서     론

   생체조직공학(tissue engineering)은 생명과학과 공학의 개념이 합쳐지면서 탄생한 새로운 분야로 조직을 재건하는데 근간이 되는 세포와, 세포의 증식을 위한 생체재료, 그리고 세포가 자랄 수 있는 미세환경을 적절히 조작하여 원하는 기능을 가진 생체 조직으로 재생시키는 응용 학문을 말한다.
   인체의 조직 중에서 연골은 외상, 류마티스 관절염 등에 의해 쉽게 손상되고 선천적 기형, 종양 제거 등으로 인해 대체가 필요한 반면, 쉽게 재생되지 않고 대체할 수 있는 연골은 항상 제한되어 있다는 점 때문에 조직공학적 연골생성의 필요성이 대두되었다. 조직공학적 연골생성의 개념은 화학 조성과 물리적 배열이 다른 생체 적합성, 생분해성 고분자지지체(polymer scaffold)에 체외 배양한 연골세포를 높은 밀도로 주입하여 동물이나 사람에게 이식하면 혈관이 형성되고 세포가 성공적으로 결합되어 새로운 조직이 형성된다는 것이다(Fig. 1). 최근의 연구 경향은 지지체에 주입하는 세포로 다능성을 가진 여러 줄기세포(stem cell)에 대한 연구와, 가장 적절한 3차원 지지체를 만들기 위한 생체재료의 연구, 그리고 생성된 신생연골의 임상적 적용을 위한 분석방법에 집중되고 있다.
   본 논문은 조직공학적 연골생성의 개요와 함께 최신 경향의 연구들에 대한 고찰을 통해 앞으로 조직공학을 이용한 연골생성의 발전 방향과 국내에서의 연구 방향에 대해 제시하고자 한다.

조직공학적 연골생성의 개요

조직공학이란?
   조직공학은 조직을 재건하는데 근간이 되는 세포를 높은 밀도로 세포의 증식을 위한 적절한 생체재료에 주입하고, 세포가 자랄 수 있는 미세환경을 조작하여 원하는 기능을 가진 생체 조직으로 재생시키는 응용 학문을 말한다.
   조직공학은 생명과학과 공학의 기본 개념과 기술을 통합 응용하여 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고 나아가서 생체조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 우리 몸의 기능을 유지, 향상, 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 따라서 조직공학은 생물학적 대체물의 재생에 적용되는 학문간 상호 협조가 필요한 분야이며,¹⁾ 세포 생물학, 유전자 공학, 의료용 재료 등 많은 관련된 연구의 발전이 이 분야 발전의 기본이 된다. 
   조직공학은 여러 가지 세포의 상호작용을 염두에 두고 생체조직과 기관을 만드는 기초적인 연구에서 시작하여 조직 및 기관을 재 구축하여 의료에 이용하는 응용 연구로서 최근 활발히 진행되고 있는 연구 분야이다.

조직공학의 의학에서의 의의
   역사적 고찰에 따르면 1908년 Erik Lexer가 사체에서 얻은 무릎관절을 이식한 것이 조직공학의 시초라고 할 수 있다.²⁾ 이후로 기능을 잃은 팔다리, 치아, 연조직 등을 인공 물질로 대체하기 위한 많은 시도가 있었지만 삽입물의 이동, 감염, 이식 거부 반응 등의 문제가 있었다.²⁾ 
   인체의 조직 및 장기는 여러 가지 종류의 세포가 고도로 조직화되어 형성되어 있어 인공적으로 만드는 것은 상당히 어려운 일이다. 조직공학을 이용한 인공장기는 의학의 여러 분야에서 응용될 수 있는데, 대표적인 것으로 인공피부, 인공뼈, 인공췌장, 인공간장, 인공혈액 등이 있다. 이 외에도 연골, 점막, 각막, 신경, 심장, 근육, 인대 등의 조직공학적 접근과 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 아직은 인공조직의 생성은 몇 가지 종류의 세포가 간단한 고차 구조의 기능을 발휘할 수 있는 조직 및 기관의 형성에 한정되어 있고, 많은 종류의 세포가 고도로 발달된 고차 구조를 형성하고 있는 기관 및 장기는 아직 조직공학적으로 접근하기 어려운 실정이나 많은 아이디어와 노력이 계속되어 질 것으로 생각된다. 

생체재료 및 조직공학 관련 국내외 동향 
   현재 미국의 경우 133개 대학에서 관련 학과 및 프로그램이 운영되며 참여 교수 및 관련 연구소에서 활발한 연구 활동을 진행하고 있다. 조직공학의 분야 중 가장 먼저 개발된 인공 피부는 이미 실용화에 들어갔다. 소의 진피에서 얻어진 콜라겐으로 인공 피부를 만들었고 FDA의 사용 허가를 받은 상태이다. 미국 젠자임사의 무릎 관절용 연골은 FDA의 승인을 받아 시판되고 있다. 연골 배양과 관련된 인공 귀는 이미 설계가 끝난 상태이고 임상 실험을 준비 중이다.
   국내에서는 여러 대학과 연구소, 기업들이 주축이 되어 조직공학을 주도하고 있다. 서울대 의용공학과에서는 인공심장, 인공팔 등 주로 전기,전자 공학적 인공장기를 개발하고 아주대 의용공학과는 생체재료와 관련된 조직공학분야를, 광주과학기술원 신소재공학과는 인공췌장과 생체재료 및 DDS(drug delivery system)를 연구하고 있다. KIST 의과학연구소는 인공뼈, DDS, 인공간 연구를, KIST 고분자연구부는 고분자 생체재료, 치과 재료 연구를, 한국화학연구소 및 원자력병원연구소는 고분자 생체재료 연구 및 인공피부, 인공조직연구를 활발히 하고 있다. 
   사람과 동물의 세포를 채취해 인공장기를 제조하거나 연골, 뼈, 근육 등 갖가지 장기 조직을 부품화하는 조직공학산업에 대한 관심이 높아지면서 DNA 칩이나 신약 개발에 힘을 쏟아온 바이오벤처기업들이 앞다퉈 조직공학 연구 개발에 뛰어들고 있다. 조직공학이 관심을 끄는 것은 유전자 치료로 해결할 수 없는 질병을 새로운 장기나 조직으로 완전히 교체해 생명을 연장할 수 있어 향후 엄청난 시장을 형성할 것으로 예상되기 때문이다. 바이오메드랩은 최근 세포 연구센터를 설립하여 줄기세포 전문가 송희경 박사와 함께 체내이식형 심실보조장치(IVAD：Implantable Ventricular Assist Device)와 인공심장(KORTAH：Korea Total Artificial Heart)의 상품화를 진행하고 있다. 화장품 원료 개발기업인 바이오랜드도 동국대, 중앙대와 함께 환자 이식용 인공피부와 인공각막 등의 사업을 확장하고 있다. 의료장비 기업인 솔고바이오메디칼은 자회사 엠아이텍을 통해 인조혈관용 스텐트를 개발하면서 조직공학산업에 진출했으며, 의료용 시술재료 전문기업인 한스바이오메드도 대덕벨리에 국내 최대 규모의 조직공학연구소를 준공하였다.

조직공학적 연골생성의 중요성
   연골의 조직공학적 생성이 의학적으로 중요한 이유는 여러 가지가 있다. 인체의 관절을 이루고 있는 연골은 외상이나 류마티스 관절염 같은 염증반응에 의하여 쉽게 손상이 되지만 체내에서 쉽게 재생이 되지 않아 치료에 어려움을 겪고 있다. 또한 기형 등으로 인한 무이증(anotia), 소이증(microtia) 등의 환자들의 이개연골의 대체를 위해, 기관지 협착이나 종양 등으로 인하여 기관지를 절제할 경우 기관지를 대체하기 위하여, 외상, 종양 등으로 코, 귀 등을 절제할 경우 재건을 위해서 다른 부위의 연골을 얻어 자가이식 하는 방법이 사용 되었으나 자가이식을 위해 얻을 수 있는 연골의 양은 한정되어 있다. 만일 체내에서 채취한 연골세포로 체외배양 방법을 통해 자연연골(native cartilage)과 동등한 많은 양의 연골을 얻을 수 있다면 위와 같은 경우에서 아주 유용하게 쓰일 수 있다. 조직공학적으로 생성한 인공연골의 필요성은 이러한 현실에서 유래된다. 

조직공학적 연골생성의 기본개념 
   1970년대 W.T. Green 박사가 연골세포가 포함된 골아세포를 누드 마우스에 이식한 실험을 한 이후로 세포를 합성지지체에 넣고 생체에 이식하여 새로운 기능의 조직을 발생시킬 수 있다는 개념이 생겨났다. 이후로 많은 생체 적합성 물질이 탄생하였고, 조직공학을 이용한 연골 재생이 가능하게 되었다. 
   연골에서 유일한 세포 형태인 연골세포는 사체에서도 쉽게 분리될 수 있다. 연골세포는 낮은 산소 요구량을 가지고, 확산에 의해 영양분을 공급 받으며 생명력을 유지할 수 있기 때문에 적절한 배양액 내라면 체외에서도 생명력을 유지한 채 몇 주 동안 보관될 수 있다. 이러한 연골 세포들을 이용하여 조직공학으로 새로운 연골을 생성하기 위해서는 몇 가지 조건이 선행되어야 한다. 첫째 체내에서는 잘 증식되지 않는 연골세포가 잘 증식되고, 외형적으로나 구조적으로 최초의 표현형(phenotype)을 잘 유지할 수 있는 세포 환경을 만드는 것이 중요하다. 둘째, 고분자지지체에 주입할 세포의 최적의 분율을 결정하여야 한다. 셋째, 세포를 부착시키는 고분자지지체가 물리적 형태를 정확히 유지하면서, 확산을 통해 세포에 최적의 영양분을 제공해 줄 수 있어야 한다. 이러한 세 조건이 최적화된 경우 연골세포와 생분해성, 생적합성(biocompatible) 고분자지지체의 템플리트(template)를 동물에 이식하여 새로운 연골이 생성되는지 평가하게 된다. 생분해성 고분자 섬유들은 4주 정도 체외에서 배양된 후에는 녹기 시작하며 체내에 이식된 후로는 생분해되어 연골에 의해 점차 대체되게 된다. 

고분자지지체
   연골의 생성을 위한 이상적인 고분자지지체의 조건에는 몇 가지가 있다.^2)3)19) 첫째, 생적합성을 유지할 수 있어야 한다. 지지체는 체내의 염증반응에 의해 녹지 않아야 하며, 면역 반응을 일으키지 않고, 독성이 없어야 한다는 것을 의미한다. 둘째, 기계적 특성(mechanical properties)을 유지할 수 있어야 한다. 주변의 압력과 영향에 의해 압축되거나, 탄성이 변하거나, 뒤틀어지지 않으면서 새로운 조직의 생성을 위한 구조적 안정화를 유지하여야 한다. 셋째, 구성 물질이 세포가 잘 정착하고 자랄 수 있도록 도와주어야 한다. 연골세포를 단층(monolayer)에서 배양시키면 본래의 표현형(phenotype)을 잃고 섬유아유사세포형(fibroblast-like phenotype)으로 전환되고 다른 종류의 세포외기질(extracellular matrix)의 물질을 분비하게 되며 제 1 형 콜라겐을 우위적으로 생산한다. 따라서 확산을 통해 연골세포에 최적의 영양분을 제공해 줄 수 있어야 하며, 세포가 고유의 표현형을 유지하면서 3차원 구조에 골고루 분포되고 세포외기질을 분비하여 자연연골과 같은 성질을 지니는 연골을 재생시킬 수 있도록 하여야 한다. 넷째, 지지체가 생분해되면서 연골의 재생을 촉진시켜야 하는데, 이때 생분해되는 속도가 적절하여야 한다. 이 외에도 지지체는 쉽게 무균 상태로 사용될 수 있어야 하며, 이식 시간이 길거나 온도 변화가 심해서도 안되며, 쉽게 다룰 수 있는 물질이어야 한다.
   많은 생분해성 고분자를 조직 지지체의 재료로 사용하는데 그 중 한 예가 뼈를 형성하기 위해 골수나 골막에서 분리된 골전구세포(osteoprogenitor cell)를 결합시킬 수 있는 다공성의 물질인 hydroapatite이다.²⁾ 다른 합성고분자 또한 많이 사용되는데 다루기 쉽고, 생분해 속도를 조절할 수 있는 합성고분자가 각광 받고 있다. 고분자지지체는 주로 섬유망(fibrous mesh)이나 다공성 스폰지, hydrogel의 형태를 취하게 되는데 여기엔 linear polyesters인 polyglycolic acid(PGA), polylactic acid(PLA), polycarpolactone(PCL)이나, polyethylene glycol(PEG) 등의 합성폴리머나, 또는 collagen, hyaluronic acid 등의 자연폴리머가 있다. 특히 polymeric hydrogel은 주사할 수 있어 덜 침습적이고, 위험률이 낮은 등 많은 장점을 가지고 있다.

선진국의 최신 연구 동향

세포 자원으로서의 줄기세포(stem cell)의 이용

줄기세포
   조직공학적 연골의 생성을 위해서 사용할 수 있는 세포에는 크게 두 가지가 있는데 완전 분화가 끝난 연골세포와 줄기세포에서 새로이 분화된 연골세포가 그것이다.⁴⁾ 이 중 줄기세포는 조직공학을 획기적으로 발전시킬 수 있는 잠재성이 있다. 수정된 초기 배아로부터 얻는 배아줄기세포는 적절한 체외배양 조건 하에서 무한대로 증식할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 인체를 구성하는 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있어 조직공학자들에게 가장 좋은 세포의 형태이다. 그러나 윤리적인 문제가 있고, 단개체 배아에서 얻을 수 있는 양이 극미량이어서 한계가 있으며 세포의 반응을 조절하기가 어렵다.
   성체줄기세포는 충분한 양만큼 얻기 힘들지만 그 중 조혈모 줄기세포는 탯줄의 제대혈에서 얻을 수 있어 현재 몇몇 기업에서 냉동 보관하였다가 사용하는 형태를 취하고 있다. 조혈모 줄기세포는 체외배양에서 증식되지 않고 생존하지 않으므로 현재의 배양방법이 개선되어야 한다. 성체줄기세포는 현재로서는 다능성(pluripotency)이 매우 제한적이고 줄기세포는 이식하는 동안에 노출되는 서로 다른 미세한 영향에 의해 변화될 수 있어, 만약 치료응용 중에 본성을 조절할 수 없는 변화가 세포에 나타난다면 조직복원 중에 변성세포의 출현 위험이 있다. 
   골수유래의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)는 다른 세포에 비해 분리 정제와 대량 배양이 비교적 용이해 널리 연구되고 있다. 간엽줄기세포는 골수 내에서 10 4~10 5의 단핵세포(mononuclear cell) 중 1개 정도의 아주 낮은 농도로 존재하는데 뼈, 연골, 근육, 지방세포 등으로 분화할 수 있는 다능성을 가지고 있다.⁵⁾ 간엽줄기세포는 두 가지의 목적으로 조직공학에서 쓰일 수 있다. 첫째 체내에서 단백질을 분비하기 위한 세포 공장으로서의 역할을 하는 것인데, 이것은 체내에 이식되기 전에 어떠한 단백질, 예를 들어 IL-13 등을 분비하기 위한 유전자 전사를 유도함으로써 가능하다.⁶⁾ 둘째로 간엽줄기세포의 다능성을 이용하여 필요한 부위에서 손상된 조직의 재생을 위해 쓰일 수 있다. 예를 들면 골의 결손부위에 BMP-2를 형성하도록 조직공학으로 유도된 간엽줄기세포를 이식하면 뼈가 형성되는 것을 관찰할 수 있고⁷⁾ 혈청 없이 전환성장인자(transforming growth factor)와 함께 배양하면 연골로 분화된다.

골수 유래 간엽줄기세포의 이용
   생체실험에서 손상된 연골의 재생을 위해 간엽줄기세포를 이용한 연구가 동물모델을 이용하여 시행되었다. 동종(allogenic) 염소의 간엽줄기세포를 골수에서 채취하여 hyaluronan carrier와 함께 반월판이 제거된 염소의 무릎에 주사하여 반월판 조직의 재생을 관찰하였는데, 염증이나 거부반응이 없이 재생된 연골은 관절면을 잘 유지하며 잘 파괴가 되지 않고, 골흡수와 골증식체 형성(osteophyte formation) 또한 잘 되지 않았음을 확인하였다.⁸⁾⁹⁾ 골수 유래의 간엽줄기세포를 체외 배양하여 환자들의 무릎 관절에 주사하여 분석하는 임상실험에서는 대조군에 비해 치료군이 관절경의 소견이나 조직검사 소견이 더 좋은 것을 확인하였다.⁹⁾ 또한 간엽줄기세포를 세포간 접촉 및 TGF-β1 과 human BMP-2 같은 인자로 자극시켜 배양 5일째 세포기질에서 제 2 형 콜라겐을 발견할 수 있었다. Caplan 등¹¹⁾은 골수 유래의 간엽줄기세포를 토끼의 대퇴 관절융기(femoral condyle)에 이식한 실험에서 4주 후에 제 1 형 콜라겐에 에워 싸인 간엽줄기세포를 발견할 수 있었다. 6개월 후 재생된 연골은 숙주조직(host tissue)과 연결되지 못하였지만 연골의 변두리를 트립신(trypsin) 처리함으로써 숙주조직이 재생된 연골로 침투할 수 있도록 도와줄 수 있었다. 신생연골은 손상된 부위를 채울 수 있도록 성장할 수 있으며 조직학적 분석에서 정상연골과 비슷하나 기계적 특성면에서는 정상연골의 1/2 정도의 탄성(compliance)을 보였다. 또한 재생된 연골이 배양이 진행될수록 점점 얇아짐을 관찰하였다. 
   이상을 종합하면 간엽줄기세포는 조직공학적 연골의 재생을 위해 유용하게 쓰일 수 있으나 간엽줄기세포의 많은 생물학적 기본 특성들이 더 밝혀져야 하며, 배양 방법과 기계적 특성을 보강하기 위한 많은 과제가 남아있다.¹²⁾ 또한 특정 세포로의 분화를 위해 기원세포(progenitor cell)와 미세환경의 역할들에 대해 더 많은 이해가 요구된다고 하겠다. 

지방세포에서 연골세포로의 전환
   지방은 골수 유래의 줄기세포보다 덜 침습적인 방법으로 많은 양을 얻을 수 있어 조직공학적 연골생성을 위해 관심이 집중되고 있다. 사람의 지방 흡입물에는 다능성 지방간엽줄기세포(pluripotent adipose-derived mesodermal stem cell)가 있는데 골세포, 연골세포 등의 다른 세포로 전환될 수 있다.¹³⁾ Huang 등¹³⁾은 쥐의 서혜부 지방 조직이 인체 지방 유래의 간엽줄기세포와 비슷한 간엽줄기세포를 가지고 있고, 연골세포와 골아세포로 전환할 수 있다는 가정 하에 실험을 하였다. 쥐의 서혜부 지방 조직에서 섬유아세포 유사세포(fibroblast-like cell)을 채취하여 골아세포로의 분화를 유도하기 위해 dexamethasone, ascorbic acid, beta-glycerol phosphate를, 연골세포로의 배양을 유도하기 위해 TGF-β1, insulin, transferrin, ascorbic acid를 포함한 배지에서 배양하였다. 골아세포로의 유도배지에서는 2주, 4주, 6주 후에 배양된 세포를 모아 alkaline phosphatase의 활성을 측정하고 Von Kossa 염색을 하여 지방의 간엽줄기세포가 골형성성 분화(osteoblastic differentiation)와 함께 석회화된 세포외기질을 생산하였음을 확인하였다. 연골세포로의 유도배지에서는 2일, 7일, 14일 후에 배양된 세포를 모아 alcian blue 염색과 제 2 형 콜라겐에 대한 면역화학검사를 하여 연골형성성 분화(chondrogenic differentiation)를 하였음을 확인하였다. 
   Erickson 등¹⁴⁾은 인체의 피하지방에서 유래하는 간질세포(stromal cell)를 alginate에서 배양한 후 누드마우스에 이식하여 시험관 내와 생체 내 모두에서 제 2 형 콜라겐을 포함한 특징적인 연골의 기질을 생성하는 것을 확인하였다. 
위와 같이 최근 지방유래의 세포를 이용한 신생연골의 생성에 관한 많은 논문들이 보고되고 있지만 신생연골이 자연연골과 가까운 역학적 성질을 지니도록 하기 위해 배양 기술 및 사이토카인에 대한 많은 연구가 필요하다.

고분자지지체

자연폴리머(Natural derived polymers)
   고분자지지체의 이상적인 조건을 만족하는 중합체 중에는 자연폴리머인 콜라겐, fibrin, alginate, hyaluronic acid 등이 있다.³⁾ 콜라겐을 연골세포의 증식과 연골의 재생을 위한 기질로 사용한 많은 보고들이 있다. 소의 콜라겐 스폰지인 Helistat는 현재 사람에서 지혈을 돕고 상처의 위축을 방지하기 위한 용도로 사용되고 있는데 Wambach 등¹⁵⁾은 개의 갑상연골에서 연골세포를 분리하여 소의 제 1 형 콜라겐인 Helistat에 이식시켰을 때 연골세포가 표현형을 잘 유지하면서 연골의 구성 물질인 제 2 형 콜라겐을 형성함을 발견하였다. 소의 제 1 형 콜라겐이 사람에게 사용될 때 과민반응을 일으킬 수 있으나, 그 발생률은 극히 낮아 소의 제 1 형 콜라겐이 조직공학의 연골재생의 기질로서 쓰일 수 있을 것으로 분석하였다. 그러나 콜라겐 젤은 연골세포의 증식이 잘 이루어지지 않는 단점이 있어 연골세포가 이식된 콜라겐 젤에 hyaluronic acid를 첨가하여 배양하였는데, 배지에서 형성된 연골은 연골세포와 chondroitin sulfate의 합성이 증가되었다.¹⁶⁾ 현재 많이 연구되고 있는 atelocollagen은 제 1 형 콜라겐의 펩티드 사슬에서 항원 결정기(antigenic determinant)을 제거하여 염증반응을 덜 일으키는 장점이 있다.¹⁷⁾
   Fibrin도 지지체로 연골세포와 함께 누드 마우스에 주사하면 자연연골과 조직학적, 기능적으로 유사한 연골을 형성할 수가 있다.¹⁸⁾²⁰⁾ 그러나 fibrin 복합체로 생성된 연골은 지지대 역할을 해야 하는 곳에서 생화학적 지지(biochemical support) 역할을 잘 하지 못하였다.¹⁹⁾ 한편 fibrin과 alginate의 복합체에 연골세포를 이식시켜 연골세포가 증식되고 분화되는데 적합한 환경이 될 수 있음이 보고되기도 하였다.²¹⁾ Fibrinogen과 thrombin은 연골세포와 함께 조직에 주사되어 생분해성 지지체로서 쓰일 수 있는데 이것은 환자 자신의 fibrinogen과 thrombin를 이용하므로 생적합성과 안정성 등이 문제가 되지 않는 장점이 있다.²⁰⁾ 실제 연구에서 연골 결손이 있는 부위에 주사될 때 glycosaminoglycan과 제 2 형 콜라겐이 치료되지 않은 부위보다 더 많이 형성되는 것이 확인되었다.²²⁾
   Calcium alginate 또한 지지체로서 연구되었는데 이식된 부위에서 연골을 형성하면서 연골의 부피를 안정적으로 유지할 수 있었지만 섬유혈관의 침습(fibrovascular ingrowth)과 골 형성이 진행되는 단점이 있다.²³⁾
   Chalain 등²⁴⁾은 사람의 이개연골에서 연골세포를 채취하여 모은 후 alginate, 제 1 형 콜라겐, κ-elastin으로 만들어진 hydrogel에 심어 누드마우스에 이식하여 생성된 연골을 분석하였는데 탄력연골의 중요한 기질인 제 2 형 콜라겐, proteoglycan과 잘 결합된 탄력섬유(elastic fiber)를 관찰할 수 있었다. 

합성폴리머(Synthetic polymers)
   자연폴리머들은 체내에서 항원성을 가지며 얻을 수 있는 양이 제한되어 있어 linear polyesters인 PGA, PLA, PCL 같은 물질이나, PGA, PLA 두 가지의 co-polymer인 Ethisorb, Vicryl mesh 등이 연구되고 있다. 이 중에서 PLA, PGA, PCL 등의 polylactone계 고분자가 현재 많이 쓰이고 있는데 이들은 독성이 거의 없고 생분해성과 생적합성이 높아 현재 임상적으로도 널리 사용되고 있다.²⁵⁾ Rotter 등²⁶⁾은 PGA와 poly-L-lactic acid(PLLA)의 co-polymer(Ethisorb)와 pure PLLA를 연골세포의 지지체로 사용했을 때 agarose 등에서 얻을 수 없었던 기계적 안정성을 얻을 수 있었다고 보고하였다. 이들은 생분해성 부직포로 생적합성과 안정성이 높아 연골 결손이 있는 부위에서 안정적으로 연골을 생산할 수 있는 장점이 있다. 하지만 여러 가지 세포의 지지체로 사용되기에 생분해율과 외형구조 유지 및 세포 친화성이 불안정하여 이를 안정화시키기 위한 연구가 많이 진행되고 있다. 대표적인 예로 용적 변형(bulk modification)을 위해 gylcolide, lactide, carprolactone 같은 다른 종류의 lactone monomer를 혼성중합체화(copolymerization) 시키므로 생분해율과 장력(tensile strength)을 조절하고 있으며, 세포 친화성을 높이기 위해 amine, carboxyl 같은 polar group을 통합시키기도 한다.²⁷⁾ 

주사 가능한 지지체(Injectable scaffolds) 
   관절이라는 특수한 부위는 독특한 구조에 맞도록 인공연골이 모양과 부피를 유지해야 하며 특히 이식하기 쉬워야 한다. 또한 안면, 특히 이개 혹은 코의 연골의 결손 등에서 수술하지 않고 주사하여 결손을 인공연골로 재건할 수 있으면 하는 소망에서 생분해 성질이 있고 쉽게 주사 할 수 있는 지지체에 대한 연구가 활발하다. 
   주사 가능한 합성폴리머에는 polyethylene oxide(PEO), PEO dimethacrylate(PEODM), polypropylene fumarate-co-ethylene glycol(PPF-co-EG) hydrogel 등이 있다. Saim 등²⁸⁾은 주사 가능한 hydrogel 지지체인 Pluronic F-127(polyethylene oxide and polypropylene oxide)에 돼지의 연골세포를 심어 면역적격(immunocompetent) 돼지의 배에 돼지의 피부로 이개 모양을 만든 후 이개 터널에 주사하였다. 이렇게 형성된 연골은 모양을 잘 유지하면서 접히거나 뒤틀려 질 때 다시 제자리로 돌아가는 탄성인 탄력연골의 특성을 보여 주었다. 

조직공학으로 생성된 연골의 분석

임상 적용을 위한 연골의 역할³⁾
   조직공학적으로 생성된 연골이 임상에서 쓰이기 위해서는 이식 부위에서 요구되는 다양한 물리적인 스트레스를 감당할 수 있어야 한다. 신생연골의 생물기계적 특성(biomechanical property)을 정량화하여 자연적인 생체연골과 비교함으로써 이러한 요구 조건에 부합하는지 알 수 있다. 
   흔히 연구되는 관절연골의 경우 연골은 관절에 가해지는 하중을 견디며 마찰력을 최소화할 수 있어야 하는데 사람이 걷거나 달릴 때는 평소보다 6~8배의 힘이 반복하여 가해지게 된다. 관절연골은 조직의 75~80%가 물로 조성되어 있으며 치밀한 세포외기질로 구성되어 있는데, 세포외기질의 50~73%는 불용성의 치밀한 섬유인 제 2 형 콜라겐이고 물과 proteoglycan이 수용성 젤 형태로 콜라겐 사이에 흩어져 있다. 콜라겐은 연골이 장력(tension)에 견딜 수 있는 역할을 해주며 proteoglycan은 압력에 저항할 수 있는 중요한 구성 물질이다. 관절연골에 압력이 가해지면 구성 성분 중 물이 투과성이 낮은 세포외기질 사이로 퍼지면서 에너지를 분산시키게 된다.²⁹⁾ 연골세포는 연골세포방(lacunae)에 존재하며 연골의 단지 10% 정도이며 integrin 이라는 세포 표면의 수용체에 의해서 세포외기질과 상호작용을 하면서 항상성(homeostasis)을 유지하고 있다.

연골의 생물기계적 분석
   조직공학으로 생성된 연골의 생물기계적 특성의 정량화를 위해 조직학적, 기계적 분석을 하게 된다. 신생연골은 먼저 외형적으로 분석하여 질적인 평가를 행하게 되는데 연골의 색, 응착력(adhesions), 부드러움(smoothness), 두께(thickness), 주위 연골과의 융합(integration with host cartilage) 등을 자연적인 생체연골과 비교하게 된다. 다음으로 조직학적 소견의 관찰을 위하여 각종 염색을 시행하는데 hematoxilin and eosin(HE) 염색으로 신생연골의 세포충실도 등을 포함한 전반적인 조직학적 소견을 평가하고 Masson trichrome 염색을 통해 조직의 콜라겐을 확인한다. 총 콜라겐의 양은 hydroxyproline의 chliramine T oxidation을 정량화하여 평가할 수 있으며, 특히 관절연골의 경우 제2형 콜라겐을 제1형 콜라겐과 분리하여 분석하는 것이 중요한데 cyanogen bromide digestion을 시행하면 된다. 1,9-dimethylene blue, alcian blue 염색을 시행하여 sulfated gylcosaminogylcan을 평가할 수 있다. 
   생성된 연골의 기계적인 특성을 측정할 수 있는 방법으로 함입검사(indentation test)가 가장 많이 사용되고 있다.³⁰⁾ 연골은 압축될 수 있는 proteoglycan, 콜라겐, 연골세포 등의 고형물질과 압축되지 않은 액체(water)의 두 가지 성분을 가지고 있기 때문에 압축 하중(compressive load)이 주어지면 세포간질(interstitial fluid)이 다공성 고체 조직 사이로 흩어지면서 점성과 탄성을 유지하게 된다. 이러한 연골의 압력-변형 관계(stress-strain relationship)에서 신생연골의 기계적인 특성을 평가할 수 있다. 압축 하중에 반응할 수 있는 능력인 응집력(aggregate modulus, equilibrium modulus), Poisson's ratio로 구하는 압축력(compressibility), 그리고 투과력(permeability) 등이 대표적이다.³¹⁾ 

최신 분석 동향
   최근의 분석 경향은 신생연골의 외형적, 조직학적 분석과 함께 기계적인 분석을 통하여 실제로 임상에서 신생연골을 적용하였을 때 얼마나 유용할 것인가를 판단하는데 초점이 맞추어져 있다. Duda 등³²⁾은 소의 앞다리에서 채취한 연골을 체외 배양 후 fibrin glue와 함께 누드 마우스에 이식하여 6주와 12주 후 생성된 연골을 분석하여 자연 비중격연골과 비교하였다. HE 염색과 alcian blue, Mass-on’s trichrome 염색을 통해 조직학적 분석을 시행하였는데, 6주와 12주 후 생성된 연골은 조직학적으로 많은 차이를 보이지 않으면서 생체 비중격연골과 비슷한 세포와 메트릭스 조성을 보여주었다. 기계적 분석을 위한 함입검사에서 6주와 12주 후에 생성된 연골의 기계적 안정성에 있어 차이를 발견할 수 있었는데 12주에 생성된 연골의 파괴 하중이 6주 연골에 비하여 의미 있게 작았다. 
   Ma와 Langer³³⁾는 소의 무릎에서 연골세포를 체취 후 PGA 지지체와 결합시켜 12주부터 25주까지 체외 배양시켜 생성된 연골을 생물기계적 분석을 통해 자연적인 생체연골과 비교하였다. HE 염색에서 12주부터는 12주 이상 배양한 연골과 조직학적으로 차이가 없었으며 신생연골은 생체연골과 비교할 때 연골세포와 연골세포방의 크기가 좀 더 큰 것을 발견하였다. 이것은 체내배양과 체외배양에서 올 수 있는 기계적 하중의 차이 때문일 것으로 생각되었으며 기계적 특성의 비교에서 12주 이상 배양된 연골조직의 압축력, 투과력은 자연연골과 거의 동일하였고 응집력은 12주부터 20주 사이에 자연연골의 14~40%에 도달하였다. 
   이 외에도 조직공학으로 생성된 연골의 외형적, 조직학적인 분석보다는 기계적인 특성인 압축력, 투과력, 응집력 등이 실제 임상에서 쓰일 수 있는 연골의 평가에 더 유용하다는 것이 많이 보고되고 있다.³⁴⁾ 

국내의 연구소 및 연구자 동향

   국내에서도 생분해성 고분자와 동물 조직세포를 이용, 조직공학적 방법으로 인공연골을 생산하고 있다. 한국화학연구소(소장 김충섭) 화학소재연구부 이해방 박사팀은 국내 최초로 토끼의 연골세포와 생분해성 고분자인 PGA와 PLGA를 이용해 인공연골을 제조하였다. 토끼의 귀에서 연골과 뼈 세포를 분리해 체외에서 대량으로 배양시킨 뒤, 코와 귀 형태의 생분해성 고분자지지체를 각각 만들어 여기에 연골세포를 파종해 체외에서 배양시켰다. 이후 귀와 코 모양의 고분자지지체를 쥐의 피하에 이식한 결과 쥐의 체내에서 생분해성 고분자지지체가 흡수되고 전형적인 연골조직이 형성돼 자라는 것을 확인할 수 있었다. 
   이노테크메디칼(www.innotechmed.com 대표 방한성)은 과기부의 연구성 지원사업으로 연구비를 지원 받아 다공성 생적합성 생분해성 고분자지지체를 이용한 자가 연골조직 배양기술을 개발하였다. 총 10억원(정부연구비 1억 2000만원 포함)의 연구비가 투입된 이번 결과를 갖고 삼성서울병원 두경부외과 백정환 교수에 의뢰해 생쥐를 대상으로 한 동물실험에서 연골조직이 재생되는 것을 확인했으며 국내에서 특허를 받았다. ‘이노폴’이라는 브랜드로 직경 10mm, 두께 3mm의 제품화에도 성공해 조만간 연구용 제품으로 판매에 나선다는 계획을 가지고 있다. 
   (주)듀플로젠은 전신인 아주대학교 의과대학 연골연구소로부터 시작되어 1996년 한국 최초로 자가연골세포를 배양하여 30여 명의 관절염 환자에게 성공적으로 이식하였으며, 현재 인간혈청을 이용한 인간세포의 배양 방법을 비롯한 3건의 특허를 보유하고 연골세포의 배양 및 공급에 주력하고 있다. (주)듀플로젠에서는 환자에게서 떼어낸 연골조직에서 연골세포를 분리, 배양하여 아티셀(Articell)이라는 제품명으로 시판하고 있다. 
   이 외에도 과학기술부의 생명공학사업(Biotech 2000) 및 보건복지부의 보건의료기술 연구개발사업으로 실시되는 조직공학을 이용한 인공장기 개발기술 연구의 하나로 여러 연구소 및 대학에서 인공연골의 생성에 관련된 연구를 시행하고 있다.

향후 발전 방향 

적절한 세포 종류의 선택
   조직공학적 인공연골의 생성을 위해 현재 많이 쓰이고 있는 세포들은 연골세포, 여러 기원세포(progenitor cell) 등이다. 연골세포는 성숙된 연골을 효소 처리함으로써 쉽게 얻을 수 있으며 배양에서 잘 자라는 특징이 있다. 기원세포는 적당한 환경에서 연골세포로 분화되어 세포 수를 증가시킬 수 있다. 특히 골 및 연골기원세포(osteochondral progenitor cell)는 골막과 골수에서 얻어 체외배양 되어 골 또는 연골로 분화될 수 있는데, 다른 세포와 달리 분화 과정에서 표현형을 유지할 수 있다는 장점이 있다. 그 외 줄기세포에 관한 연구 또한 활발히 진행되고 있다. 임상적으로 이용될 수 있는 인공 연골의 개발을 위한 가장 적절한 세포의 선택을 위해 세포의 대사 기전을 이해하고 개발하는 것이 중요한 과제로 남아 있다. 

성장인자 및 싸이토카인의 개발
   간엽줄기세포 및 연골세포의 분화와 성장에 영향을 주는 단백질 성장 인자인 TGF-β, BMP는 적절히 사용할 경우 세포의 분화와 대사, 세포외기질의 합성을 조절하고 촉진시킬 수 있다. TGF-β는 생분해성 지지체에서 재생된 연골의 질을 향상시킬 수 있으며 recombinant human BMP-2는 콜라겐과 함께 같은 역할을 수행할 수 있다.³⁰⁾³⁵⁾ 즉 연골의 재생을 위해 중요하게 활용되는 지지체에 이러한 성장인자 및 싸이토카인을 적당히 첨가함으로써 재생된 인공연골의 질을 향상시킬 수 있으므로 조직공학적으로 활용될 수 있는 적절한 성장인자 및 싸이토카인의 개발이 수행되어야 한다.

Bioreactors：연골재생에 적합한 기계적 환경의 자극
   연골이 이식된 부위에서 적절한 기능을 수행하기 위해서는 연골이 생성될 때 적절한 기계적 자극이 중요한데, 이러한 기계적 자극은 연골의 성장을 촉진시키고 세포외기질의 생성 및 연골 골격 형성에 영향을 미친다. 생물기계적 분석을 통해 각각의 기계적 자극이 생성된 연골에 미치는 영향을 연구 분석할 필요가 있다. 

특수한 고분자지지체의 개발 
   연골세포를 주입할 고분자지지체의 특성개선과 신소재의 개발은 매우 중요하다. 지지체의 표면에 응착 펩티드(adhesion peptide)를 처리함으로써 세포와 지지체의 결합을 촉진시켜 연골의 재생을 도울 수 있다.³⁶⁾³⁷⁾ 또한 조직공학으로 생성된 연골이 이식된 부위에서 주변 조직과 잘 결합되기 위해서는 완전 성숙한 연골보다는 적절히 성장된 연골을 숙주에 이식하는 것 또한 중요한데 시기에 따른 연구가 진행되어야 할 것이다. 이와 함께 지지체의 기계적 성질, 투과성, 다공성, 생분해 속도, 생체 적합성을 평가할 수 있는 정형화된 방법 또한 필요하다고 본다.

결     론

   국내에서는 현재 조직공학을 이용하여 인체와 가장 유사한 인공연골을 개발하기 위해 많은 연구들이 활발히 진행되고 있어 연골의 치유를 위한 풍부한 연구 데이터들이 축적되어 있다. 그러나 연구자마다 정해진 프로토콜이 없이 각기 다른 방법으로 연구를 진행하고 있으며, 이러한 데이터를 신빙성 있고, 재현 가능하도록 검증하고 비교할 수 있는 방법 또한 정해져 있지 않다. 앞으로 상기 기술한 사항들을 염두에 두고 연구자들의 연구결과를 서로 유기적으로 연결하고 학문 상호간의 협조가 긴밀히 이루어 진다면 국내에서의 인공연골 생성이 새로운 전기를 맞을 수 있을 것이다. 

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