서     론

   암 전구 병소가 암으로 진행하는 데는 여러 가지 유전적인 변화의 축적에 의한다는 것은 잘 알려진 사실으로 두경부 종양을 비롯한 몇몇 종양에서는 종양 생성에 관여하는 유전적 변화에 대하여 알려져 있다. 유전자의 변화로 인하여 유전자의 발현이 달라지며 단백질의 구조와 기능이 변화하게 되는데¹⁾ 종양이 발생하는 각 단계에서 변화된 유전자를 검출 할 수 있다면 이들을 이용하여 종양을 조기에 진단 할 수 있는 표지자로 이용할 수 있게 된다.
   이러한 변화는 정상조직에서 보다는 종양 세포에서 더 흔하게 일어나며 조직검사에서 얻은 검체나 체액에서 다양한 방법을 이용하여 검출하여 이를 종양의 조기 진단에 이용하는 종양 표지자로 쓸 수 있다.
   이러한 표지자들은 종양을 조기에 진단하는데 유용할 뿐 아니라 병의 진행이나 치료의 반응을 평가하는데 이용되기도 한다.
   종양 표지자들은 이미 임상에서 많이 이용되고 있다(Table 1). 전립선암의 표지자인 PSA(prostate specific antigen)은 미국의 모든 남성 환자의 정기 건강 검진에 이학적 검사와 함께 이용되고 있으나²⁾ PSA가 상승된 환자의 3분의 1 정도는 실제 전립선암 환자가 아니다. 따라서 즉각적인 치료를 필요로 하는 암이 존재한다는 것을 알려줄 믿을만한 새로운 표지자의 발견이 중요하다고 할 수 있다.
   하지만 대부분의 다른 종양에서도 임상적으로 이용할 수 있는 믿을만한 표지자는 별로 없으며 더욱이 국소 림프절에 전이와 원격전이를 미리 예측 할 수 있는 표지자는 없다.
   치료의 효과를 판정할 수 있는 표지자도 알려져 있는데 유방암에서 tyrosine receptor kinase ERBB2가 높게 발현될 때 trastuzumab에 반응을 잘하여 투약하기 전에 이것의 발현을 알아 볼 수 있는 방법이 개발되어³⁾⁴⁾ 종양 치료의 효과를 판단할 수 있는 표지자도 알려져 있으나 임상적인 이용에는 문제점이 많다.
   분자생물학적 표지자를 치료 목표로 하는 새로운 치료 방법들은 기존의 종양 세포 파괴 기전과는 달리 혈관형성이나 암 조직의 침윤을 막음으로써 종양의 성장을 막는다. 그러나 이들은 종양의 크기를 즉각적으로 감소시키지 못하므로⁵⁾ 이러한 약제들의 임상효과를 알기는 힘들어 치료 효과를 알기 위하여는 다른 방법들이 필요하다. 예를 들어 약제가 어떤 kinase를 억제하는 것이라면 인산화를 측정하여 약제의 효과를 결정하여야 하고⁶⁾ 약제에 반응을 하지 않는 듯한 경우에는 약제가 적절한 생물학적 효과를 내는지 측정하여야 한다.
   이와 같이 현재까지 알려진 분자 생물학적 표지자는 임상 일부에서만 조심스럽게 이용되고 있으며 앞으로 새로운 표지자를 발견하기위하여 많은 연구와 노력이 필요하다. 이에 현재까지 어떠한 방법으로 종양 표지자들이 발견되어 왔으며 앞으로의 전망에 대하여 알아보고자 한다.

현재 이용되는 종양 표지자

   종양의 표지자를 발견한 초창기에는 임상병리학적 소견에 근거를 두고 시작되었는데 소수의 종양에서만 가능하여서 표지자들은 광범위하게 이용할 수 없었다.
   종양 유전자의 발견은 종양의 성질과 예후와 연관이 있는 유전적 변이를 알 수 있게 되었는데 최근 사람의 염기서열이 완전히 알려 지면서 새로운 종양억제유전자와 종양유전자의 발견에 새로운 장을 마련하게 되었다.

DNA를 이용한 방법
   종양과 암 전구 병소에서의 연구는 종양생성과정에서 조기에 일어나는 유전적인 변화를 발견할 수 있게 되었는데 이때의 유전적 분석은 조직검사 샘플에서 대부분 시행되었다. 그러나 약 50여 년 전 혈장에서의 유리 DNA가 발견되면서 이들 DNA를 이용하여 종양을 조기에 진단할 수 있게 되어 환자에게 비 침습적인 방법으로 쉽게 종양을 진단 할 수 있게 되었다(Fig. 1).
   유리 DNA가 체액 내에 유입되는 기전은 정확히 밝혀진 바가 없으나 종양 환자의 혈장과 혈청에서 유리 DNA가 발견되었고 전이가 있는 환자의 혈청에서는 유리 DNA에서의 유전적 변화가 검출 되었다.⁷⁾⁸⁾
   따라서 종양 환자의 혈장과 혈청은 종양유전자 돌연 변이, microsatellite instability, hypermethylation of promoter region, viral DNA 검출 등의 방법으로 종양 표지자를 찾는데 이용되고 있고 원발 부위에 따라 타액, 소변, 대변 같은 체액도 DNA를 분리 하여 표지자를 찾을 수 있는 검체가 된다.⁹⁾

유전자 돌연변이
   1990년 초 고형암에서 체액을 검체로 종양 표지자를 처음으로 발견하였는데 즉 방광암 환자의 소변에서 p53 변이가 발견되었고¹⁰⁾ 대장암의 대변에서 RAS 변이가 발견됨으로써¹¹⁾ 많은 연구자들이 종양의 조기진단을 위하여 다양한 DNA 변이를 연구하게 되었다.
   하지만 많은 양의 정상 DNA가 존재하는 조직에서 개개의 변이된 DNA를 찾는 데는 새로운 방법이 필요하게 되어 PCR(polymerase chain reaction)이 개발되게 되었다.¹²⁾ 종양세포는 각기 다른 여러 종양 유전자와 종양억제유전자의 변이를 갖고 있기 때문에 하나의 유전적 변이만을 찾아 낼 수 있는 PCR 방법은 한계를 갖게 된다. 그래서 PCR로 검출할 대상이 되는 유전자조각을 증폭하고 mutation specific ligation of small cDNA방법으로 많은 유전자의 변이를 발견할 수 있는 방법이 개발되었다. 이런 방법으로 대장암 환자의 대변에서 RAS, APC(adenomatous polyposis coli)의 변이들을 발견하였고¹³⁾¹⁴⁾ 폐암 환자의 객담에서 RAS 변이, 간암 환자의 혈청에서 codon 249의 p53 변이를 발견하였다.¹⁵⁾
   유전자변이가 종양의 진단 뿐 아니라 종양의 진행과 예후를 알 수 있다는 것은 1995년 두경부 종양에서 수술 변연부와 경부 림프절에서 p53 변이가 처음 알려지고 난 후부터이다.¹⁶⁾ 두경부 종양 환자의 50%에서 p53 유전자 변이를 갖는데 수술시 변연부에 p53 유전자의 변이가 있으면 재발을 잘하고 생존률도 낮다고 보고 되었다. 대장암에서도 림프절에 KRAS, p53 변이가 있으면 예후가 좋지 못하다고 알려졌다.¹⁷⁾

LOH(Loss of heterozygosity)와 microsatellite instability
   LOH(이형접합성 상실)은 종양세포의 대표적인 특징의 하나로 암전구 병소와 종양에서 여러 가지 PCR을 기본으로 하는 방법으로 발견될 수 있다. Microsatellite DNA marker는 종양에서 LOH를 발견하는 도구로 이용된다. 종양세포는 유전적으로 불안정하므로 microsatellite marker는 종양세포에서 소실되거나 길어질 수 있는데 이것을 microsatellite instability라 하며 이것도 종양의 중요한 표지자가 된다.¹⁸⁾
   1996년 방광경으로 방광암이 의심되는 환자 25명의 소변에서 LOH와 통상적인 세포검사를 시행하였는데 소변의 LOH 검사에서는 95%가 방광암 조직소견과 일치하였으나 소변의 세포검사에서는 50%에서만 일치하였다.¹⁹⁾ 이것이 microsatellite analysis로 방광암을 조기에 발견하는 방법으로 유용할 수 있다는 것을 보여주는 첫번째 보고였다.
   또한 방광암의 재발 발견에도 microsatellite analysis가 이용될 수 있는데 방광암 치료 후 환자의 소변에서 LOH검사를 하여 방광경에서 발견되기 6개월 전에 이미 종양 세포가 있다는 것을 예측할 수 있어 환자의 소변에서의 microsatellite analysis가 재발한 방광암을 발견할 수 있는 유용한 검사 방법이 될 수 있다는 가능성을 제시하였다.²⁰⁾
   Microsatellite analysis는 두경부 종양의 조기 진단에도 이용될 수 있는데 구강 상피 세포에서 23개의 microsatellite markers를 분석 하였는데 적어도 하나의 표지자에서 LOH나 microsatellite instability가 발견된 경우가 원발 부위에서는 86%, 타액에서도 동일한 변화가 발견된 것이 79%였으며 대조군에서는 변화가 발견 되지 않았다.²¹⁾ 또한 다른 연구에서는 원발 부위의 변화와 동일한 변화가 두경부 종양 환자의 혈청에서는 29%만 발견되고²²⁾ 소세포 폐암에서는 76%가 발견되었다고²³⁾ 하였는데 이는 두경부 종양보다 폐암이 원격전이를 잘한다는 특징을 반영한다고 할 수 있다.
   그러나 microsatellite analysis의 단점은 많은 표지자를 검사해야 하므로 많은 환자에서 조기진단의 목적으로 사용하기에는 어렵다. 새로운 기술의 발달로 시간이 단축되고 있지만 종양을 진단하기 위하여는 15에서 20개의 표지자를 검사해야 하는 어려움이 있다.²⁴⁾

DNA methylation
   다른 또 하나의 표지자를 검출하는 방법은 종양과 연관이 있는 유전자의 promoter 부위에 hypermethylation을 검출하는 것이다. 유전자의 promoter 부위의 cytosine에 methylation이 되어 있으면 전사가 일어나지 않아 종양억제유전자가 불활성화하여 종양이 발생할 수 있다는 것으로²⁵⁾ DNA의 methylation된 부분을 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 PCR 방법이 개발되었다.²⁶⁾ 이 방법은 DNA를 bisulfite 처리하여 unmethylated cytosine을 uracil로 전환하고 반면에 methylated cytosine은 변화가 없게 하여 PCR을 하게 된다. 이 방법은 1000개의 정상세포에서 하나의 종양 세포만 있어도 검출이 가능하여 체액 내에서 종양 DNA를 검출하는데 충분하다. 따라서 이 방법은 구강암환자의 타액에서,²⁷⁾ 폐암 환자의 객담에서,²⁸⁾ 그리고 폐암, 두경부 종양, 대장암환자의 혈청에서 종양 세포를 검출할 수 있다(Table 2).^29)30)31) 그러나 한번에 하나의 유전자를 분석하는 것은 검출률이 높지 않기 때문에 의미 있는 결과를 얻어 내기가 힘들어 여러개의 유전자를 같이 분석할 수 있는 방법이 중요하게 되었다.
   예를 들어 p16, DAPK(death associated protein kinase), MGMT(methyl O-guanine methyltransferase) 유전자의 methylation은 폐암과 두경부 종양과 연관이 있는데 이들을 같이 분석하였을 때 폐암과 두경부 종양 환자의 50%에서 혈청에서 methylated 된 이들 유전자가 발견이 된다.²⁹⁾³⁰⁾
   최근에 methylation을 정량적으로도 분석할 수 있는 real time PCR 방법이 개발되었는데 이는 분자 생물학을 이용한 종양치료에 중요한 전기를 마련하였다. 즉 methylation 된 정도를 정량적으로 분석함으로써 환자의 치료 효과를 판정할 수 있고 이를 이용하여 통상적인 조직검사의 정확도를 높이는데 기여하게 되었다.³²⁾ 즉 GSTP1(Glutathione-S-transferase placental enzyme1)의 methylation 정도는 정상조직과 전립선암 조직을 정확히 구별하는데 조직검사 결과와 같이 병용하면 조직검사의 진단률을 높일 수 있다고 하였다.³³⁾

미토콘드리아 DNA 변이
   미토콘드리아 DNA 변이도 여러 종양과 연관이 있다고 알려 졌는데 대장암 환자의 종양세포의 미토콘드리아에서 변이가 발견되었다.³⁴⁾
   미토콘드리아 내에는 같은 유전자가 여러 개 존재하므로 핵 내의 DNA 변이를 검출하는 것 보다 쉽다. 즉 폐암환자의 객담내 미토콘드리아 p53 변이는 핵 내의 그것보다 200배 많아 객담의 미토콘드리아를 이용하면 보다 쉽게 유전자 변이를 검출 할 수 있어³⁵⁾ 앞으로 많은 연구가 진행될 것으로 생각된다.

Viral DNA
   바이러스와 연관된 종양에서의 바이러스 DNA를 검출하는 것은 종양표지자로 이용되는데 자궁경부암에서 인유듀종바이러스(HPV)를 검출하는 것은 자궁경부암에 걸릴 수 있는 고 위험 군의 여성들을 알아 낼 수 있는 방법이다. 인유듀종 바이러스는 일부 두경부 종양의 원인으로도 알려져 있는데 HPV 양성 두경부 종양 환자의 혈청에서는 HPV DNA가 발견되나 음성인 환자의 혈청에서는 발견되지 않는다.³⁵⁾
   EBV DNA는 비인강암 환자의 혈장과 혈청에서 발견되고 비인강암 환자의 혈청에서의 EBV DNA 농도는 종양의 크기와 연관이 있다고 한다. 그리고 EBV 혈청 DNA 농도는 치료 효과를 판정하며 재발을 조기에 알아 낼 수 있다고 한다.³⁶⁾

RNA를 이용한 방법
   종양의 발생과 연관이 있는 유전자의 변화는 그들 유전자의 mRNA의 발현에 현저한 변화를 가져온다.
   RNA를 이용한 종양 세포검출방법은 DNA를 이용한 방법과 같이 개발되었는데 조직이나 체액에서 RNA를 분리하는 것은 가능하나 RNAase 효소를 중화해야 하는 노력이 필요하여 쉬운 것은 아니다. 조직 샘플에서 mRNA를 검출하는 방법 중 가장 많이 쓰는 방법은 RT-PCR(reverse transcriptase PCR)이다.³⁷⁾
   이 방법은 흑색종 세포에서 발현되는 tyrosinase의 mRNA를 정량할 수 있고 혈청에 이것이 존재하면 종양이 있다고 생각 할 수 있으며³⁸⁾ cytokeratin mRNA는 상피세포의 표지자로 혈액내나 림프절에 이것이 존재 하면 종양이 있다고 생각할 수 있다.
   RNA를 이용한 종양 조기 진단방법은 새로운 기술발달로 많은 발전이 있었지만 아직은 DNA를 이용한 여러 방법만큼 많이 이용되지는 않는다.

단백질 표지자
   단백질을 이용한 종양세포의 검출방법은 최근 새로운 방법이 많이 개발되었지만 대개 항체를 검출하는 방법들이다. 이들은 대개 정상세포와 비교하여 종양세포에서 단백질이 과발현되거나 구조가 변형된 것을 찾아내는 것으로 주로 연구적인 목적으로 이용되고 있고 임상에 이용되는 경우는 드물다. 많이 이용되는 것 중 하나는 전립선암 환자의 혈청에서 PSA치를 측정하는 것이나 이 방법은 전술한 바와 같이 이것만 가지고 종양이 있다고 할 수 는 없고 전립선의 크기나 결절의 유무, 조직검사소견을 함께 고려해야 한다. 즉 혈청의 PSA치가 높은 환자의 3분의 1은 종양이 없고 조직검사는 작은 종양세포를 진단 못하는 경우가 있어 새로운 방법으로 조직검사와 GST methylation검사를 같이 시행하여 종양을 진단하는 것이다.
   단백질 표지자는 진단뿐 아니라 치료의 효과 판정이나 재발을 조기에 알아 낼 수도 있는데 β-HCG, AFP(α-fetoprotein)은 고환암과 간암을 추적 관찰하는데 쓰였고 CEA(carcinoma embryonic antigen)는 대장암의 관찰에 이용되어 왔다.
   난소암의 표지자인 CA125는 단일 표지자로써 종양진단의 정확도는 10% 미만이나 초음파 등을 같이하면 20%로 올릴 수 있다.
   새로운 표지자인 유방암의 CA15-3, 췌장암의 CA19-9도 환자에서 이용되기는 하나 항상 치료결과와 항상 일치하는 것은 아닌 것으로 알려졌다.^{39)40)41)42)43)}
   면역조직화학염색법도 종양이 치료 후 재발을 했는지 또는 추가적인 치료가 필요 한지 등을 결정하는데 이용될 수 있다.⁴⁴⁾
   세포의 불멸화에 필요한 telomerase도 거의 모든 종양에서 발현됨으로 종양 표지자로서 이용될 수 있는데 teromerase는 종양환자의 체액에서 발견되는데⁴⁵⁾ 림프구의 발생초기에도 발현되므로 정상조직에서도 발현될 수 있다는 단점이 있다.⁴⁶⁾

새로운 표지자의 발견
   최근에 여러 유전자나 단백질의 발현 양상을 한번에 분석 할 수 있는 새로운 방법이 개발되면서 종양 표지자를 발견하는데 새로운 장을 열게 되었다.⁴⁷⁾⁴⁸⁾
   Microarray는 종양과 정상세포에서 유전자의 발현 변화를 아는 방법으로 한번에 수천 수 만개의 유전자의 발현을 알 수 있고 발현 변화를 빨리 분석할 수 있는 방법으로 많이 이용되고 있다.⁴⁷⁾⁴⁸⁾ SAGE(serial analysis of gene expression)은 알려진 유전자 뿐 아니라 새로운 유전자를 찾아내고 정량적으로 분석할 수 있는 광범위한 클로닝 방법이다.⁴⁹⁾ 이 방법으로 췌장암의 새로운 표지자인 mesothelin이 발견되어 이용되고 있다.⁵⁰⁾
   Genomics가 인간의 유전자를 해독하려는 세계 여러나라 정부와 분자생물학 관련회사들의 막대한 투자로 최근 눈부시게 발전하고 있지만 다음 세대에는 proteomics로 관심이 집중되고 있다. 유전적인 정보로만은 결정될 수 없는 단백질변화가 종양세포에서만 특이적일 수 있기 때문이다(Fig. 2).
   Proteomics를 이용한 방법으로 새로운 종양 표지자가 발견되기 시작했고 종양 및 정상세포에서 여러 단백질의 정량분석이 가능해졌다.⁵¹⁾
   Protemics를 이용한 종양세포와 정상세포의 차이를 분석하여 전립선암과 난소암 환자의 혈청에서 종양세표에서 특이적인 단백질을 밝혀 낼 수 있다고⁵²⁾⁵³⁾ 하였고 실제로 많은 제약 회사에서 새로운 종양 치료 약제의 목표물이 될 표지자를 이 방법으로 찾고 있다.
   MALDI-TOF(matrix-assisted laser-desorption-ionizationtime-of-flight)나 LC-MS/MS(liquid chromatography-ion-spray tandem mass spectroscopy) 이 단백질은 분석하는 새로운 방법으로 개발되어 난소암 환자의 혈청에서 100% 민감도와 95% 특이도를 갖는 진단방법이 만들어 졌다.⁵⁴⁾
   Proteomics는 종양 환자의 혈청에서 쉽게 발견될 수 있는 자가 항체를 검출할 수 있는데 이것도 종양의 조기진단에 이용 될 수 있다.
   Annexin과 RS/DJ-1을 발견하여 환자의 혈청에서 검출하여 정상 대조군에서 보다 유방암과 대장암에서 유의하게 상승되어 있다는 것을 확인하였다. 이러한 종양 항원은 앞으로 종양의 면역치료에도 이용 될 수 있다고 하겠다.

미래의 연구 방향
   한해에 수천 개의 논문이 다양한 종양의 유전적 변화나 발현변화에 대하여 발표되나 임상에서 이용될 수 있는 믿을만한 분자 생물학적 표지자는 몇 개가 되지 않는다. 따라서 이런 표지자는 방사선학적인 방법, 조직학적인 방법 등의 다른 기존의 진단방법과 같이 사용하여 진단과 치료 등에 이용하는 것이 앞으로 종양의 조기진단과 더불어 치료 효과를 극대화시킬 수 있는 방법이라고 생각된다. 또한 새로운 기술을 이용한 좀더 믿을만한 종양 표지자의 발견도 병행하여야 할 것이다.
   이러한 표지자의 민감도와 특이도는 많은 수의 종양샘플과 정상대조군의 실험을 거친 후에야 알 수 있으므로 새로운 종양표지자의 발견은 임상실험과 동반하여야 한다.
   또한 환자의 샘플에서 암 전구 병소가 종양으로 진행하는 시기를 알 수 있는 검사방법이 중요하므로 임상결과와 같이 조직은행의 활성화 하는 것도 중요하다고 하겠다.
   새로운 종양표지자의 발견은 분자 생물학자와 임상의사 들의 긴밀한 협조하에서만 발전할 수 있고 많은 수의 표지자 들을 실제 임상에 모두 적용하기에는 비용과 시간 면에서 어렵기 때문에 새로운 표지자를 발견할 수 있는 신기술과 기존의 표지자를 경제적으로 검사 할 수 있는 방법이 필요하다고 하겠다.

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