교신저자：전시영, 660-702 경남 진주시 칠암동 90번지  경상대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   신경성 염증반응이란 다양한 유해자극에 의해 지각 신경 종말로부터 Substance P(SP)와 같은 신경전달물질이 유리되어 미세 혈관의 확장과 혈장삼출, 비만세포의 탈과립 등이 초래되어 일어나는 일련의 염증반응이라고 밝혀져 있다.¹⁾ 신경성 염증반응은 공기 중의 유해자극으로부터 기도를 보호하기 위한 방어기전의 하나로 알려져 있고, 비염, 알레르기 비염, 비과민성(nasal hyperreactivity) 등과 같이 이비인후과의 비과 영역에서 가장 흔히 볼 수 있는 질환의 발병기전에 관여한다. 공기 중에 존재하는 여러 가지 유해자극에 의한 단기간 혹은 장기간의 노출은 결국 호흡기도에서 여러 형태의 염증반응을 일으키게 된다. 일상적인 환경에서 존재하는 다양한 화학적 물질들에 의하여 발생되는 신경성 염증반응에 대한 많은 연구가 최근 보고되고 있다.²⁾ 한편으로 근래에 들어 산업화, 도시화가 되면서 호흡기도에서 유해자극에 대한 반복적 노출은 우리의 일상 생활에서 더욱 빈번하게 일어나고 있으며 이와 같이 유해자극의 반복적 노출이 호흡기도에서의 신경성 염증반응에는 어떠한 변화가 초래되는가는 아직 정확히 규명되지 않았다. 상기도에서 유해자극의 반복된 노출이 신경성 염증반응에 미치는 영향을 규명하면 상기도의 생리학적 혹은 병태생리학적 기전을 정확히 이해하는 것이 도움이 되리라 생각된다.
   Nitric oxide(NO)는 작고 비교적 불안정하고 독성이 있으며 두 개의 원자로 이루어진 무기가스로 정상적인 세포기능 발현에 관여하는 전달물질일 뿐만 아니라 여러 가지 병태생리학적인 기전에도 관여하는 것으로 알려져 왔다. 호흡기도에서 부분적으로 알려진 NO의 역할로서 비아드레날린, 비콜린성 신경세포의 신경전달 물질임이 보고되고 있고, 혈관 내피세포에서 NO는 혈관 운동성 및 혈장삼출에 관여한다고 보고되었다.³⁾ 그리고 기도 점막에서 생성된 NO는 세균에 대해 일차적인 기도방어를 하고, 기관지 평활근을 이완시켜 하기도에 대해 폐호흡을 조절하는 일종의 aerocrine messenger 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾⁵⁾ 신경성 염증반응에서 NO의 역할에 관한 연구로서 SP, calcitonin gene-related peptide(CGRP)와 같은 신경전달 물질들의 분비와 이에 따라 초래되는 혈관확장 및 부종의 형성에 관여하는 것으로 보고되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 또한 SP의 분비는 조직내 NO의 생성을 증가시킨다고도 보고되고 있다. 그러나 신경성 염증반응에서 보이는 NO의 분비 및 역할은 더욱 연구되어야 할 부분으로 남아 있고, 특히 반복적인 유해자극에 의한 신경성 염증반응의 변화에서 나타나는 NO의 생리학적 혹은 병태생리학적 역할은 아직 밝혀져 있지 않다. 이는 비점막 과민성, 비염 및 알레르기 비염 등의 병리 기전에 중요한 단서가 될 것으로 생각된다.
   Capsaicin은 지각 신경종말의 선택적 자극물질이며, 혈장 삼출은 신경성 염증반응의 주요 특징으로 알려져 있다. 본 연구의 목적은 유해자극에 반복 노출되었을 때, 호흡 기도점막에서의 신경성 염증반응의 변화를 살펴보고, 이와 관련하여 신경성 염증반응의 변화에서 NO의 역할을 규명하는 것이다. 이를 위해서 흰쥐의 capsaicin 노출/재노출 모델을 통하여 신경성 염증반응을 일으키는 capsaicin을 반복 투여하고, 신경성 염증반응의 척도로서 기관지와 비점막에서 혈장 삼출의 변화를 관찰하였다. 동일 모델에서 NOS 길항제와 기질로 전처치하여 비점막에서의 신경성 염증반응의 변화를 관찰하였으며, 아울러 형태학적 규명을 위해서 면역조직화학적 연구를 통하여, capsaicin에 노출된 비점막에서 iNOS의 발현 여부를 관찰하였다.

대상 및 방법

Capsaicin 재노출 후 시간 경과에 따른 혈장 삼출의 변화
   실험동물로는 체중 250~350 g의 외견상 건강해 보이는 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 사용하였으며 성별의 구분은 하지 않았다. 30마리의 흰쥐에 ketamine hydrochloride(Ketalar, 75 mg/kg)와 xylazine hydrochloride(Rampun, 10 mg/kg)의 혼합용액을 복강내 주사하여 자기호흡을 유지한 상태로 전신마취를 하고 꼬리 정맥을 확보하였다. 모든 흰쥐의 꼬리 정맥에 30 μM/ml capsaicin을 100 g 당 0.1 ml 씩 천천히 주사하였고, 이들을 6마리씩 나누어 각각 0, 1, 3, 6, 12시간 후에 동량의 capsaicin을 꼬리정맥에 주사하였다. capsaicin 재노출 5분 전 각 그룹의 모든 흰쥐에게 30 mg/kg Evans blue를 꼬리정맥에 주사하였고, capsaicin 재노출 5분 후 0.9% 생리식염수 300~400 cc로 관류하였다. 곧이어 1% paraformaldehyde(PFA) 용액 200~300 cc로 관류 고정하였으며, 이어서 비중격과 기관지에서 점막을 박리한 후 절편을 취하였다. 전술한 방법으로 얻은 조직의 무게를 구한 후 2 ml formamide 용액에 24시간 동안 60°C로 유지 배양하였고 이를 OD 620 ηm spectrophotometry로 측정하였다.

NOS 길항제 및 촉진제 전처치에 의한 capsaicin 재노출 후 혈장 삼출의 변화

NOS 길항제 전처치군
   Sprague-Dawley계의 6마리 흰쥐를 사용하였고 capsaicin 투여 3시간이 지난 후 capsaicin을 재투여 하였으며, capsaicin 재투여 1시간 전에 5 mg/ml L-NAME을 0.1 ml/100g 용량으로 꼬리정맥에 주사한 뒤 Evans-blue assay를 시행하였다.

NOS 길항제 및 촉진제 전처치군
   동일계의 6마리 흰쥐를 사용하였고 capsaicin 재투여 1시간 전에 5 mg/ml L-NAME과 300 mg/ml L-arginine을 각각 0.1 ml/100g 용량으로 꼬리정맥에 주사한 뒤 Evans-blue assay를 시행하였다.

결과 분석
   Spectrophotometry에서 측정된 각 그룹군의 Evans-blue 양의 평균치를 보정 후 구하여 비교 분석 하였다. 통계처리는 ANOVA를 이용하여 p<0.01의 유의 수준으로 검정하였다.

Capsaicin 노출 후 iNOS 발현의 면역학적 동정
   생후 4~6주 된 Sprague-Dawley계 흰쥐에 ketamine hydrochloride(Ketalar, 75 mg/kg)와 xylazine hydrochloride(Rampun, 10 mg/kg)로 복강내 마취를 하였다. 기관절개술을 시행하고 30 μM/ml capsaicin을 비공을 통하여 30 μl씩 주입하고 3시간 후 1% PFA용액 200~300 cc로 관류고정 하였고, 대조군은 생리 식염수를 비강에 점적하였다. EDTA(ethylene diamine tetra-acetic acid, 250 mM in PBS) 용액에 1주일간 탈회화(decalcification) 한 뒤 조심스럽게 조직을 취하였고 10~20 μm의 두께로 frozen cutting을 시행하였다. 0.5% periodic acid에 10분 처리하여 내인성 peroxidase의 활성화를 억제하였고 36°C의 blocking serum(3% normal goat serum and 1% bovine serum albumin)에 2시간 동안 반응하였다. 그리고 1：1,000 비율로 희석된 1차 항체(rabbit polyclonal iNOS, NOS type Ⅱ, Trans Lab)로 2시간 동안 36°C에서 반응한 뒤 2차 항체인 biotynylated anti-rabbit IgG(Vectastain ABC regent, Vector)를 1：200으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응하였다. avidin-biotin-complex(Vectastain ABC regent, Vector)에 1시간 동안 반응한 뒤 기질액 Karnovski-Ni 용액에 약 3분간 정색반응 후 methyl green으로 대조염색을 하였고 polymount로 포매하여 광학현미경으로 관찰하였다.

결     과

Capsaicin 재노출 후 시간 경과에 따른 혈장 삼출의 변화
   Capsaicin 전처치 후 시간대 별로 capsaicin 재투여를 하였을 때 비점막에서의 측정된 Evans-blue의 양이 각각 6.14±3.51, 12.46±0.47, 3.98±0.78, 2.00±0.29 μg/ kg으로 증가됨을 알 수 있었고, 3시간 후 capsaicin에 재노출되었을 때 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 기관지에서는 capsaicin에 재노출 되어도 조직내 삼출된 Evans-blue 양의 평균치는 시간대 별로 통계학적으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).

NOS 길항제 및 촉진제 전처치에 의한 capsaicin 재노출 후 혈장 삼출의 변화
   비점막에서 조직내 삼출된 Evans-blue양의 평균치를 보면, 대조군과 NOS길항제 전처치군은 각각 12.46±0.48 μg/kg과 5.47±1.40 μg/kg로 통계학적으로 유의한 차이를 보였으며, NOS 길항제 전처치군과 NOS 길항제 및 촉진제 전처치군 간에도 각각 5.47±1.40 μg/kg, 9.22±1.36 μg/kg로 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(Fig. 2).

Capsaicin 노출 후 iNOS 발현의 면역학적 동정
   대조군에서는 양성을 관찰할 수 없었으나 capsaicin 전처치군에서는 비강내의 분비물과 상피하층에 침윤된 염증세포들에서 강한 양성반응을 보였으나 혈관내피세포, 섬모세포, 비선 등에서는 양성반응을 관찰할 수 없었다(Fig. 3).

고     찰

   본 연구의 capsaicin 노출/재노출 모델은 기관지와 비점막을 동시에 자극시키기 위해 capsaicin을 전신적으로 투여하였으며, 그 결과로 비점막과 기관지 사이에는 서로 다른 모세혈관 투과성을 보였다. 이와 같은 차이점은 우선 구조적으로 비점막에서는 조밀한 지각 신경(sensory C-fiber)분포를 지니고 있고 기관지는 상대적으로 비교적 희박한 신경분포를 가지고 있다는 것으로 설명 될 수 있고,⁸⁾ 한편 비점막과 기관지는 유해자극에 대하여 서로 상이한 방어기전을 가지고 있음을 시사한다. 따라서 유해물질에 반복 노출된 후 비점막에서 축삭 반사에 의해 생기는 기도 방어기전은 상승되나 대조적으로 기관지에서는 변화되지 않는다는 것을 의미한다. Takeda 등⁹⁾은 비과민성에서 신경성 염증반응의 증가는 삼차 신경절에서 신경 전달물질의 합성이 증가되어 비점막에서 신경 말단으로 신경전달물질의 이동증가에 기인한다고 보고하였고, Sanico 등¹⁰⁾은 비점막에서 신경 과민반응은 신경 성장 요소의 존재로 설명하고 있다. 그러나 본 연구 결과에서는 capsaicin 투여 후 시간에 따른 결과의 차이를 보임에 따라 비점막에는 어떠한 유도기전이 있다고 생각되며, 여기에는 NO가 관여한다고 생각한다. 최근 여러 연구자들은 NO가 신경성 염증반응에서 혈장 삼출의 중요한 전달자로 작용한다고 보고하였다.¹¹⁾¹²⁾ 본 연구의 결과에서도 capsaicin에 재노출 되었을 때 현저히 증가되는 비점막에서의 신경성 염증반응은 NOS 길항제 전처치로 유의하게 감소하였으며, NOS 촉진제의 전처치로 회복되는 것을 볼 수 있었다. 이와 같은 결과는 capsaicin에 재노출 되었을 때 현저히 증가되는 비점막에서의 신경성 염증반응에는 NO가 관여하고 있으며, 그 기전으로 capsaicin에 노출된 비점막에서 iNOS가 발현되고, 재노출시 발현된 iNOS로부터 생성된 NO에 의해 신경성 염증반응이 증폭된다고 생각할 수 있었다. 비점막내 iNOS는 NO성 신경섬유, 혈관내피세포, 상피세포, 염증세포 등에서 발현된다고 알려져 있다. Lundberg¹³⁾에 의하면, 상피세포 특히 상악동내 상피세포에서 구조적으로 발현하는 iNOS가 있다고 하였고, Song 등¹⁴⁾은 capsaicin에 의한 흰쥐 및 기니픽 호흡기도점막 상피세포내에 iNOS의 발현을 보고하였다. 본 연구 결과에서는 비강내 분비된 삼출액과 상피하 염증세포들에서 강한 양성 발현을 보였으나, 혈관내피세포, 섬모세포, 신경섬유 그리고 선세포 등에서는 발현되지 않았다. 이와같은 결과로 capsaicin 재노출시 발현되는 신경성 염증반응의 증폭은 조직내 침윤한 염증세포들의 iNOS에 의한 NO의 생성에 의해 발생된다고 사료된다.

결     론

   Capsaicin에 의해 초래되는 흰쥐 비점막에서의 신경성 염증반응은 3시간 후 capsaicin에 재노출 되었을 때 현저히 증가하였고 기관지에서는 capsaicin에 재노출 되어도 신경성 염증반응은 유의한 변화를 보이지 않았다. 따라서 반복된 유해 자극에 대한 방어기전은 비점막과 기관지가 서로 상이하다고 생각된다. 또 capsaicin에 재노출 되었을 때 현저히 증가되는 비점막에서의 신경성 염증반응은 NOS 길항제 전처치로 유의하게 감소하였고, NOS 촉진제의 전처치로 회복되었으며, 면역조직화학 염색에서는 점막 상피층에 침윤한 염증세포와 비강내 삼출액에서 강한 양성을 보였으나, 혈관내피세포, 섬모세포, 선세포 그리고 신경섬유 등에는 발현되지 않았다. 이상과 같은 결과에서 capsaicin에 재노출 되었을 때 현저히 증가되는 비점막에서의 염증반응에는 NO가 관여하고 있으며, 그 기전으로는 capsaicin에 노출된 비점막에서 iNOS가 발현되고, 재노출시 발현된 iNOS로부터 생성된 NO에 의해 신경성 염증반응이 증폭된다고 사료된다.

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