교신저자：김세헌, 135-720 서울 강남구 도곡동 146-92번지  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   두경부암은 전체 악성 신생암의 6.6%를 차지한다. 이 중 약 반 정도의 환자들이 상당히 진행된 병기를 보이기 때문에 수술 및 방사선 치료법의 발달에도 불구하고 5년 생존율도 30% 전후로 매우 낮은 편이다.¹⁾²⁾ 이런 환자들의 경우 기존의 치료법과는 다른 새로운 치료방법의 개발이 시급한 실정이다. 종양 특이성 바이러스 치료는 직접적으로 암세포를 죽이는 바이러스를 유전공학적으로 도입하려는 시도이다. 이상적인 바이러스 모델은 다양한 암종에 작용하며, 복제가 가능하고, 독성이 적고, 항바이러스 치료를 받기 쉬워야 한다.³⁾ G207 바이러스는 헤르페스 바이러스의 γ34.5 loci 유전자가 소실되고 lacZ 유전자가 ribonucleotide reductase(RR)를 지정하는 ICP6 부분에 삽입된 다변이 바이러스이다. 헤르페스 바이러스의 RR이 기능을 못함으로써 G207 바이러스는 내인성 RR을 이용하여 세포분열이 빠른 세포에서 선택적으로 복제되며, 바이러스의 복제는 분열하지 않는 세포에서는 희박하므로 암세포에 특이적으로 감염되어 세포괴사를 유도할 수 있고, γ34.5 loci 유전자 소실로 인하여 바이러스 자체는 약화되어 신경 독성을 줄일 수 있다.⁴⁾ G207 바이러스는 다음과 같은 여러 장점을 가지고 있다. 첫째, 열에 민감하여 발열 시 바이러스 복제가 억제되고, 둘째, acyclovir, gancyclovir와 같은 항바이러스 제제에 감수성이 높으므로 치료시 야기될 수 있는 바이러스의 과도 증식에 의한 부작용을 치료하기 용이하다. 셋째, 바이러스 내의 다수의 유전자 대변이로 인하여 HSV로의 자연적인 전환은 거의 되지 않으며, 넷째, 감염의 지표로 lacZ 유전자를 발현하도록 조작되어 있어 바이러스의 증식을 간접적으로 확인할 수 있다는 장점이 있다.⁵⁾⁶⁾ 그러나 G207바이러스의 단독 치료만으로는 종양의 완전 관해가 힘든 경우도 있어 기존 치료법과의 병합치료를 고려해 볼 수 있다. 만일 병합치료가 큰 부작용을 유발하지 않으며, 부가작용 또는 상승작용을 나타낸다면 좀더 효과적인 종양치료법이 될 수 있으리라 생각한다.
   세포에 방사선을 조사하면, 세포의 고사를 유도하는 유전자의 일종인 Gadd34(growth arrest- and DNA damage-inducible gene)가 발현된다. 우연히 Gadd34의 유전자에 의해 발현되는 단백질의 아미노산 서열이 G207 바이러스에서 제거된 γ34.5 유전자에 의해 발현되는 단백질의 아미노산 서열과 높은 유사성을 보인다.⁷⁾⁸⁾ 또한 방사선 조사 후 RR의 합성이 일시적으로 증가한다는 보고가 있다.⁹⁾ 이를 종합하여, 방사선 조사로 국소적으로 종양조직 내에서 RR과 Gadd34의 합성이 증가되며, 이는 바이러스에서 변형된 유전자 기능을 보완시켜주는 역할을 한다. 또한 방사선 치료와 종양붕괴바이러스의 세포살상기전이 서로 다른 경로로 이루어짐을 생각할 때, 방사선 치료와 G207 바이러스 요법을 병용함으로써 바이러스 증식과 세포독성에 좋은 환경을 제공하리라 생각된다. 본 연구의 목적은 두경부 편평세포암종 세포주에서 유전자 변형에 의해 만들어진 종양붕괴 헤르페스 바이러스(G207)와 방사선 치료의 병합 치료 효과의 유용성을 평가하기 위한 것이다.

재료 및 방법

세포주(Cell Lines) 선택 및 처치
   본 연구에서는 6가지의 두경부 편평세포암종 세포주들이 사용되었다. 3가지 세포주(HN886, MSKQLL2, SCC1483)는 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center에서, 2가지는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA ; SCC 15, SCC 25)에서 분리하여 특성화 하였다. SCC VII 세포주는 미국 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center로부터 받은 것으로 C3H/HeJ 쥐에서 자연적으로 발생한 편평세포암종 세포주이다. 세포주들은 37°C, 5% CO2의 환경에서 10% fetal calf serum(FCS)이 들어 있는minimal essential media(MEM) 배지에서 배양되었으며, 세포주에 따라 일주일에 한번 내지 두 번 계대 배양하였다. 예비실험 결과 방사선 치료의 민감도에 따라 방사선 치료에 민감한 세포주 2개와 반응이 미미한 세포주 2개 그리고 중간 정도의 반응을 보이는 1개 세포주를 선택하였다. 방사선의 조사량은 예비실험에서 여러 용량을 세포에 조사해 본 결과 조사 후 5일째 되는 시점에서 평균 50%의 세포독성을 보이는 400 cGy로 시행하였다. 병합요법의 상승작용을 최대한 잘 관찰하기 위하여 예비 실험을 통해 바이러스 감염 후 5일째 평균 종양세포의 생존율이 50% 정도 되는 감염 중복도(MOI)를 설정하였다(MOI=0.1).

G207 바이러스의 제조
   G207 바이러스는 제 1형 헤르페스바이러스의 γ34.5 유전자를 삭제하고 ICP6 유전자 부위에 LacZ 유전자를 삽입시켜 유전적 변형을 일으킨 바이러스이다.⁵⁾ 바이러스의 증식이 활발히 일어나는 아프리카 green monkey의 신장세포(Vero cell；ATCC)에서 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 이용하여 바이러스를 배양한다. 바이러스의 정량화는 Vero 세포주에서의 플라크형성단위(plaque forming unit, pfu)에 근거하여 시행하였으며, 사용할 때까지 -800 C에 보관하였다. G207 바이러스는 Memorial Sloan-Ketterin Cancer Center의 Surgical Oncology Laboratory에서 기증 받았다.

MTT 세포독성 연구(Cytotoxicity Assay)
   종양세포의 살상능력을 분석하는데 있어 단순히 혈구 측정기를 이용하여 Trypan blue 염색을 하여 생존해 있는 세포를 계수할 수 있으나 이것은 주관적이며, 아치사의 손상을 입은 세포의 상태를 정확히 대변할 수 없으므로 본 실험에서는 MTT(3-(4,5-Dimethyl thiazole-2-yl)-2,5- Diphenyl tetrazolium Bromide, SIGMA #2128) cytotoxicity assay를 시행하였다. 편평한 96-well 용기(Falcon Plastics, 3075)에 200μl 의 부피로 5×103개의 종양 세포를 6개의 세포주들에 각각 이식하였다. 약 20시간 배양 후 상층액을 제거하고 인산완충용액을 이용하여 세척 후, MTT(50 μg MTT/200 μl)가 섞인 배양액을 넣고 4~6시간 배양하였다. 이때 실험 군을 4가지로 나누어, 대조군, G207 바이러스만 처치한 군(MOI=0.1), 방사선만을 조사한 군(400 cGy), 방사선 조사 후 바이러스를 처치한 군(400 cGy 방사선 조사 후 12시간 후에 G207 바이러스를 MOI=0.1으로 처치)으로 하고 각 그룹에 있어서 생존 세포의 비율을 Day0, Day1, Day2, Day3, Day4, Day5에 일정한 시간을 정하여 대조군과 비교하였다. MTT는 살아있는 세포에서 Mitochonrial dehydrogenase에 의하여 보라색의 결정체를 형성하므로, 상층액 제거 후, 결정을 DMSO로 용해시켜 그 농도를 Spectrophotometry를 이용하여 분석하였다. 각 실험은 4회 반복하였다.

In Vitro 바이러스 배양 연구(Viral Proliferation Assay)
   방사선을 조사하지 않은 6개의 종양 세포주(SCC1483, SCC15, SCC25, MSKQLL2, MSK886, SCCVII) 군과 방사선을 조사한 군에서 G207 바이러스의 증식 정도의 차이를 알아보기 위하여, 상기 4가지 실험군에서 MTT를 가하기 전에 수집된 배양액을 -800°C에 보관하면서 실험개시일(Day0)부터 실험 5일째(Day5)까지 모았다. G207 바이러스에 민감한 Vero 세포를 6개의 용기(6well plate, Costar)에 한 용기 당 1×10⁶개의 세포밀도로 이식하고 24시간 배양하였다. 인산완충용액으로 세척 후, 실험 전 얼음 속에서 서서히 녹인 배양액 샘플을 일정 비율의 농도로 희석 후 Vero 세포에 감염시켰다. 2시간 배양 후 2 ml의 DME agarous 혼합 배지를 첨가하고, 2일간 배양하였다. 2 ml의 Neutral red solution(Sigma N2889)을 첨가 후 빛을 차단한 상태에서 2일간 배양하고, 각 세포주별로 실험개시일(Day0)부터 실험5일째(Day5)까지 바이러스의 플라크(plaque) 숫자를 세었다.¹⁰⁾

X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 염색(In vitro X-Gal staining)
   G207 바이러스는 표식 유전자인 LacZ 유전자가 ICP6 유전자 부분에 삽입되어 있으므로, 바이러스에 감염된 종양세포에서 X-gal 염색을 통하여 간접적으로 바이러스의 종양세포 감염 정도를 분석할 수 있다. 6개의 두경부 편평상피암 세포주를 24개의 용기(24 well plate, Costar)에 한 용기 당 1×105개의 종양세포를 이식하였다. 20시간 후 대조 군, G207 바이러스만 처치한 군(MOI=0.1, 1), 방사선만을 조사한 군(400 cGy), 방사선 조사 후 바이러스를 처치한 군(400 cGy 방사선 조사 후 12시간 후에 G207 바이러스 감염, MOI=0.1, 1)으로 4군으로 나누어 처치하고, 24시간 후에 1% glutaraldehyde로 고정시켜 X-gal(5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-galactopyranoside；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) 용액에 2시간 배양, 염색하였다. 감염의 효율성을 측정하기 위하여, 양성 염색된 세포의 비율을 고배율(200배율)로 3회 측정하였다.¹¹⁾

통계처리
   모든 자료는 평균±표준편차로 정리하였다. 각 군간 비교는 student’s t-test 및 repeated measured ANOVA test를 이용한 Turkey multiple comparison test를 이용하였다.

결     과

MTT 세포독성 연구(Cytotoxicity Assay)
   SCC 1483은 비교적 방사선과 G207 바이러스에 민감한 세포주이나 400 cGy 방사선조사 후 5일째 약 30%의 종양세포가 아직 생존해 있었으며, G207 바이러스를 단독 투여한 후에도 약 30%의 종양세포가 생존해 있었다. 그러나 방사선 치료와 G207 virus 치료를 병합할 경우 모든 종양세포를 살상시킬 수 있었다. Fig. 1에서 점선은 방사선 단독 치료와 G207 바이러스 단독 치료의 가상적인 부가작용을 나타내는 선으로 제 두 가지 치료를 병합하였을 경우, 기대되는 병합효과 보다 더 좋은 결과를 보여주고 있다. 이러한 치료 효과는 SCC15 및 SCC886과 같이 방사선치료에 중간 정도 반응하는 세포에서 뿐만 아니라, 비교적 방사선 치료에 저항성 있는 SCC25, SCCQLL2 및 SCC VII 세포주에서도 확인할 수 있었으며, 방사선 혹은 G207바이러스 단독 치료시 예상되는 두 가지 치료법의 부가작용으로 보다 나은 효과를 보여 주었다(repeated measured ANOVA, Turkey multiple comparison test, p<0.05)(Fig. 1A, B, C, D, E and F).

In Vitro 바이러스 증식 연구(Viral Proliferation Assay)
   방사선 치료와 G207 virus치료를 병합 할 경우, 방사선 조사를 받은 세포에서 바이러스의 증식이 어떤지를 보기 위하여 바이러스 증식 실험을 시행하였다. 실험에 사용된 6개의 세포주들에서 viral burst는 방사선 조사에 상관 없이 비슷한 시기에 일어났으며, 특히 SCC1483 cell line의 경우 방사선 조사 후 바이러스의 증식이 통계학적으로 유의 있게 증가되었으며(p<0.05), 다른 cell line에서는 방사선 조사 후 바이러스의 증식이 방사선 조사를 받지 않은 군에 비하여 유의 있게 감소되지 않음을 관찰할 수 있었다(Fig. 2A, B, C, D, E and F).

In Vitro X-gal 염색
   In vitro에서 방사선 조사군과 조사하지 않은 군에 있어 바이러스 감염에 대한 유용성을 평가하기 위하여, 0.1 MOI의 G207 바이러스를 처리하고 24시간 X-gal 용액 처리 후 β-galactosidase에 대하여 조직화학 염색을 시행하였다. 모든 세포군에서 3.8% 내지 30.5% 정도로 β-galactosidase를 발현하였다(Table 1). 세포주 중에서는 SCC15 세포주가 가장 민감하였고 SCC VII 세포주가 가장 저항성을 보였다. X-gal 염색으로 본 G207 바이러스의 감염효능은 방사선을 조사한 군에서 방사선을 조사하지 않은 세포주에서 보다 비슷하거나, 좀 더 많은 염색세포가 관찰되었으나(Fig. 3) 통계학적으로 유의한 차이는 없어 적어도 방사선 조사 후 바이러스의 감염 능력이 저하되지 않았음을 알 수 있었다.

고     찰

   최근 두경부 편평세포암의 새로운 치료법으로 유전자 치료에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이들 치료전략 중 하나가 종양붕괴 바이러스를 이용한 유전자 치료법이다. 본 실험에서 사용한 G207 바이러스는 헤르페스 1형 바이러스에서 γ34.5 부위의 유전자를 제거하고, ICP6 유전자 부위에 표식 유전자인 Lac-Z 유전자를 삽입시킨 변형이다. 헤르페스바이러스에서 γ34.5 유전자의 역할은 바이러스 감염 후, 여기에 대항하여 감염된 세포에서 더 이상의 단백 합성을 중지시키는 반응을 억제하는 작용으로, 신경독성을 유발시키는 주요인자이다. 만일 이 유전자가 G207 바이러스와 같이 제거되면, 바이러스의 분열 능력이 많이 저하되는 반면, 헤르페스 바이러스의 단점인 신경독성을 거의 완전히 없앨 수 있다. ICP6 유전자는 DNA합성에 필요한 ribonucleotide reductase(RR)를 만들어 내는 곳으로 G207바이러스는 이 부위에 표식 유전자인 Lac-Z 유전자가 삽입되어 있어 종양세포와 같이 빨리 분화하여 RR를 강하게 발현하는 세포에서 선택적으로 바이러스의 증식이 활발하게 일어나게 된다. 이상의 유전자 조작으로 인하여 G207 바이러스는 신경독성이 제거되었고, 세포 분열이 활발히 일어나는 세포, 즉 RR 발현이 높은 세포에서만 분열이 효과적으로 일어나므로 종양세포에 선택적인 감염을 일으킬 수 있다. 또한 쉽게 바이러스의 존재를 인지할 수 있는 Lac-Z 유전자가 들어 있어 바이러스의 분열 상태를 쉽게 인지 할 수 있고 열에 매우 약하고 기존의 항 바이러스 약물에 민감하여, 혹시 우려될 수도 있는 뇌염과 같은 부작용 발생시 쉽게 바이러스를 치유할 수 있다는 장점이 있으며, 두 군데의 유전자 변형으로 인하여 야생형의 헤르페스 바이러스로 변화할 가능성이 거의 없다는 장점도 있다.⁴⁾⁵⁾ Carew 등은 두경부 편평상피암종 세포주에서 G207바이러스의 종양세포 살상 능력을 관찰하였으며, 일부 세포주(SCC15)에서는 MOI(multiplicity of infection) 2에서 감염 1일 후 감염률이 70%, 감염 3일 후 생존 세포의 비율이 2% 미만으로 훌륭한 종양세포 살상 능력을 보이나, 일부 세포주(SCC25)에서는 MOI(multiplicity of infection) 2에서 감염 1일 후 감염률이 5%, 감염 3일 후 생존 세포의 비율이 10% 이상으로 종양 세포의 살상 능력이 세포주의 바이러스에 대한 민감도에 따라 차이를 보임을 알 수 있다.¹²⁾ Kooby 등은 대장암 세포주들에서 G207 바이러스의 종양살상 능력을 비교해 본 결과 역시 일부 세포주들은 매우 민감하나 다른 일부 세포주들에서는 종양살상 능력이 많이 떨어짐을 관찰할 수 있었고, 바이러스에 대한 민감도는 종양세포의 세포 주기 중 S-phase 부분에 비례한다고 하였다.¹³⁾ 이상의 실험결과로 미루어 G207 바이러스는 두경부암 치료에 유용하게 쓰여질 수 있는 유전자 치료법의 하나로 가능성은 충분히 있으나, 종양세포마다 그 민감도에 있어서 차이가 있어, 주 치료법으로서 보다는 보조치료법 내지는 병용치료법으로 이용되는 것이 더 효율적이라 여겨진다. 한편 두경부편평세포암종의 방사선 치료도 종양세포의 세포주기의 비율, 종양조직내의 혈관생성 및 산소농도 등에 따라 치료 반응에 많은 차이가 있어, 치료에 반응이 적은 종양의 경우 한계에 부딪히게 된다.
   종양붕괴성 헤르페스 바이러스를 이용한 유전자 치료와 방사선 치료를 병합하는 이론적 근거는 다음과 같다. 첫째 G207 바이러스는 악성 수막종, 신경교종, 유방암 및 대장암 세포에서 효과적인 종양살상 능력을 보이는 이상적인 종양붕괴 바이러스이다.^5)6)13)14) 둘째, 방사선 조사시 손상된 DNA에 의해 세포의 분열을 억제하고 고사를 유도하는 유전 물질인 Gadd34 단백이 발현된다는 보고가 있다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 셋째, G207 바이러스에서 삭제된 유전자인 γ34.5 유전자의 카르복실 종말부위에 의해 만들어지는 아미노산 중 64개의 아미노산이 Gadd34 유전자에 의해 만들어지는 아미노산과 유사하므로, 만일 Gadd34 유전자의 발현이 삭제된 γ34.5유전자의 기능을 대치할 수 있다고 가정하면, 신경독성은 희석된 상태에서 국소적으로(종양세포 내에서) 바이러스의 복제가 활발히 일어날 수 있다.^4)7)14) 넷째, dNTP 합성의 중요 효소인 RR는 방사선 조사 후 손상된 DNA의 유도로 활성이 증가된다는 보고가 있다.⁹⁾ 다섯째, G207바이러스는 RR 발현을 담당하는 유전자 부위에 변성을 일으켜, 세포분열이 왕성하여 RR의 발현이 높은 종양세포에서 선택적으로 복제 활동이 증가되는 특성이 있으며, 만일 방사선 조사 후 RR의 발현이 더욱 증가된다면, 종양세포 내에서 바이러스의 복제가 더욱 왕성히 일어날 수 있으리라 가정할 수 있다.¹⁷⁾ 여섯째, G207바이러스는 헤르페스 바이러스로서, 다른 바이러스 벡터와는 달리 방사선 조사 후 분열이 정지된 종양세포에서도 효과적인 감염을 일으킬 수 있다. 이상의 결과로 미루어 종양붕괴 바이러스인 G207 바이러스와 방사선 치료의 병용시, 바이러스의 신경독성을 없앤 상태에서 정상 조직은 배제한 체 종양세포에 선택적 바이러스 감염이 일어나고, 한편 방사선 조사로 인한 Gadd34 및 RR의 증가로 인하여 바이러스의 종양살상 능력이 배가되어 상승작용을 일으킬 수 있다고 생각된다
   종양붕괴(Onolytic) 헤르페스바이러스와 방사선 치료의 병합은 Advani 등이 처음 보고하였고,¹⁸⁾ 두경부종양 모델에서는 아직 보고가 없다. 이들은 인간의 신경교종세포를 이종이식 시킨 후 종양의 크기가 200 mm³ 정도의 크기가 되면 종양 내로 종양세포붕괴 헤르페스 바이러스를 주사하고, 1일 후 20 Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 조직에서 바이러스의 복제가 2배 내지 5배 더 많이 일어났으며, 병합 요법시 의미 있는 상승효과를 보인다고 보고하였다.¹⁸⁾¹⁹⁾ 그러나 여러 세포주를 이용한 시험관 실험의 결과가 없으며, 종양세포붕괴성 헤르페스바이러스와 방사선치료의 병합시 상승 작용의 기전에 대해선 밝히지 못하였다. 또한 위의 실험에서 사용한 1회에 20 Gy의 방사선 용량은 임상적으로 적용하기엔 불가능한 과량의 용량이다.
   이제까지 방사선 치료와 G207바이러스 병합치료에 관한 연구는 방사선 조사량이 실제 임상적으로 적용할 수 없는 많은 양을 조사하여, 임상적 적용이 어려웠다. 그러나 본 연구는 방사선 조사량을 임상적 치료 환경과 비슷한 조건으로 적용하여, 두경부암에서 두 가지 치료법의 병합 치료 효과를 보았다는데 의의가 있다. 방사선 치료시 세포의 apoptosis에 의해 바이러스가 증식할 수 있는 세포의 수가 줄어들 것을 감안하면, 방사선 조사 후 바이러스의 증식이 줄어들지 않았다는 결과는 방사선 조사가 바이러스의 증식에 최소한 영향을 주지 않거나, SCC1483의 경우처럼, 바이러스의 증식을 촉진시킨다고 생각할 수 있다. 또한 두경부 편평세포암종 6개의 세포주 모두에서 G207바이러스를 이용한 유전자치료와 방사선치료의 병합 요법이 예상되는 첨가효과보다 더욱 효과적으로 종양세포를 살상시켰으며, 이는 두 치료법이 종양세포를 살상하는 기전이 다르게 작용하거나 한 치료법이 다른 치료법의 효과를 증폭시켜준다고 생각할 수 있다. 이상의 결과로 미루어 방사선 치료와 G2076 virus를 이용한 유전자 치료는 두경부암 모델에서 상호 보완적인 효과가 있으며, 이는 방사선 치료에 저항성 있는 세포를 효과적으로 살상함으로써, 방사선 치료의 효과를 높일 수 있는 치료법으로 임상적으로 적용할 수 있는 가능성을 보여주었다. 그러나 본 연구는 기존의 보고에 근거한 가설을 바탕으로 종양붕괴바이러스와 방사선 병합치료의 효과를 시험관적으로 검증한 것이며, 분자생물학적 기전 검증에 관한 연구가 추후에 필요하리라 생각된다.

결     론

   저용량의 방사선과 항암 바이러스의 병용 요법은 두경부 편평세포암의 치료에 있어 in vitro 연구에서 부가 또는 상승효과를 가지며, 저용량의 방사선은 바이러스의 증식에 영향을 미치지 않는다. G207종양붕괴바이러스와 방사선의 병합 요법은 방사선에 잘 듣지 않거나 수술이 불가능한 경우 또는 술 후 잔류암의 가능성이 높은 환자의 치료에 유용하게 적용될 수 있으리라 생각한다.

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