여하여 감염시킨 다음 표면에 있는 바이러스를 세척하여 제거한 후 다시 48시간 동안 배양한다는 것이다. 만일 그 과정이 완전하지 않았다면 48시간 후에 검출된 바이러스가 4시간 감염시 잔존한 바이러스일 가능성이 있기 때문이다. 본 연구에서는 초기 4시간 감염 후 그 세척액에 대한 RT-PCR을 실시하여 몇 번의 세척 후에 바이러스가 완전히 제거될 수 있는가를 세척액에 대한 RT-PCR로 확인한 후 세척의 횟수를 결정하였다. 연구결과 실험에 이용된 10예의 비갑개 점막 중 5예에서만 semi-nested RT-PCR에서 292 bp의 band가 확인되어 50%의 감염을 보였다. 이 결과는 4시간 감염 후 48시간 동안 배양한 상피세포에서 rhinovirus의 증식이 있었고 증식된 바이러스가 세포 외로 배출되었음을 의미한다. 10예의 점막조직 중 5예에서 RT-PCR로 바이러스를 증명할 수 없었던 것은 실제적으로 실험과정에 문제가 있어 감염이 일어나지 않았거나 혹은 RT-PCR 과정의 문제라고 추정된다. 그러나 이러한 결과는 생체 자원자를 대상으로 한 연구에서도 모든 환자에서 감염이 나타나지 않았다는 기존의 연구결과와 어느 정도 유사한 것이다.¹⁹⁾ 
   사람의 비강점막상피세포에 rhinovirus감염이 일어나면 IL-6와 IL-8의 분비가 증가된다.¹⁴⁾ IL-6와 IL-8의 분비는 호중구의 화학주성을 포함한 여러 생리현상을 유발하여 rhinovirus 감염 시 나타나는 병태생리에서 중요한 역할을 한다.²⁾ 그러므로 일반적으로 rhinovirus 감염 후의 생리학적 변화를 나타내는 가장 대표적인 변수로써 IL-6와 IL-8의 생성정도가 이용되어 왔다. 그러므로 본 연구에서도 조직배양모델에 rhinovirus 감염을 유발하고 그에 따르는 생리학적 변화가 수반되는가를 확인하기 위하여 ELISA 기법을 이용하여 IL-6와 IL-8의 분비 정도를 측정하였고, 특히 cytokine 분비의 시간경과를 관찰하였다. 그 결과 cytokine 분비는 감염 2, 4, 8시간까지는 특별한 증가를 보이지 않다가 24시간째에 급격한 증가를 보였다. 바이러스 노출 24시간 경과시의 cytokine 분비는 대조군의 그것에 비하여 현저히 증가되었다. 본 연구에서의 cytokine 분비의 시간경과는 자원자에서 행한 생체실험에서 감염 24시간 째 cytokine의 분비가 증가된다는 Yamaya 등²⁰⁾의 연구결과와 일치되는 소견으로 저자의 기관배양모델이 생체현상을 정확히 반영할 수 있는 연구모델임을 확인하는 결과이다. 저자의 연구모델은 이비인후과 의사들에게 접근성이 좋은 연구모델이 되리라 생각한다. 특히 알레르기비염, 부비동염 등의 질환이 rhinovirus의 감염정도에 어떠한 영향을 미치는지, 또한 기왕에 발생된 감염에서 각 질환별로 염증반응의 양상은 어떠한 차이를 보이는가 등의 연구에는 매우 적절한 실험모델이라 할 수 있다. 그러나 저자들의 실험모델은 실험조직에서 rhinovirus에 의한 감염이 RT-PCR로 확인된 경우가 50%에 지나지 않아 개별적인 실험에서 항상 감염 여부를 확인해야 한다는 한계점을 보이므로 이는 추가적인 연구로 극복되어야 할 문제점이다. 또한 cytokine measurement와 in situ hybridization이 감염여부를 보기 위한 실험에서와 달리 virus의 연속감염법을 택하였으므로, 추후에는 4시간 감염 후 각각 시간경과에서의 cytokine의 분비 그리고 그에 따르는 in situ hybridization을 이용한 세포내 바이러스의 발현의 차이에 대한 추가적인 연구의 필요성도 제기될 수 있을 것이다.

결     론

   연구의 결과 이 점막 장기배양모델이 rhinovirus 감염의 생리적 변화를 파악하기 위한 연구모델이 될 수 있음을 알게 되었고, 향후 이 연구모델을 이용한 추가적인 연구의 필요성도 제기되었다.

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