교신저자：신승헌, 705-718 대구광역시 남구 대명4동 3056-6  대구가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   진균성 부비동염은 20세기 중반이후 알려지기 시작하였으며, 1983년 Katzenstein 등¹⁾이 부비동 내 존재하는 Aspergillus가 만성 부비동염을 유발한다는 보고와 함께 알레르기성 진균성 부비동염이란 질병을 소개하였다. 알레르기성 진균성 부비동염과 만성 부비동염의 면역학적 발병기전은 잘 알려져 있지 않으나 알레르기성 진균성 부비동염의 경우 혈중 총 IgE의 증가, 진균에 대한 특이 IgE와 IgG의 증가, 알레르기성 점소, 비용, 비즙 진균의 검출 등의 진단 기준을 가지고 있다.¹⁾²⁾ 수술적 치료를 시행한 만성 부비동염 환자의 6~7%를 차지하는 것으로 알려져 있다.³⁾
   알레르기성 진균성 부비동염 뿐 아니라 대부분의 만성 부비동염의 경우 조직과 비즙에서의 호산구가 증가하는 병리학적 특징을 가지고 있다.⁴⁾ 이들 호산구는 eosinophil cationic protein(ECP), major basic protein(MBP) 등의 세포 독성 단백질을 유리하여 이들 질병의 발병기전에 관여한다. Ponikau 등⁵⁾은 만성 부비동염 환자의 호산구 증가는 조직 내와 비즙에서 관찰 할 수 있는데 조직 내 호산구는 정상적인 형태를 유지하고 있으나 비즙 내 호산구는 대부분 활성화되어 다량의 MBP를 유리하고 세포의 파괴가 이루어져 이들 호산구들이 비즙 내에 존재하는 진균에 대한 방어기전에 관여 할 것이라는 주장을 하였다.
   지금까지 알려진 진균은 약 10만 종에 달하고 이중 200여 종만이 병원성이 있는 것으로 알려져 있다. 20여 종이 전신감염을 일으키며 그 중 Alternaria, Cladosporium, Aspergillus 등이 호흡기 질환과 연관이 있는 것으로 알려져 있다.⁶⁾⁷⁾ 진균성 감염은 면역기능이 정상이거나 저하된 환자에서 발생되는 진단과 치료가 어려운 질환으로, 최근 악성종양, 장기이식, 당뇨 등의 대사장애 질환, 항생제 남용, 후천성 면역결핍증 환자의 증가로 진균 감염이 증가하고 있는 추세이다. 진균에 의한 질병은 직접적인 감염, 진균에서 분비되는 독소, 알레르기 반응 등이 관여하며, 국소적인 환경, 감염된 진균의 양과 독성, 개체의 면역상태 등에 따라서 진균에 대한 인체의 반응이 결정된다.⁸⁾ 진균은 다양한 단백 성분과 효소들로 이루어져 있는데 이로 인해 인체 Th2 림프구의 활성화가 유도되고 호흡기 점막 방어능력이 손상되어 병적 상태를 초래하게 된다.⁹⁾
   이 연구는 만성 부비동염과 알레르기성 진균성 부비동염에서 공통적으로 보이는 호산구의 증가와 활성화가 진균과 연관성이 있는지 알아보고자 하였다. 이에 비강에서 흔히 발견되는 진균으로 호산구의 활성화를 유도하였으며, 이들 호산구의 활성화 기전을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

   알레르기 및 최근 3개월 이내 부비동염 등의 병력이 없는 정상인의 말초혈액에서 호산구를 분리하여 다섯 가지의 진균(Alternaria alternata, Aspergillus versicolor, Candida albicans, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum)으로 자극하였으며(Greer Lab, Lenoir, NC), 활성화 억제는 serine protease inhibitor와 cystein protease inhibitor를 사용하였다.

호산구의 분리 및 배양
   호산구는 정상인의 heparin 처리된 말초 혈액을 PIPES (Sigma, St. Louis, MO) 완충액과 혼합하여 Percoll액 위에 놓고 원심분리하여 과립구와 적혈구 층을 분리하였다. 적혈구는 삼투성 파괴법을 이용하여 제거하였다. 이렇게 얻어진 호산구와 호중구를 항-CD16 항체로 30분 처리한 후 magnetic cell separation 방법(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)으로 호산구를 분리하였다. 호산구의 순수도는 Randolph 염색을 하여 95%이상이었고, trypan blue를 이용한 생존율 검사에서 98%이상임을 확인하였다.

진균에 의한 호산구의 활성화 
   분리된 호산구는 50, 100 μg/ml의 진균을 이용하여 자극하였으며, 양성 대조군으로 1 ng/ml의 phorbol myristate acetate(PMA)으로 자극하였고, 음성 대조군은 자극 물질 없이 호산구를 배양하였다. 호산구를 진균을 포함하는 hank’s balanced salts solution(HBSS)(Sigma, St .Louis, MO)에 넣고, 37℃, 5% CO₂에서 4시간동안 배양하면서 superoxide와 eosinophil derived neurotoxin(EDN)을 측정하여 호산구 활성화 여부를 결정하였다.¹⁰⁾ Superoxide 측정 방법은 cytochrome c의 superoxide dismutase 억제 반응을 이용하였다. 5×10⁵개의 호산구를 100 μM의 cytochrome c를 포함하는 HBSS에 넣고 진균과 반응시켰다. 반응 직후부터 microtiter plate reader(Thermomax, Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 흡광도를 측정하였으며, cytochrom c에 의한 superoxide anion 상관계수 21.1×10³ cm^-1M^-1을 이용하여 10⁵개의 호산구에서 배출되는 superoxide의 량(nM)을 결정하였다.
   EDN은 호산구 배양 4시간 후 얻어진 상등액에서 방사선 면역측정법(RIA)을 이용하여 측정하였다. RIA는 radioiodinated EDN, rabbit anti-EDN, burro anti-rabbit IgG를 이용한 double-Ab competition 분석 방법을 사용하였다.
   호산구 활성화 억제는 진균을 단백질 분해효소 억제재와 37℃ 5% CO₂에서 30분 간 전 처리한 후 호산구와 반응을 유도하였다. 사용된 단백질 분해효소 억제재는 serine protease inhibitor인 phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 4-[2-Aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride(Pefabloc^®)을 사용하였으며, cystein protease inhibitor로는 N-[N-(1-3-Trans-carboxirane-2-carbonyl)-L-leucyl]-agmatine(E-64)를 사용하였다.

통계 분석
   각각의 실험은 5회 이상 반복하여 그 결과를 얻고자 하였으며, 통계학적 분석은 유의수준 0.05의 Mann-Whitney U test를 이용하였다.

결     과

   다섯 가지 진균으로 호산구를 자극한 경우 Alternaria와 Cladosporium은 superoxide 생성을 강하게 유도하였으며, 생성된 superoxide의 양은 자극한 진균의 농도와 반응 시간의 증가에 따라 유의하게 증가되는 소견을 보였다(Fig. 1). 그러나 Alternaria에 의해서만 호산구의 EDN 생성이 이루어졌다(Fig. 2).
   Alternaria에 의해 이루어진 superoxide와 EDN 생성은 serine protease inhibitor(PMSF, Pefabloc^®)에 의해 억제되었으나(Fig. 3), cystein protease inhibitor인 E-64는 호산구 활성화를 억제하지 못 하였다. PMSF 1 mM/ml에서는 Alternaria 100 μg/ml에 의해 생성된 superoxide가 반응 3시간 후 39.7% 억제되었고, EDN의 생성은 6번의 실험에서 4번(66.7%) 억제되었다. 4 mM/ml의 Pefabloc^®을사용한 경우는 반응 후 3시간이 지나 38.9%의 superoxide 생성 억제와 100%의 EDN 생성 억제효과를 보였다.

고     찰

   호흡기 점막은 미생물 등의 항원의 침입을 막기 위한 효율적이고 특이한 기능과 구조를 가지고 있다. 공기 중에는 각종 진균들이 인체에 해를 미치지 않는 상태에서 집락을 형성하고 있다가 호흡기 점액섬모운동의 장애로 병원체의 배출에 장애가 생기는 경우, 호흡기 점막에서 생성되는 각종 효소와 살진균성 단백물질에 이상이 있는 경우, 인체의 항원-항체 반응이나 면역 방어기전에 이상이 생긴 경우 질병을 유발하게 된다.⁸⁾¹¹⁾ 진균에 의해 흔히 발생되는 질환은 기관지 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 진균성 부비동염 등이 있다.
   Katzenstein 등¹⁾이 allergic Aspergillus sinusitis를 보고하여 진균이 부비동염의 원인이 될 수 있음을 알게 되었으며, 그 후 Aspergillus 외 다양한 진균들이 부비동염과 관련 있음이 밝혀지면서 알레르기성 진균성 부비동염이라는 용어를 사용하게 되었다. Ponikau 등⁵⁾은 알레르기성 진균성 부비동염의 진단 기준을 전산화단층촬영으로 만성 부비동염이 존재하고, 알레르기성 점소가 있으며, 비즙에서 진균이 배양되거나 조직검사에서 진균이 확인 된 경우로 하여 전향적 연구를 시행한 결과 만성 부비동염 환자의 93%를 알레르기성 진균성 부비동염으로 보고하였다. 진균의 경우 만성 부비동염 환자의 96%, 정상인은 100%에서 배양되었고, 진균의 분포와 양성 배양률에는 차이가 없다고 하였다. 이처럼 모든 사람의 비강에 진균이 존재하지만 만성 부비동염 환자의 경우 정상인과 다른 진균에 대한 면역반응을 보임으로서 부비동염을 유발할 것으로 추측하였다. 이 연구에서는 Ponikau⁵⁾와 Shin 등¹²⁾의 보고에서 처럼 만성 부비동염과 정상인의 비강에서 흔히 배양되는 다섯 가지의 진균(Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Candida)을 이용하였다.
   Khan 등¹³⁾은 알레르기성 점소에 많은 양의 MBP와 진균이 포함되어 있다고 보고하였으나 이들 세포독성 단백물질의 분비 기전은 알려진 바가 없다. 호산구의 증가와 활성화는 조직 및 상피세포의 손상을 유발하고 지속적인 염증 반응을 초래하게 된다. 진균은 다양한 단백질과 단백질 분해효소를 함유하고 있어 호흡기 염증 반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며 특히 Aspergillus, Alternaria는 기관지 천식을 악화시키는 주요 인자로 알려져 있다.⁶⁾⁷⁾ 저자들의 경우 비강에서 흔히 배양되는 진균 중 Alternaria와 Cladosporium이 superoxide의 생성에 관여하였고, Alternaria는 EDN 생성에도 관여하여 특히 Alternaria가 호산구의 활성화에 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었다. 즉 비강 내 존재하는 Alternaria가 알레르기성 진균성 부비동염이나 만성 부비동염 환자의 비강에 증가된 호산구를 활성화 시켜 세포독성 단백물질을 유리시키고 이로 인해 비강 상피세포의 손상이 초래되어 더 많은 병원성 항원의 침입을 유도하게 되어 염증의 만성화에 영향을 미치게 됨을 추측할 수 있었고, Cladosporium의 경우 superoxide의 생성은 증가시켰으나 EDN의 생성을 유도하지 못한 것으로 보아 호산구의 활성화에 의한 superoxide와 EDN의 생성 과정이 서로 다른 것을 알 수 있었다.
   Tomee 등¹¹⁾¹⁴⁾은 진균과 집먼지 진드기에 포함되어 있는 단백질 분해효소가 호흡기 상피세포를 활성화 시키고 손상시키며, 특히 Aspergillus fumigatus는 알레르기성 기관지 폐 질환의 중요한 원인이 된다고 보고하였다. 진균의 단백질 분해효소가 호흡 상피세포의 탈락을 유도하거나 직접 상피세포를 활성화 시켜 IL-6, IL-8 등의 화학매개물질의 생성을 유도하여 호흡 상피세포의 방어기전에 장애를 초래하고 진균에 대한 노출이 증가되어 염증 반응이 촉진된다. Alternaria는 heat shock protein, ribosomal protein, aldehyde dehydrogenase 등 10여 종의 항원으로 구성되어 있다.¹⁵⁾ Alternaria 100 μg/ml는 trypsin 250 ng/ml와 유사한 단백질분해효소 능력을 가지고 있다(data not shown). 이 연구에서 진균에 의한 호산구의 활성화가 serine protease inhibitor에 의해 억제됨을 확인할 수 있었는데 이는 진균이 가지고 있는 serine protease가 호산구 세포벽에 존재하는 단백질 분해효소 수용체와 결합함을 추측할 수 있다. Miike 등¹⁶⁾은 serine protease인 trypsin이 호산구를 활성화하는 과정에 protease-activated receptor 2(PAR2)가 관여하는 것으로 보고하였다. G-protein coupled receptor의 일종인 PAR는 조혈세포에 분포하여 단핵구, T-림프구와 혈소판 등의 혈액 응고반응에 관여하고, 그 외 각화세포, 혈관 내피세포, 소화기 상피세포, 소화기 근세포, 췌장 선포세포에 존재하는 것으로 알려져 있으나 그 정확한 기능에 대해서는 알려진 바가 없다.¹⁷⁾¹⁸⁾ Alternaria에 의한 호산구 활성화가 serine protease inhibitor에 의해 억제되는 것으로 보아 PAR2가 진균에 의한 호산구 활성화 과정에 관여할 것으로 추측할 수 있다. 향후 진균의 호산구 활성화에 PAR가 관여하는 지에 대한 연구가 필요할 것이다.

결     론 

   만성 부비동염과 정상인 비강에서 흔히 배양되는 진균 중 특히 Alternaria가 호산구 활성화에 관여 하는 것을 알 수 있었으며, 이 과정에 진균에 포함되어 있는 serine protease가 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었다. 만성 부비동염의 경우 여러 가지 원인에 의해 조직과 비즙 내 호산구가 증가되고 특히 비강으로 이동한 호산구는 비강 내 존재하는 진균 특히 Alternaria에 의해 활성화되고 각종 세포독성물질을 분비하여 비강의 염증 반응을 유지 악화시킴을 알 수 있었다. 그러나 이 연구에서 사용된 진균은 비강에서 배양된 것이 아니라 상업적으로 생산된 것으로 비강 내에 존재하는 진균과 항원 역가에 차이가 있을 것이고, 생산 과정에 진균 항원 특성의 소실, 변화가 초래될 수 있다는 한계를 가지고 있다. 또 비강 내 존재하는 진균의 농도가 본 실험에서 사용된 진균의 농도와 연관성이 있는지에 대해서도 계속적인 연구가 필요할 것이다.

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