교신저자：조재식, 501-190 광주광역시 동구 학1동 8번지  전남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   발성을 담당하는 성대에 발생하는 성문암은 애성과 같은 증상이 조기출현하고 해부학적으로 림프관이 발달하지 않아 경부 림프절 전이가 드물기 때문에 치료성적이 다른 두경부 악성종양에 비해 월등하게 좋은 편이다.¹⁾ 따라서 음성이라는 기능을 보존하면서 종양을 치유하도록 노력하게 된다. 
   조기 성문암에 대한 방사선 치료는 치료범위가 협소하여 방사선에 따른 합병증이 경미하고 치료성적도 우수하며 치료 후 발성기능이 회복될 수 있는 장점을 가지고 있어 우선적인 치료방법으로 고려되어 왔다.²⁾ 그러나 방사선 치료 후 국소치료에 실패하였거나 재발한 경우 구제수술을 시행해야 하며, 이때는 대부분 후두 전적출술이 시행되는데 음성을 상실할 뿐만 아니라 방사선 치료에 의한 수술 후 합병증이 증가하며 전체적인 생존율을 감소시킨다.³⁾ 따라서 조기성문암의 방사선 치료에 대한 감수성을 미리 예견할 수 있다면 방사선 치료에 실패할 것으로 예견되는 환자들에게는 이와 같은 방사선 치료의 장점에도 불구하고 일차적으로 후두보존수술을 선택하는 것이 좋을 것이다.
   최근 두경부종양에서 방사선 치료에 대한 감수성을 예측할 수 있는 인자에 대한 연구가 시도되어 왔다. 1997년 Sheridan 등은 두경부 편평세포암종에서 수술 후 얻어진 조직을 세포배양하여 방사선을 조사시킨 후 반응여부와 Ki67, EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor), c-myc, bcl-2에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하여 발현유무와 상관관계를 분석한 in vitro 연구를 시행하였는데 EGFR의 과발현이 되는 경우에 방사선에 대해 종양세포가 저항성(radioresistance)을 보였으며 c-myc이 과발현된 경우에는 종양세포가 방사선에 민감하게(radiosensitive) 반응하였음을 보고 하였다.⁴⁾ 또한 1996년 Gallo 등은 조기 두경부 편평세포암종 환자들의 방사선치료 후 성적과 bcl-2 발현에 대한 상관관계를 분석하여 bcl-2가 과발현된 경우 재발이 증가하고 생존율이 감소한다고 보고하였다.⁵⁾
   조기 성문암 환자에서 치료 후 음성의 질을 고려할 때 방사선 치료는 매우 중요한 역할을 담당하므로 치료 전 종양의 방사선 감수성을 예측할 수 있다면 임상적으로 치료방법을 선택하는데 매우 중요한 의미를 가지게 된다. 저자는 지금까지 두경부 암에서 방사선 감수성과 연관이 있다고 알려진 bcl-2, c-myc, EGFR 등의 발현이 조기 성문암에서 방사선 치료에 대한 반응을 예측할 수 있는 인자로서 유용성이 있는지에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1988년 1월부터 1998년 10월까지 이비인후과에서 조기 성문암으로 확진되어 방사선 치료를 받은 57명을 대상으로 하였다. 조기 성문암의 대상은 미국 암합동위원회(AJCC, 1997)의 분류에 의거하여 T1과 T2로 하였으며 조직은 치료 전 내시경하에서 천자생검을 시행하여 얻었다. 조직학적으로 모든 예가 편평세포암종이었으며 성별은 남자가 55명, 여자가 2명, 연령은 35세부터 80세까지로 평균연령은 65세였다. T 병기는 1기 45예, 2기 12예이었고 경부림프전이의 예는 없었다. 조직 병리학적 분화도는 고분화군 40예, 중분화군 13예, 저분화군 4예였다. 방사선 조사량은 5600 cGy에서 6800 cGy로 평균 6300 cGy 였다. 방사선 치료 후 3년간 국소재발이 없는 경우에는 국소치료 성공으로, 3년이내에 재발한 경우에는 실패로 판단하였다.

면역조직화학적 염색 
   10% 중성 완충포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 포매괴를 4 μm두께로 박절하여 Probe-on 슬라이드에 부착시켜 건조시킨 다음 검색에 사용하였다. 염색은 Probe-on 슬라이드를 맞대어 생기는 capillary gap action의 원리를 응용하여 개발된 Microprobe System(Fisher, Pittsburgh, USA)를 이용하였다.
   파라핀 절편이 부착된 슬라이드를 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 bcl-2와 c-myc의 경우는 99°C 극초단파에서 7분간 각각 3회, 2회의 항원복구(antigen retrieval)과정을 거치고, EGFR의 경우는 항원복구과정 없이, 내재성 과산화효소의 불활성화를 위하여 endoblocker에 5분간 부치시킨 후 완충액으로 세척하고 각각의 일차항체를 부치시킨 후 세척하였다. bcl-2와 c-myc은 45°C에서 30분간, EGFR은 실온에서 30분간 일차항체를 부치시켰으며, 일차항체로는 bcl-2(Zymed Lab., USA)는 1：100, c-myc(Zymed Lab., USA)은 1：50, EGFR(Zymed Lab., USA)는 1：50으로 희석하여 반응시켰다. 일차항체의 검출을 위한 이차항체는 biotinylated antimouse IgG(Sigma, St. Louis, USA)를 이용하여 45°C에서 7분간 작용시키고 검출계로는 Streptavidin-Horseradish Peroxidase(Research Genetics, Huntsville, USA)를 45°C에서 7분간 작용시켰다. 발색은 완충액으로 수세를 한 후 3-amino-9-ethyl-carbazole(AEC：Zymed, San Francisco, USA)를 45°C에서 7분간 작용시켜 적갈색이 양성반응이 나타나도록 하여 헤마톡실린으로 대조 염색을 시행한 후 mount로 봉입하여 양성반응을 관찰하였다. 

면역조직화학적 염색의 결과 판정
   면역조직화학적 염색을 시행한 슬라이드를 광학현미경하에서 검색하여 bcl-2와 c-myc 단백의 경우 핵주변 부위나 세포질이 과립상의 적갈색으로 염색되면 양성으로(Figs. 1 and 2), EGFR의 경우 세포막이나 세포질에 과립상의 적갈색으로 염색되면 양성으로 간주하였다(Fig. 3). 

통계학적 분석 
   bcl-2, c-myc 및 EGFR의 양성 발현정도와 방사선 치료 후 국소치료 여부의 상관성은 Chi-square test, Fisher's exact test로 분석하고 p값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.

결     과

bcl-2, c-myc 및 EGFR의 발현
   각 항체의 면역조직화학적 염색의 발현결과 bcl-2의 양성발현은 19예(33.3%)였으며, c-myc의 양성발현은 25예(43.9%)였다. EGFR은 46예(80.7%)에서 양성 발현을 보였다. 

방사선 치료 후 국소치료와 발현율의 비교
   각 인자의 양성 발현군에서 방사선 치료 후 국소치료 성공군과 실패군으로 나누어 비교한 결과 bcl-2의 경우 국소치료 성공군에서는 21.1%, 국소치료 실패군에서는 12.3%로 두군에 큰 차이는 없었다(Table 1). c-myc의 경우 국소치료 성공군에서는 36.8%로 국소치료 실패군에서의 7.0%보다 양성 발현율이 높았으며 통계학적 의의가 있었다(p=0.025)(Table 2). EGFR의 경우 국소치료 성공군에서는 57.9%, 실패군에서는 22.8%로 성공군에서 높은 양성발현율을 보였으나 두군사이의 발현율에 통계학적 의의는 없었다(Table 3).

고     찰

   조기 성문암의 치료는 방사선 치료나 발성, 기도보호, 호흡 등의 후두기능을 보존하면서 후두 전적출술과 동일한 종양학적 치료 결과를 얻기위해 시행하는 보존적 수술, 즉 후두 부분절제술, 레이저 성대절제술 등이 일차적 치료법으로 선택되고 있으며 각각의 방법에 따른 치료성적은 5년 국소 제어율은 60~80%, 5년 생존율은 70~90%내로 대동소이한 것으로 알려져 있다.⁶⁾
   각 치료방법의 선택은 환자의 연령, 직업, 개인습관, 전신질환 여부, 그리고 치료 시설에 따른 여건, 치료자의 취향 등의 여러 요인을 감안하여 결정되어지고 있다.
   레이저 성대절제술이나 후두 부분절제술 등의 수술적 치료는 치료기간은 짧지만 치료 후 발성기능이 나쁘고 수술에 따른 합병증이 병발할 수가 있다. 
   조기 성문암에 대한 방사선 치료는 약 7~8주의 치료기간이 소요되지만 치료범위가 협소하여 방사선에 따른 합병증이 경미하고 치료성적도 우수하며 치료 후 발성기능이 완전히 회복될 수 있는 장점을 가지고 있어 우선적인 치료방법으로 선택되고 있다.²⁾ 그러나 방사선 치료 후 국소치료에 실패하였거나 재발한 경우 구제수술로 후두 전적출술이 시행되는데 음성을 상실하고 방사선 치료에 의한 수술 후 합병증이 증가하며 무병생존율과 전체적인 생존율을 감소시킨다.³⁾
   이러한 사실은 방사선 감수성의 예측 여부의 중요성을 알 수 있는 한 예이며 여러 다른 종양에서도 이러한 방사선 감수성을 예견하기 위한 인자를 찾기 위해 여러 가지 분자생물학적 인자에 대한 접근이 시도되고 있다.⁷⁾ 그러나 인체의 다른 부위의 암은 두경부암과는 종양학적으로 서로 다를 수 있고 또한 두경부암을 대상으로한 지금까지의 연구만 하더라도 종양학적 특성이 서로 다른 원발 부위들을 혼합하여 시행된 것이 많고 병기 또한 다양하여 그 결과에 따라 임상적 의의를 찾기에 다소 무리가 있다. 그래서 본 연구에서는 그 대상을 성문암에만 국한하였으며 그 중에서도 방사선 치료 자체가 양질의 음성보존이란 관점에서 매우 의미가 있는 T1, T2의 조기 암만을 대상으로 하였다.
   세포고사(apoptosis)는 핵산분해효소 활성, 염색질 응축, 세포의 수축 및 분쇄 등을 포함한 형태학적 변화 및 생화학적 변화를 특징으로 하는 세포사(cell death)의 한 형태로 조직의 항상성을 조절하는 역할을 하며 이 과정은 유전자와 조직특이 호르몬이나 성장인자의 상호작용에 의해 조절된다. 대표적인 세포고사 조절유전자는 bcl-2, c-myc, p53 등이다. 최근 실험 연구 결과에 의하면 세포고사가 종양의 성장뿐만 아니라 방사선이나 항암화학요법 치료에 대한 종양의 반응성을 조절하는 중요한 역할을 한다는 것이 알려지고 있다.⁷⁾ 이러한 결과는 세포고사를 조절하는 유전자들이 방사선이나 항암화학요법에 대한 반응성을 예측할 수 있는 인자로서 연구대상으로 필요충분하다 할 수 있을 것이다.
   bcl-2 유전자는 유전자 손상에 대한 세포 반응의 중요한 조절 유전자로 그 산물인 bcl-2 단백은 여러 가지 자극에 의해 유도되는 세포고사를 억제하는 세포내 막단백으로 알려져 있다.⁸⁾ 이 암유전자는 여포성 림프종의 14번과 18번 유전자 전위의 결과로 발견되어졌으며, 전위의 결과로 bcl-2 유전자에 의한 세포고사가 억제되고, 이에 따라 세포증식이 일어나 종양이 발생한다. 혈액종양분야에서 초기의 광범위한 연구가 있은 후에 bcl-2 단백의 발현이 몇몇 고형 암종에서 예후 인자로서의 가치에 대한 연구가 진행되어 왔다.⁹⁾ Ong 등¹⁰⁾은 방광암환자 83명의 방사선 치료성적과 bcl-2 발현과의 상관관계를 분석한 결과 bcl-2 양성인 환자군에서 낮은 국소치료율과 생존율의 연구결과를 보였으며, Mukherjee 등¹¹⁾은 자궁경부암환자에서 방사선 치료의 반응과 생물학적 인자에 대한 연구에서 bcl-2의 양성은 자궁경부암의 방사선 저항성(radioresistance)과 관련이 있음을 보고하였다. 한편 Shinmoji 등¹²⁾은 식도 편평세포암 25명을 대상으로 방사선 치료의 반응성 예측 인자로서 bcl-2의 발현을 연구한 결과에서 예측인자로서 상관관계는 없었다. 두경부 종양 영역에서는 Gallo 등⁵⁾이 조기 두경부 편평세포암 환자들의 방사선치료 후 성적과 bcl-2 발현에 대한 상관관계를 분석하여 bcl-2가 과발현된 경우 재발이 증가하고 생존율이 감소한다는 결과를 얻어 blc-2의 발현이 방사선 저항성과 연관이 있음을 시사하였다. 또한 Aebersold 등¹³⁾이 97명의 방사선 치료를 받은 구인두암 환자를 대상으로 하여 bcl-2의 예후를 예측할 수 있는 인자로서 가치를 평가하기 위해 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 bcl-2의 발현이 방사선 감수성(radiosensitive)과 연관이 있다고 하였다. 그러나 Jung 등¹⁴⁾은 두경부 편평세포암종에서 방사선 조사 전후에 방사선 민감성 세포주와 저항성 세포주사이에 bcl-2 분포양상을 연구한 결과 대조군과 차이가 없음을 보고하였다. 본연구에서도 조기 성문암에서 방사선 치료 후 국소치료와 bcl-2 발현율과의 상관관계는 없었다.
   c-myc의 경우 bcl-2처럼 세포고사를 조절하는 유전자로서 잘 알려져 있으며 암의 형성과 치료의 대상으로서 특별한 관심을 받아왔으나, 치료에 대한 예후 인자로서의 연구는 아직 미비한 실정이다. 
   Riva 등¹⁵⁾은 두경부 편평세포암종을 대상으로 연구를 시행한 결과 c-myc의 과발현은 방사선 치료나 항암화학요법에 대한 감수성과 관련이 있었으나 장기 생존율을 예측하는데는 실패하였다. Sheridan 등⁴⁾은 두경부 편평세포암에서 수술 후 얻어진 조직을 배양하여 방사선을 조사시킨 후 반응여부와 c-myc에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하여 상관관계를 분석한 In vitro 연구를 시행하였는데 c-myc이 높은 수준으로 발현된 경우 방사선 감수성과 관련이 있음을 보고하였다. 저자의 경우도 Riva¹⁵⁾나 Sheridan 등⁴⁾의 연구에서처럼 c-myc의 양성발현과 국소치료와의 통계학적 의의가 있었으며(p=0.025) 이는 c-myc이 조기 성문암에서 방사선 감수성의 예측인자로서 가능성을 제시한 결과라 할 수 있겠다.
   EGFR은 분자량 170 kDa인 인당단백질로서 세포막에 걸쳐 존재한다. EGFR의 세포막외 영역(extracellular domain)은 EGF와 결합하고 EGFR의 세포막내 영역(intracellular domain)은 tyrosine kinases 활성을 갖는 부위로 EGF와 EGFR이 결합하여 여러 단계의 인산화를 거쳐 세포의 변형, 분열, 성장을 유발한다. 이러한 EGFR의 활성화는 종양 형성과 세포고사, 혈관신생, 원격전이 같은 종양의 진행에도 기여한다고 알려져 있다.¹⁶⁾ 일반적으로 EGFR의 과발현은 방사선이나 항암화학요법 같은 치료에 저항성과 관련이 있음이 알려져 있다.¹⁷⁾ Miyaguchi 등¹⁸⁾은 방사선 치료를 받은 성문암과 상악동암에서 EGFR 발현의 증가와 높은 재발율의 상관관계를 밝혀내어 이러한 종양세포들에서 EGFR의 발현양이 방사선 저항성과 연관이 있을 것으로 예측하였다. Sheridan 등⁴⁾의 연구에서도 EGFR의 높은 발현은 방사선 저항성과 관련이 있었다. 한편 Wen 등¹⁹⁾은 조기 후두암 68명을 대상으로 방사선치료 결과와 EGFR에 대한 면역조직화학적 연구의 상관관계를 통해 EGFR의 양성군과 음성군사이에 재발률에 있어 차이가 없음을 보고하였다. 그러나 본 연구에서는 통계학적 의의는 없었으나(p=0.297) EGFR이 양성이면서 방사선 치료 후 국소치료된 군이 57명 중 33명(57.9%), 국소치료 실패한 군이 13명(22.8%)으로 EGFR의 과발현이 방사선 감수성과 연관이 있는 것처럼 보여 다른 연구결과와는 상이한 결과를 보였다. 이러한 결과에 대해 다른 종양에서와는 달리 성문암에서 EGFR의 과발현이 방사선 감수성과 관련이 있을 가능성에 대해서도 고려해 보아야 할 것으로 사료된다.

결     론

   두경부 편평세포암종에서 방사선 치료에 대한 감수성을 예측할 수 있다고 알려진 bcl-2, c-myc, EGFR에 대하여 조기 성문암을 대상으로 면역조직화학적 연구를 시행한 결과 bcl-2와 EGFR의 발현은 방사선 치료 후 국소치료와 통계적 의의가 없었으나 c-myc의 경우 양성 발현과 국소치료와의 통계적으로 의의 있는 상관관계를 보여 방사선 감수성의 예측인자로서 가능성을 제시하였다.

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