Address for correspondence : Jeong-Hoon Oh, MD, PhD, Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 180 Wangsan-ro, Dongdaemun-gu, Seoul 130-709, Korea
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서론

선천성 소이증이나 외상으로 인한 이개연골의 결손이 발생한 경우 이를 재건하기 위해서는 많은 노력이 필요하다. 현재 가장 보편적으로 사용되는 방법은 늑연골 등의 자가연골을 채취하여 조각하고 이를 이식하는 수술이 많이 사용되지만, 이개의 복잡한 모양을 구현하기 위해서 많은 양의 연골조직이 필요하게 되어 결과적으로 연골조직 공여부의 문제를 야기하는 경우가 잦고 또한 늑연골의 조직특성이 이개연골의 특성과 완전히 동일하지 않기 때문에 생기는 문제 역시 수술 후의 결과에 영향을 미친다. 이의 해결 방법으로서 다공성 폴리에틸렌과 같은 합성 물질을 이식하는 수술방법 역시 시도되고 있으나 이것 역시 조직 거부반응에 대한 해결책이 완전하지 않기 때문에 궁극적으로 환자 본인의 이개연골 조직을 증식시켜서 충분히 확보하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 연골조직공학은 여러 종류의 세포를 증식시키고 분화시킴으로써 연골모세포와 함께 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 생산하여 치료를 위해 필요한 만큼의 연골조직을 얻어내도록 하는 학문분야로서, 생산된 연골조직의 생물학적 활성을 유지하고 성공적인 생착을 유도하기 위해서는 충분한 연골모세포의 증식이 필수적이며 이를 위해서는 여러 단계(passage)의 단층배양을 거쳐야 하는데, 여러 단계의 단층배양 과정을 거칠 경우 연골모세포의 탈분화(dedifferentiation)가 일어나게 되어 연골조직의 생존에 필수적인 세포외 기질을 생산하지 못하게 되기 때문에 단층배양의 단계가 제한적으로 이루어질 수밖에 없다.1) 따라서 단층배양 단계를 최소화하기 위한 여러 배양조건의 구성에 대한 많은 연구가 진행되어 왔고 성장인자의 첨가를 포함한 배양액의 구성성분과 분주시 세포농도(seeding density)의 변화를 통해 단층배양 과정에서 연골모세포의 증식효율을 최대화함으로써 단층배양의 계대 수를 줄이기 위한 많은 노력이 있어 왔다. Gruber 등2)은 인체 비중격 연골모세포를 40일 이상 단층배양 하는 과정에서 10% 자가 인체혈장의 사용이 10% 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)의 사용에 비해 3배 이상 잘 증식된다는 것을 보였으며, Alexander 등3)은 10% 인체혈장을 이용하는 경우 비중격 연골모세포의 단층배양에서뿐 아니라 alginate를 이용한 3차원 배양에 있어서도 연골모세포의 재분화와 세포외기질의 생산에 있어서 같은 비율의 소태아 혈청에 비해 월등한 효율을 보여줌을 증명하였다. 또한 Richmon 등4)은 연골모세포의 단층배양에 있어서 혈청이 필요하지 않은 배양환경의 조성을 위하여 여러 가지 성장인자의 조합을 통해 조직공학적 신생연골의 임상적용에 있어서의 걸림돌을 제거해 보고자 하였으나 배양액의 조성에서 혈청의 사용은 여전히 필수적인 단계로 남아 있는 상태이다. 그러나 혈청 사용의 가장 큰 문제점인 바이러스나 prion, 또는 이종 단백의 오염에 대한 문제는 자가 혈청 또는 동종 혈청을 사용할 경우 해결이 가능하기 때문에,3,5) 이의 적용 가능성을 확인하기 위해서는 동물의 연골모세포를 증식시키는 데 있어서 동종 혈청의 첨가를 통해 적절한 배양조건을 확립하는 것이 필요하다. 하지만 기존의 연구들은 모두 인체의 연골모세포 증식에 있어서 많이 사용되는 소태아 혈청과 인체 혈청의 차이를 비교함으로써 인체 혈청의 역할이 동종 혈청의 이용에 의한 것인지 인체 혈청 자체의 우수성에 의한 것인지를 규명하는 데 한계가 있었다. 따라서 동물의 연골모세포 증식과정에서 동종 혈청과 인체 혈청의 역할을 비교함으로써 어떤 것이 더 많은 증식을 유도하는지를 규명하는 것이 필요하다.
본 연구의 목적은 조직공학적 신생연골 조직을 만드는 과정의 첫 단계인 연골모세포의 단층배양 과정에서 인체 혈청과 토끼 혈청이 토끼의 연골모세포 증식에 미치는 영향을 비교함으로써 최적의 배지 구성요소를 확립하고자 하였으며, 배양액 내 혈청의 농도에 따른 증식능력의 차이를 관찰하여 단층배양 과정에서의 최적 혈청 농도를 확립하고자 하였다. 또한 이개와 비중격의 연골모세포를 각각 배양하여 연골조직의 위치에 따른 연골모세포의 증식능력의 차이와 이에 대한 혈청의 영향을 함께 비교하였다.

재료 및 방법

6개월 연령의 암컷 New Zealand White Rabbits(1.5 to 2.0 kg) 12마리에서 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(5 mg/kg), acepromazine maleate(1 mg/kg)를 근주하여 마취시킨 후 supersaturated pentobarbital solution(90 mg/kg)을 정맥주사하여 안락사시켰다. 토끼의 이개를 두개골과의 연결부위에서 절제한 후 연골막을 완전히 박리하여 이개 연골을 채취하였으며(Fig. 1A), 비중격 연골채취를 위해 비배부에서 4 cm 크기의 피하절개를 한 후 비골절편 및 골막편을 만들어 올리고 이를 제거하여 토끼의 비강을 노출하였다. 비중격 양측의 연골막을 거상하고 비중격연골과 서골 사이의 연결부위를 분리한 후에 연골편을 절제하여 채취하였다(Fig. 1B). 채취하여 1 mm³ 크기로 잘게 절제한 이개와 비중격 연골편은 phosphate-buffered saline에 담궈서 배양시까지 4℃에 보관하였다. 각 토끼의 조직에서 분리된 연골조직을 1 mm³ 크기의 작은 절편으로 잘라내어 동일 부위의 절편끼리 모두 합친 다음에, 0.2% protease type XIV를 용해한 배양액[Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)/Ham's F-12, 0.4 mM 1-proline, 2 mM 1-glutamine, 0.1 mM nonessential amino acids, 10 mM HEPES buffer, 100 U/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin sulfate, 0.25 ug/mL amphotericin B]에 담가 37℃에서 60분간 배양하였다. 이후 절편을 0.02% collagenase P가 용해된 같은 배양액에 담가 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 750 g에서 5분씩 3차례 원심분리하여 연골모세포를 분리하였다. 첫 번째로 분리된 이개 및 비중격 연골모세포를 각각 3군으로 나누어 5000 cells/cm²의 농도로 배양액(low glucose DMEM, 0.4 mM L-proline, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM nonessential amino acids, 10 mM L HEPES buffer, 10 U/mL penicillin G, 100 ug/mL streptomycin sulfate, 0.25 ug/mL amphotericin B)이 담긴 12 well에 분주한 후 각 10% 농도의 인체 혈청 및 토끼 혈청(Rabbit antibody serum, Gemini Bioproducts, Woodland, CA, USA), 그리고 혈청이 없는 대조군을 성장인자[1 ng/mL transforming growth factor(TGF)-1, 5 ng/ mL fibroblast growth factor(FGF)-2, and 10 ng/mL platelet derived growth factor(PDGF)-bb]와 함께 첨가하여 37℃, 5% CO₂에서 7일간 배양하여 혈청의 종류에 따른 세포증식의 차이를 비교하였다. 두 번째로 토끼의 이개 연골모세포의 배양에 동종 혈청을 사용하는 경우에 있어서 혈청의 최적 농도를 결정하기 위해 혈청의 농도를 2%와 5%, 10%로 각각 달리 하여 연골모세포를 배양하였으며, 세 번째로 토끼 혈청의 존재하에서 성장인자에 의한 이개 연골모세포의 증식능력 차이를 알아보기 위해 전술한 성장인자(1 ng/ mL TGF-1, 5 ng/mL FGF-2, and 10 ng/mL PDGF-bb)의 유무에 따라 두 군을 나누어 배양을 시행하였다. 격일마다 배양액을 교체하여 배양한 후에 confluency에 도달하기 전에 0.05% trypsin(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리시키고 원심분리한 뒤 세포 펠렛을 0.5 mg/mL proteinase K에 용해하여 용액 내의 DNA 농도(ng/mL)를 측정하여 평균을 구하고 군별 세포증식의 정도를 평가하였다. DNA 농도의 측정은 McGowan 등6)의 방법에서와 같이 PicoGreen DNA content determination assay를 이용하여 520 nm에서 100 μL씩의 시료와 PicoGreen DNA reagent(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)의 흡광도를 측정하였으며, 이를 인체 DNA 표준곡선(DNA standard curve)에 대입하여 농도를 계산하였다. 각각의 군별로 측정된 평균값을 일원분산분석 방법으로 비교하였다.

결과

토끼의 이개 연골로부터 분리한 연골모세포를 7일간의 단층배양 후 위상차 현미경으로 촬영하였을 때, 혈청과 함께 배양하지 않은 대조군에서는 연골모세포의 증식이 거의 이루어지지 않았던 것에 비하여(Fig. 2A) 토끼 혈청과 함께 배양한 군에서는 혈청의 농도와 상관없이 활발한 세포의 증식이 관찰되었으며(Fig. 2B, C, and D), 인체 혈청과 함께 배양한 군 역시 동일한 소견을 보였다. 혈청의 종류에 따른 이개 연골모세포 증식의 차이를 비교하였을 때, 토끼 혈청 및 인체 혈청과 함께 배양한 군(840.58±79.46 ng/mL와 743.51±61.28 ng/mL) 모두 혈청을 함께 배양하지 않은 군(33.80±25.14 ng/mL)에 비해 훨씬 많은 DNA의 증가를 보였으나(p<0.05) 토끼 혈청과 인체 혈청의 종류에 따라서는 서로 유의한 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 비중격 연골모세포의 증식에 있어서도 혈청의 유무에 따라 유의한 차이가 있었으나 혈청의 종류에 따른(1741.31±323.38 ng/mL 및 1761.47±374.67 ng/mL) 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p>0.05)(Fig. 3). 연골모세포의 종류에 따른 차이로서, 비중격 연골모세포의 증식이 모든 조건(0%, 10% rabbit serum, 10% human serum)에서 이개 연골모세포 증식에 비해 유의하게 높은 결과를 보였다(p<0.05)(Fig. 3).
두 번째 실험으로서 이개 연골모세포의 배양에서 토끼 혈청의 농도를 2%, 5%, 10%로 각각 다르게 하여 배양하였을 때, 이에 따른 DNA의 양(각 950.07±86.51 ng/mL, 922.63±84.31 ng/mL, 840.58±79.46 ng/mL)은 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05)(Fig. 4). 혈청 이외에 첨가된 성장인자들(1 ng/mL TGF-1, 5 ng/mL FGF-2, 10 ng/mL PDGF-bb)에 의한 영향을 확인하기 위해서 이들 성장인자를 제거하고 배양한 군에서의 DNA 증식(851.01±93.24 ng/mL)은 성장인자가 함께 배양된 군(840.58±79.46 ng/mL)에서와 차이가 없었다(p>0.05)(Fig. 5).

고찰

연골모세포를 이용한 신생연골의 제작에 있어서 적절한 배양환경의 조성은 신생조직과 생체조직의 통합만큼 중요하고 필수적인 단계이다. 생체 내 환경의 면역반응에 의한 공격으로부터 세포를 방어하고 생존에 필요한 영양분의 공급과 노폐물의 배출을 위해서는 세포외기질의 생산이 필요하며, 이의 생산을 위해서는 적절한 세포 수의 증식이 우선적으로 이루어져야 한다.7,8) 앞에서 언급한 것처럼 혈청은 현재까지 연골모세포의 단층배양에 있어서 세포의 생존과 증식에 필수적인 것으로 알려져 있다. 하지만 조직공학적 신생연골조직 생산의 궁극적 목적인 생채이식을 위해서는 조직의 증식과정에서 바이러스 및 이종단백의 오염과 같은 면역학적 유발요인을 최소화하여야 하는데, 기존에 일반적으로 통용되는 소태아 혈청을 사용할 경우 이것을 이용해 배양된 조직을 인체 내에 이식하는 데 있어서 심각한 걸림돌이 될 수밖에 없다. 이러한 이종 혈청의 사용은 잠재적으로 바이러스와 prion의 감염위험을 높일 수 있으며, 알려지지 않은 면역학적 문제를 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 기존에 인체 혈청의 역할에 대한 연구는 모두 인체 연골모세포에 대해 이루어져 왔기 때문에 그 효과가 동종 혈청을 사용함으로써 얻어진 것인지, 아니면 인체 혈청의 구성성분의 차이에서 기인하는 것인지에 대해서는 알려진 것이 많지 않을 뿐 아니라, 혈청 내의 어떤 성분이 연골모세포의 증식을 촉진하는지에 대해서도 아직 명확히 밝혀진 것이 없다.3) Tallheden 등9)은 관절 연골모세포의 연구에서 인체 혈청 내 epidermal-derived growth factor와 platelet-derived growth factor-AB의 풍부한 존재가 세포증식에 기여하는 것으로 추정하였고, 소태아 혈청을 이용한 다른 연구들에서는 IGF-1이 중요한 역할을 할 것으로 추측되기도 하였다.10) 향후 추가적인 연구를 통해서 이들 혈청내의 어떤 성분이 연골세포의 증식을 유발하는지에 대한 규명이 이루어져야만 이들의 선택적인 첨가를 통해서 오염이나 면역학적 우려 없이 연골조직을 생산할 수 있는 기반이 마련될 수 있을 것으로 사료된다. 최근에는 인체 혈청 이외에도 IGF-1과 GDF-5를 함께 첨가한 배양액을 사용하는 것이 단층배양 및 3차원 연골조직 배양에 있어서 더 좋은 결과를 보인다는 연구가 보고되어 임상적으로 적용 가능한 배양조건의 확립 가능성을 시사하기도 하였다.11) 그러나 이들 연구는 혈청의 사용 없이 성장인자의 사용만으로 연골모세포의 배양을 이룬 것이 아니기 때문에 임상적인 배양조건의 확립을 위해서는 아직 많은 것이 해결되어야 한다. 본 연구에서도 혈청의 유무가 DNA 증식에 미치는 영향에 비해서 성장인자의 유무에 의한 차이는 매우 미미하였기 때문에, 현재까지 혈청의 유무가 세포증식에 가장 큰 영향을 끼치는 성분일 것으로 보아도 무방할 것으로 사료된다. 또한 같은 개체의 연골모세포라 하더라도 이개와 비중격, 늑골 등 연골조직의 위치에 따라 세포증식의 속도에 차이가 있는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서도 이개 연골모세포의 세포증식에 비해 비중격 연골모세포의 세포증식이 2배 가까이 더 빠른 것으로 나타났으며 이는 인체의 이개 연골모세포와 비중격 연골모세포, 늑골 연골모세포의 단층배양에서 증식속도의 차이를 비교한 Tay 등의 연구결과에서와 동일한 소견을 보인다고 할 수 있다.12,13,14) 연골모세포의 증식능력은 연골의 위치에 따라 차이를 보이는 것이 여러 연구를 통해서 알려져 있는데, Kafienah 등14)은 비중격 연골모세포의 증식능력이 관절 연골모세포에 비해 훨씬 높을 뿐 아니라 재분화 후 조직공학적 신생연골 구조체 형성시 2형 콜라겐의 비율 또한 월등히 높다는 사실을 보임으로써 무게 부하를 받지 않는 비중격 연골모세포를 증식하여 관절부 연골결손의 보강에 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었고, 이개 연골모세포 역시 관절 연골모세포보다 더 나은 세포증식 및 세포외기질의 형성능력을 보인다는 사실도 밝혀짐으로써 비중격과 이개 연골모세포는 모두 조직공학적 신생연골 구조체의 제작에 적합한 세포 공여부가 될 수 있는 것으로 여겨지고 있다.15,16)
다만 본 연구에서 성장인자의 첨가 여부가 이들 연골모세포의 증식에 큰 차이를 보이지 않은 점은 기존의 연구와 차이를 보였는데, 이는 소태아 혈청과 인체 또는 토끼 혈청의 구성성분의 차이로 인해 이들 혈청이 이미 충분한 성장인자를 포함하고 있을 가능성이 있는 것으로 가정할 수 있다.17,18) 혈청의 농도 차이에 따라 증식능력에 큰 차이를 보이지 않고 오히려 농도가 높아질수록 약간씩 증식능력이 감소되는 경향 역시 Alexander 등3)의 연구와 같은 결과로서, 혈청내 성장인자의 기능에 대한 가설을 뒷받침할 수 있을 것이다. 따라서 연골모세포의 배양에서 인체 혈청을 사용할 경우에는 소태아 혈청의 일반적인 농도인 10%보다 매우 낮은 농도에서 배양을 진행하여도 무방할 것으로 보이며, 본 결과에서처럼 2%의 혈청 농도로도 충분히 세포의 증식을 유도할 수 있다.
한편 본 연구에 사용된 토끼 및 인체 혈청은 자가 혈청이 아닌 동종 이계(allogenic) 및 이종(xenogenic)의 혼조 혈(pooled serum)을 사용하였기 때문에, 이상적인 배양액 조성이 되기 위한 자가(autologous) 혈청의 사용과는 차이가 있을 수 있으므로 이에 대해 확인해 보아야 한다. 인체 관절 연골모세포를 배양한 다른 연구에서도 자가 혈청 및 혼조 혈청 모두가 소태아 혈청에 비해 탁월한 증식능력 및 세포형질 유지의 차이를 보였지만,9) 본 연구에서처럼 동물 연골모세포의 증식에서 동종 이계 혈청과 이종 혈청의 효과가 크게 차이가 없는 것으로 나타나는 경우에는 이것이 역으로 인체 연골모세포의 증식에 있어서도 같은 원리가 작용하는지, 즉 토끼 혈청과 같은 특정 동물의 혈청이 소태아 혈청이나 다른 동물 혈청에 비해 더 나은 증식능력을 나타내는지에 대해서는 추가적인 연구가 필요하다. 과거 돼지의 내피세포 배양에 있어서 소태아 혈청과 말 혈청의 효과를 비교한 연구에서는 이종 혈청이라 하더라도 종에 따라 각기 다른 효과를 보이는 것으로 보고되었으며, 포유류의 연골모세포 배양에 있어서 최적의 조건을 결정하기 위해서는 각 종별로 따로 연구가 필요한 것으로 알려져 있다.19,20)
또한 본 연구에서는 혼조 혈청의 사용에 따른 개체 간 변수를 최소화하기 위해서 단일 개체의 연골모세포를 사용하지 않고 여러 토끼의 연골모세포를 혼합하여 사용함으로써 개체 간 변수의 영향을 줄였지만 이것만으로 그 영향을 완전히 배제하였다고 보기 어려우므로 향후 연구에서는 단일 개체로부터 연골모세포를 분리하고 그 개체의 자가 혈청을 배양에 사용하여 면역학적 및 감염의 위험이 없는 신생연골 구조체를 생산하는 연구를 진행한다면 더욱 확실한 자가혈청의 효과를 파악할 수 있을 것으로 사료된다.

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