교신저자：강준명, 420-717 경기도 부천시 원미구 소사동 2번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용(nasal polyp)은 비부비동 점막의 만성염증성 질환으로 부종성 점막이 주로 사골동과 중비도에서 비강으로 돌출한 것으로 비부비동염과 밀접한 연관이 있다. 
   비용은 배세포(goblet cell)의 증식, 기저막의 비후, 부종성 고유판 및 염증세포 침착 등이 특징적이다. 침착되는 염증세포는 형질세포(plasma cell), 림프구, 대포식세포, 호중구 이외에 가장 특징적인 호산구 등이다.¹⁾ 비용의 원인으로 Bernouilli 현상, 다당질 변화, 혈관운동의 불균형, 감염, 알레르기 등의 가설이 제시되고 있으나 아직 그 발생기전은 명확하지 않다.²⁾ 최근에는 공기의 와류나 바이러스-박테리아-숙주의 상호작용이 비부비점막의 염증반응을 일으키고 이 과정에서 여러가지 사이토카인들이 생성되고 이들이 염증반응을 증폭시키며, 이런 미세 환경의 구조적인 염증반응이 Na⁺의 세포 내 흡수를 증가시켜 부종을 유발하여 비용을 발생시킨다는 다인설이 제시되고 있다.³⁾ 호산구가 이런 염증반응에서 중요한 역할을 하며 조직학적으로도 호산구의 침착이 비용의 뚜렷한 특징이라고 할 수 있다.⁴⁾ 조직의 호산구 증가는 염증 반응이 있는 곳으로의 이동이 증가되고 조직 내에서 호산구의 세포자멸사(apoptosis) 지연에 의한 호산구의 생존이 길어지는 것이 주요기전으로 알려져 있다.⁵⁾ 최근 면역학적, 혈액종양학적 연구에 따르면 조직 내 침착된 호산구의 세포자멸사 지연에 IL-3, IL-5, GM-CSF 등의 사이토카인이 관여하며,⁶⁾⁷⁾⁸⁾ 또한 이들이 호산구의 세포자멸사 조절 유전자인 Bcl-2 family 유전자와 Bax 유전자의 발현에 어떤 영향을 미치는가에 대한 연구들이 보고되고 있다.⁹⁾¹⁰⁾ 비용에는 IL-3, IL-5, GM-CSF 등의 사이토카인이 증가되어있고, 비용에 침착된 호산구의 세포자멸사 지연에 대한 이들 사이토카인의 역할에 대해 연구되고 있으나,⁶⁾⁷⁾ 아직까지 비용에 침착된 호산구의 세포자멸사 지연에 관여하는 유전자에 대해서는 연구가 미미한 상태이다. 
   저자들은 주로 혈액세포에서 세포자멸사를 지연하는 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-x_L과 세포자멸사를 유발하는 pro-apoptotic 유전자인 Bax가 비용에서 어떻게 발현되는지 살펴보고 간접적으로 비용 내의 호산구에서의 발현에 대해서도 알아보았으며, 정상비점막에서의 Bcl-x_L과 Bax의 발현과 비교하는 동시에 비용에서 알레르기비염 동반여부가 이들의 발현에 어떠한 영향을 미치는가에 대해 연구하고자 하였다. 

재료 및 방법

대상 및 재료

대조군
   정상 비점막조직은 2001년 9월부터 2002년 2월까지 가톨릭 대학교 성가병원에서 알레르기비염이나 천식, 비질환의 과거력이 없는 비중격만곡증 환자(총 5명, 평균연령 38세, 남자 3명, 여자 2명)의 비중격 교정술 시 비후성비염이 없는 하비갑개의 정상 비점막에서 채취했다. 

실험군
   비용을 동반한 부비동염 환자의 비내시경 수술 시 채취한 비용을 대상으로 하였다. 채취한 조직은 모두 조직검사 상 비용으로 판명되었고 이때 알레르기비염을 동반한 환자 15명(평균연령 40.8세, 남자 9명, 여자 6명)과 동반하지 않은 환자 15명(평균연령 43세, 남자 8명, 여자 7명)을 구분하여 선택하였다. 알레르기비염은 수양성 비루, 재채기, 비소양증, 비폐색 등의 4가지 알레르기 코증상 중 2가지 이상이 있으며 흡입성 알레르기 항원 17종에 대한 항원 특이 면역글로블린 E 검사에서 양성을 보이는 것으로 진단하였고, 진단기준에 해당하지 않은 환자는 알레르기비염을 동반하지 않은 환자로 분류하였다. 모든 실험군 환자는 조직을 얻기 전 최소 4주간 국소용 및 경구용 항히스타민제와 스테로이드 제재의 사용을 금지했다. 

염색방법
   비용에서 호산구의 확인과 Bcl-x_L과 Bax의 발현을 알아보기 위한 방법으로 면역조직화학 염색법을 이용하였으며 Bcl-x_L과 Bax는 호산구를 염색한 절편의 연속된 절편에서 염색하였다. 호산구를 면역조직화학 염색하기 위하여 1차항체로 AHE-2(mouse anti-human eosinophil major basic protein, BD PharMingen International, CA)를 사용하였고, 2차항체로 anti-mouse IgG(Vector Labaro-tories, Inc., Burlingame, CA)를 사용하였다. Bcl-x_L과 Bax를 발현시키기 위해 1차항체로 rabbit anti-Bcl-x_L IgG(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)와 rabbit anti-Bax IgG(BD PharMingen International)를 사용하였고, 2차항체로 anti-rabbit IgG(Vector Labarotories)를 사용하였다. 이때 희석배율은 AHE-2과 Bcl-x_L의 일차항원은 1：50, Bax의 일차항원은 1：1000이었으며 냉동절단한 절편의 조직두께는 10 μm이었고 염색방법은 다음과 같았다. 수술 중 채취한 조직은 면역조직 화학적 염색을 위해 -20°C에서 동결 보관하였다. 이들을 냉동주형(cryomold)에 넣고 OCT compound(Tissue-Tek, IN)를 주입한 후 냉동 절단하여 대물유리에 부착시킨 다음 공기에서 건조시킨 후 4% paraformaldehyde에서 5분간 고정하고 PBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline, Gibco BRL, NY)로 세척한 후 0.3% H₂O₂로 5분간 처리하고 PBST(Dulbecco’s phosphate buffered saline+ Tween20(polyoxyethyl-enesorbitan monolaurate) Gibco BRL)로 3회 세척하였다. 말정상혈청(horse normal serum, Vector Labarotories)에서 20분간 반응시킨 다음 혈청을 떨어내고 1차항체(rabbit anti-Bcl-x_L IgG 또는 rabbit anti-Bax IgG)를 4°C로 하룻밤동안 반응시키고 PBST로 세척하였다. 2차항체(anti-rabbit IgG)로 37°C에서 30분간 반응시킨후 다시 PBST로 세척한 다음 ABC (avidin biotin complex, Vector Labarotories)를 37°C에서 30분간 반응시키고 PBST로 세척한 후 alkaline phosphatase 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole, Vector Labarotories)로 발색반응시키고 세척하였다. 이후 hematoxylin으로 대조염색하고 crystal mount하였다. 양성대조군으로 Bcl-x_L은 대장암조직을, Bax는 유방암조직을 이용하였다. 호산구의 면역조직화학 염색은 같은 방법을 사용하되 정상혈청으로 염소정상혈청(goat normal serum, Vector Labarotories)을 이용하였고, 1차항체(AHE-2)와 2차항체(anti-mouse IgG)를 반응시켰고 발색반응은 alkaline phosphatase 발색제인 fast red(BioGenex CA)를 사용하였다. 

통계처리 
   염색의 판정을 위해 광학현미경 고배율(×400)하에서 한 대물유리의 서로 다른 3시야에서 호흡상피 고유판 부위에 양성으로 염색된 호산구수를 계측하여 단위면적당 나타나는 갯수의 평균을 내었고 이때 단위면적은 1771 μm²이었다. 연속적으로 작성한 절편표본에서 같은 방법으로 Bcl-x_L 또는 Bax가 발현된 세포의 숫자를 세어서 평균을 구한 후 다음에 관하여 통계처리를 시행하였다. 모든 통계자료는 통계프로그램인 SPSS를 이용하여 분석하였다.
   1) Mann-Whitney test를 이용하여 비용군과 정상대조군 사이에서 호산구수, Bcl-x_L이 발현된 세포 수, Bax가 발현된 세포 수의 통계적 유의성을 평가하였다. 또한 비용군을 알레르기비염 유무에 따라 두 군으로 나눈 후(이때 알레르기비염을 동반한 환자에서 채취한 비용군을 A(+)군, 알레르기비염을 동반하지 않은 환자에서 채취한 비용군을 A(-)군이라고 하였다) 두 군사이에서도 이들을 비교하였다.
   2) Spearmann 상관분석법을 이용하여 비용군과 정상대조군 사이에서 호산구 수와 Bcl-x_L이 발현된 세포 수의 상관관계 유무와 호산구 수와 Bax가 발현된 세포 수와의 상관관계 유무를 평가하였다. 또한 A(+)군과 A(-)군 사이에서도 이들의 상관관계 유무를 평가하였다. 
   3) Mann-Whitney test를 이용하여 비용군과 정상대조군 사이에서 호산구 수와 Bcl-x_L이 발현된 세포 수의 비율 그리고 호산구 수와 Bax가 발현된 세포 수의 비율의 통계적 유의성을 평가하였다. 또한 A(+)군과 A(-)군 사이에서도 이들을 비교하였다. 

결     과

호산구 수
   코의 호흡점막에서 관찰된 호산구는 주로 호흡상피 밑의 고유판에 분포하고 있었으며(Fig. 1) 비용군에서는 호산구 수가 정상대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되어 있었으나(p<0.01) 비용군 내의 A(+)군과 A(-)군 사이에는 통계적인 차이가 없었다(Table 1). 

호산구 수와 Bcl-x_L 발현 세포 수의 관계
   호산구를 염색한 절편과 연속절편에서 관찰한 Bcl-x_L 발현 세포는 호산구가 많이 관찰되는 부위와 일치하고 있었고 주로 상피세포 밑의 고유판에 분포하고 있었다(Fig. 2). 호산구 수와 마찬가지로 Bcl-x_L 발현 세포 수도 비용군에서 정상대조군 보다 통계적으로 유의하게 증가되어 있었으나(p<0.01) A(+)군과 A(-)군 사이에는 차이가 없었다(Table 1). 또한 비용군에서 나타난 호산구 수와 Bcl-x_L이 발현된 세포 수는 서로 상관관계가 있었다(γ=0.90, p<0.01)(Fig. 3). 그러나 정상대조군에서는 호산구 수와 Bcl-x_L이 발현된 세포 수는 상관관계가 없었다. 

호산구 수와 Bax 발현 세포 수의 관계
   Bax 발현 세포도 호산구를 염색한 절편과 연속절편에서 호산구가 많이 관찰되는 부위와 일치하고 있었고 주로 상피세포 밑의 고유판에 분포하고 있었다(Fig. 4). Bax 발현 세포 수도 Bcl-x_L 발현 세포 수와 마찬가지로 비용군과 정상대조군 사이에서 통계적으로 유의한 차이를 보였으나 (p<0.01)(Table 1), 호산구 수와 Bax 발현 세포 수는 비용군에서 상관관계가 있는 것으로 나타났고(γ=0.90, p< 0.01)(Fig. 5), 정상대조군에서도 상관관계가 있는 것으로 나타났다(γ=0.83, p<0.01).

호산구 수와 Bcl-x_L 발현 세포 수의 비율 및 호산구 수와 Bax 발현 세포 수의 비율
   정상대조군과 비용군에서 호산구 수와 Bcl-x_L 발현 세포 수의 비율은 비용군에서 증가되어 있었으나(p<0.01), 호산구 수와 Bax 발현 세포 수의 비율은 두군 사이에 통계적인 차이가 없었다(Table 2) .

고     찰

   많은 만성염증성 질환에서 다형핵구의 세포자멸사 지연은 조직 내 세포 침착의 중요한 기전이다. 호산구의 조직 내 침착에서도 세포자멸사 지연이 주요 기전인데, 이때 IL-3, IL-5, GM-CSF가 호산구의 세포자멸사 지연을 유발시키는 사이토카인으로 알려져 있으며 특히 이중 IL-5는 비용 조직에서 호산구 세포자멸사 지연을 일으키는 것으로 알려져 있다.^6)7)8)9) Bcl-2 family는 주로 혈액세포에서 세포자멸사의 중요한 조절인자이고 그중에서 Bcl-2, Bcl-x_L, AI는 세포자멸사를 지연시키는 anti-apoptotic 유전자이고 Bax와 Bcl-xs는 세포자멸사를 유발하는 pro-apoptotic 유전자로 알려져있다.¹⁰⁾¹²⁾ 여러가지 실험결과에 의하면 주로 IL-5, GM-CSF 등의 사이토카인에 의하여 호산구가 자극되었을 때 세포자멸사가 지연되는데 이때 Bcl-x_L과 Bax는 높게 발현되었고 사이토카인의 자극이 없을 때는 세포자멸사가 진행되는데 이 때 Bcl-x_L은 낮게 발현되고 Bax는 계속 높게 발현되었다. 또한 Bcl-2, AI, Bcl-xs는 사이토카인 자극유무에 관계없이 발현이 되지 않거나 매우 낮게 발현된 것으로 나타났다. 따라서 호산구에서 세포자멸사를 억제시키는 유전자는 Bcl-x_L로 생각되며, Bax는 호산구의 세포자멸사에 큰역할을 하지 않는 것으로 생각되고 있다.¹⁰⁾ 지금까지 혈액에서 분리된 호산구에서 호산구의 세포자멸사 지연에 여러가지 사이토카인이 관여함이 밝혀졌고, 이때 발현되는 유전자에 대해서는 많은 연구가 진행되어왔다.^7)10)11) 그러나 조직 내 침착된 호산구에서 이들 유전자가 발현되는 양상에 대한 연구는 미미한 상태이며 특히 비용에 침착된 호산구에 대한 연구가 미미하다.
   저자들은 이 실험에서 정상비점막 보다 비용에서 호산구의 수가 증가되어 있으며 또한 Bcl-x_L 발현 세포도 비용에서 증가되어 있는 것을 관찰하였으며 이들의 출현부위가 일치함을 알 수 있었다. 또한 비용에서 호산구수와 Bcl-x_L 발현 세포 수 사이에 상관관계가 있었다. 이상에서 비용의 호산구에서 Bcl-x_L이 발현되었음을 간접적으로 알 수 있었다. 따라서 호산구 수와 Bcl-x_L 발현 세포 수의 비율을 전체 호산구 중 Bcl-x_L이 발현된 호산구 수의 비율이라고 가정할 때에 코폴립의 호산구에서 정상비점막의 호산구보다 Bcl-x_L의 발현율이 증가되어 있음을 통계적으로도 검정할 수 있었다(p<0.01). 그러나 Bax는 정상비점막의 호산구와 비용의 호산구 사이에 발현율의 차이가 없었다. 이는 혈액에서 분리한 호산구로 세포자멸사가 지연되는 조건을 만든후 Bcl-x_L과 Bax의 발현을 조사한 실험¹⁰⁾과 동일한 결과로 비용에서도 호산구의 세포자멸사 지연에 관여하는 주된 유전자는 Bcl-x_L임을 알 수 있다.
   한편 수십년 동안 알레르기가 비용 발생의 하나의 가설로 제시되어 왔는데, 그 이유는 비용 조직에서 90%이상에서 호산구 증가증을 보이고 천식과 관련이 있으며 비강소견이 알레르기비염과 유사하기 때문이었다.²⁾ 그러나 비용은 40세이후의 비(非)알레르기비염을 가진 천식환자에서 가장 많이 발견되며 알레르기천식(5%)보다는 내인성 비알레르기천식(13%)에서 그리고 알레르기비염(1.5%)에서 보다는 비알레르기비염(5%)에서 더 많이 발견되고 또한 비용의 히스타민치가 알레르기비염 환자와 알레르기비염이 없는 환자에서 차이가 없었고 비용 내의 호산구 수도 알레르기비염의 유무에 따른 차이가 없는 것으로 알려졌다.³⁾ 또한 병태생리적인 기전도 알레르기비염보다는 여러가지 인자가 관여하는 다인론이 제시되고 있다.³⁾ 
   본 실험에서도 알레르기비염을 동반한 환자의 비용과 동반하지 않은 환자의 비용에서 호산구 수의 차이나 Bcl-x_L 또는 Bax의 발현 세포 수의 차이를 볼 수 없어서 알레르기가 비용 조직의 Bcl-x_L 또는 Bax의 발현에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
   비용의 발생과 성장에서 호산구의 중요성은 많은 연구에서 증명이 되었다. 최근의 연구는 호산구의 세포자멸사 지연에 관여하는 사이토카인과 유전자에 집중되고 있는데, 저자들의 연구 결과 비용 내에서 호산구의 세포자멸사 지연에 관여하는 유전자는 anti-apoptotic 유전자인 Bcl-x_L임을 간접적으로 알 수 있었고 pro-apoptotic 유전자인 Bax는 영향을 미치지 않는 것으로 생각되었다. 그리고 알레르기비염의 유무는 이들 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 앞으로 비용 조직 내 호산구에서 직접적으로 Bcl-x_L을 검출할 수 있는 다양한 시도가 필요할 것으로 생각되며, 이에 관한 연구가 비용의 병태생리학적 기전을 밝히고 나아가 약물 치료법 개발에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. 

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