교신저자：여승근, 139-231 서울 노원구 하계 1동 280-1  을지대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   신경계에서 노화란 특정한 질병없이 진행되는 변화로서 신경세포의 수적 감소와 신경활성물질의 생화학적, 기능적, 형태학적 변화를 동반한다고 알려져 있다.¹⁾²⁾
   기존에 여러 학자들은 신경세포의 생성, 이동, 분화는 출생 직후와 영아기 이전에 종료되는 것으로 알았으나³⁾⁴⁾ 최근 포유류를 대상으로 한 실험에서 출생후에도 신경발생이 신경계 여러 곳에서 지속되고 있음이 증명되고 있다.^4)5)6)7)8)9) 후구의 사구체층과 과립층, 해마 치아이랑(dentate gyrus)의 과립층, 소뇌의 피질 등이 그 곳인데,⁷⁾¹⁰⁾ 이 중 해마에서 출생 후 지속되는 신경발생은 인간에서도 발견된 바 있다.¹⁰⁾ 신생 신경세포들은 이들이 처음 생성된 위치에서 각각 예정되어 있는 뇌의 일정한 부분으로 이동하여 그 기능을 수행하게 되는데, 이러한 신경세포의 이동에는 뇌실에서 연막(pia mater)으로 이동하는 방사상 이동(rostral migration)과 뇌의 표면에 평행하게 이동하는 접선이동(tangential migration)이 있다.¹¹⁾
   본 실험에서 이용한 doublecortin은 1998년 Gleeson 등이 인간의 뇌 피질에 변형을 가져오는 신경이동 질환인 이중피질 증후군(double cortex syndrom)에 대한 염색체를 분석하면서 발견한 유전자로서 이 doublecortin에 돌연변이가 발생함으로써 신경이동 질환이 발생함을 보고하였다.^12)13)14) 이후 여러 학자들에 의해 doublecortin은 중추 신경계와 말초 신경계에서 태생기와 출생후기에 유사분열 후 신경이동을 하는 신경세포에서 발현되는 일종의 인단백질(phosphoprotein)로서¹⁵⁾¹⁶⁾ 세포내 미세소관(microtuble)과 중복되어 위치한다는 것이 밝혀졌다.¹⁵⁾ 따라서 doublecortin은 신경이동 경로를 따라 분포하게 되며 태생기 뿐 아니라 출생후에도 후구와 같은 신경계의 일부에서 지속적으로 발현되게 된다. 
   이에 저자들은 doublecortin이 신경세포의 이동과 분화과정에서 발현되므로 노화와 관련된 신경발생의 좋은 지표가 될 수 있다는 가정아래 쥐의 노화에 따른 후구의 변화를 신경세포의 발생 측면에서 관찰하기 위해 doublecotrtin 양성세포의 변화에 대한 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

실험동물
   수컷 Fischer 344계 흰쥐를 사용하였고, 4개월군을 대조군으로, 24개월군을 노화군으로 하여 각각 7마리씩 희생시켰다. 실험동물은 밤낮 주기(12시간 light/12시간 dark)가 조절되며 온도는 22~25°C인 동물실에서 사육하였고 사료와 물은 풍부하게 공급하였다.

검체 및 조직의 처리
   실험동물은 pentobarbital sodium(60 mg/Kg)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후 좌심실을 통하여 0.05 M 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 1분간 주입하고, 0.1 M 인산염완충액(phosphate buffer)에 녹인 4% buffered paraformaldehyde용액(4°C)을 이용하여 50~60 ml/min의 속도로 10분간 관류 고정시켰다. 먼저 후구를 적출 하여 두께 40 μm의 관상 절편을 얻은 후 동일한 고정액에 담가서 16~18시간 동안 후고정을 실시한 다음 0.1 M PBS에 탄 20% sucrose용액에 2~5일간 보관하였다. 그리고 cryostat로 40 μm 두께의 연속 동결절편을 작성하였다.

면역 조직화학법
   1차 항체로는 doublecortin을 1：1000으로 희석하여 24시간 동안 4°C에서 반응시켰다. 항체용액에서의 반응이 끝난 후 조직을 PBS로 10분씩 3번 세척한 다음, anti-goat antibody를 1：100으로 희석한 2차 항체용액에서 90분 동안 실온에서 반응시켰다. 2차 항체용액과 반응 후, 조직을 PBS로 10분씩 3차례 세척한 avidin-biotin-peroxidase complex용액에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 발색제로는 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride를 0.05 M Tris완충 액에 0.02%, H₂O는 0.003%로 사용하였다. 발색반응은 상온에서 3~5분간 시켰으며, 반응이 끝난 후 조직은 gelatin-coated slide에 얹어서 2시간 동안 실온에서 건조시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. 일부는 면역조직화학 염색한 조직과 각 층을 비교 관찰할 목적으로 cresyl violet염색을 시행하였다.

Doublecortin 양성세포의 검색
   후구의 면역반응 양성세포의 분포는 각 층별로 집계하기에는 각 층간의 구분이 모호하고 층간에 겹치는 세포들이 많아 크게 상의하세포층(subependymal layer)과 그 주변부(peripheral area)의 두 부분으로 나누어 집계하였고, 또 면역염색성을 영상분석기(Multiscan, USA)를 이용하여 광학밀도를 측정하였는데, 이때에는 넓이가 매우 작은 승모층과 내망상층을 제외시키고 상의하세포층, 과립세포층, 외망상층, 사구체층, 후각신경층에서 각각 따로 측정하였다.

통계분석
   통계처리는 Mann-Whitney’s U-test를 시행하여 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   흰쥐 후구의 상의하세포층에서는 대조군보다 노화군에서 doublecortin 양성세포가 통계학적으로 의미있게 감소하였고(p<0.05), doublecortin 양성 신경섬유도 더 적게 관찰되었다(Table 1, Figs. 1 and 2). 주변부에서도 역시 노화군에서 doublecortin 양성세포가 의미있게 감소하였고(p<0.05), 특히 과립세포층에서는 doublecortin 양성 신경섬유들이 내측에서 외측으로 직선방향으로 주행하는 것이 관찰되었다(Table 1, Figs. 1 and 2). 상의하세포층, 과립세포층, 외망상층, 사구체층, 후각신경층등의 층별로 구분하여 측정한 두 군간의 doublecortin 면역염색성에 대한 광학밀도는 전체적으로 노화군에서 의미있는 감소를 보였고(p<0.05), 상의하세포층에서 가장 큰 감소폭을 나타내었다(Table 2, Fig. 3). 

고     찰

   신경의 발생은 신경세포의 증식, 이동, 분화 세 단계로 나누어 지는데,⁴⁾¹⁷⁾ 발생 초기에 전뇌에서는 뇌실층에서 전구세포(progenitor cell)가 증식하여 대뇌피질을 향하여 방사상으로 뻗어 있는 아교섬유(gliar fiber)를 따라 방사상 이동(radial migration)을 하여 대뇌피질에서 분화하는 1차 신경발생을 하게 된다.^6)7)10) 태생기에 측뇌실은 후구의 중심부로 뻗어나가고 그 주변에 뇌실하층을 형성한다.⁵⁾ 신경발생은 출생 후에도 이어져 뇌실하층에서 증식한 전구세포들이 아교섬유들이 뻗어있는 방향과 직각으로 소위 접선이동(tangential migration)을 일으켜 후구로 이동한 후 후구의 중심에서 방향을 바꾸어 후구의 표층으로 올라가면서 사이신경세포(interneuron)로 분화되는데, 이것을 2차 신경발생이라고 한다.^6)7)10) 후구에서는 출생 전 1차 신경발생에 의하여 승모세포와 속모세포가 형성되고, 출생 후 2차 신경발생에 의하여 사이신경세포인 과립세포와 사구체주위세포가 형성된다.¹⁾⁴⁾⁷⁾ 신경이동의 경로는 전구세포의 발생 장소와 발생 시기에 따라 결정되며 그 최종 목표지와 분화할 세포들에 대한 정보는 이미 신경발생 초기에 결정되어 있는 것으로 보인다.⁶⁾
   후구에서의 2차 신경발생은 사이신경세포들을 끊임없이 증식, 이동, 분화시켜 소멸되는 세포들을 보충함으로써 후각기능에 중요한 역할을 담당하고 있다.¹⁸⁾ 후구로 들어온 후각신호는 대뇌의 후각피질로 전달되는 과정에서 과립세포와 사구체주위세포 두가지 사이신경세포에 의한 일련의 정제과정과 억제과정을 거치게 되는데,¹⁷⁾¹⁸⁾ 이러한 과정이 후각의 감별에 중요한 역할을 담당하고 있을 것으로 추정되며, 이것은 이것은 쥐를 대상으로 한 동물 실험에서 입증되었다.¹⁸⁾
   본 실험에서 이용한 doublecortin은 태생기의 1차 신경발생 뿐만 아니라 출생 후에 일어나는 2차 신경발생에서도 관찰되는데 대뇌에서는 그 발현이 나이가 들수록 줄어들어 어른에서는 거의 관찰되지 않지만 2차 신경발생이 일어나는 신경계에서는 출생 후에도 계속 발현되는 것이 관찰된다. 즉 성숙한 쥐의 전뇌의 뇌실하층과 문측이동흐름(rostral migrtory system)을 거쳐 후구에 이르기까지 후구를 향하여 신경이동이 일어나는 경로와 그 밖에 해마, 뇌량, 선조체, 배상 피질(piriform cortex) 등에서 관찰된다.¹⁶⁾ 이와같이 doublecortin은 신경세포의 분열후 신경이동을 하고 있는 신경세포와 분화하는 신경세포에서 발현되므로,^14)15)16) doublecortin이 신경계의 이동과 분화과정에 어떠한 역할을 수행하고 있으며 신생 신경세포의 지표가 될 수 있다는 가설을 세울 수 있다.
   Doublecortin은 신경세포내에서 핵을 반지모양으로 둘러싸면서 세포기질의 변연부에 위치하고 있으며¹⁵⁾ 이동중인 신경세포의 체부와 선도돌기(leading process), 그리고 분화중인 신경세포의 축삭 등에서 발견되는데,¹⁴⁾ 이것은 세포 골격을 이루는 미세소관과 중복되어 분포하는 것으로 밝혀져 있다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 신경세포 기질내에는 세포를 구조적으로 지지하는 세포골격으로서 미세소관(microtuble), 미세섬유(microfilament), 신경사(neurofilament)의 3가지 섬유사가 있는데, doublecortin의 경우 이 중 특이적으로 미세소관과 중복되어 물리적으로 가깝게 위치한다.¹⁵⁾ 미세소관은 세포분열시 복제된 염색체를 서로 반대방향으로 정열시키고, 신경세포내에서 신경전달물질의 운반을 원할히 할 뿐아니라 신경이동시 선도돌기(leading process)를 뻗게하고 핵전위(nuclear translocation)에 중요한 역할을 담당하고 있으며,¹⁹⁾ 이러한 미세소관의 주위에는 미세소관 관련단백질이 존재하는데, doublecortin은 기존에 발견되었던 tau, MAP-2 단백질 계열과는 아미노산 구성이 전혀 다른 새로운 미세소관 관련단백질로 밝혀졌다.¹⁵⁾¹⁹⁾ Doublecortin은 미세소관을 구성하는 튜블린 분자와 직접 결합하여 중합반응을 통하여 미세소관의 전체 길이에는 영향을 미치지 않으면서 미세소관을 여러 다발로 bundling시키는 기능을 수행하여 안정화시키는 기능을 수행한다.¹⁵⁾
   실험적으로 미세소관을 기능적으로 억제시키는 colchicin을 이용하여 탈중합 시키면 doublecortin이 미세소관과의 중복에서 이탈하여 세포기질내에 산재되는 것을 관찰할 수 있으며, doublecotin을 과발현(overexpression) 시켰을 때는 미세소관 다발의 여러 가지 형태학적 변형이 나타나게 되고 이것은 colchicin을 이용한 탈중합반응에도 내성을 나타낸다는 보고가 있다.¹⁵⁾ 이러한 실험 결과는 doublecortin이 미세소관의 구조적 변화와 안정화를 통하여 신경이동에 일정한 역할을 담당하고 있음을 시사한다.¹⁵⁾
   본 연구 결과에서 쥐의 후구에서 doublecortin 양성세포가 대조군보다 노화군에서 의미있게 감소하였고, 광학밀도의 감소는 후구의 전층에 걸쳐 나타나 출생 후 일어나는 2차 신경발생이 노화가 진행함에 따라 감소함을 알 수 있었다. 그 감소폭은 층별로 약간의 차이가 있었는데 광학밀도에서 가장 큰 감소폭을 나타낸 곳은 상의하세포층이었고, doublecortin 양성세포의 수도 상의하세포층이 주변부보다 더 많은 감소폭을 보였다. 이것은 상의하세포층에 상대적으로 많은 doublecortin 양성 신경아세포들이 분포하므로 노화에 따른 신경발생의 감소에 더 민감하게 반응한 것으로 보인다.
   그러나 2차 신경 발생에 의해 형성되는 과립세포와 사구체주위세포의 체부가 위치하는 과립세포층과 사구체층보다 후각신경층에서 doublecortin 광학밀도가 더 높게 측정된 것은 의외의 결과였다. 이것은 후각계의 2차 신경발생이 중추신경계에 국한되는 것이 아니라 말초신경인 후각신경까지 포함하여 일어나고 신경이동이 후구를 벗어나 비점막의 후각수용세포 까지도 진행할 수 있음을 시사하는 것이다. 즉 지금까지 알려진 바와 달리 2차 신경발생에 의하여 과립세포와 사구체주위세포 뿐만 아니라 후각수용세포도 발생될 가능성이 있을 것으로 사료된다.
   전체 doublecortin 양성 세포가 상의하세포층에서 차지하는 비율은 4개월군에서는 35.2%, 24개월군에서는 29.9%로 상대적으로 높은 편이지만 doublecortin 면역염색성에 대한 광학밀도를 측정하였을 때는 4개월군과 24개월군에서 모두 상의하세포층이 다른층에 비해 낮은 광학밀도값을 나타내었다. 그 이유는 doublecortin은 신경세포의 체부와 돌기들에서 염색되는데, 상의하세포층은 후구로 뻗어 나가는 신경아세포들이 응집되어 모여 있는 곳으로 세포의 숫자는 많지만 그 세포들이 짧은 선도돌기(leading process)와 꼬리돌기(trailing process)를 가진 방추체 모양의 작은 세포들로¹⁶⁾¹⁹⁾ 구성되어 있기 때문에 세포의 숫자에 비하여 광학밀도는 높게 측정되지 않고, 그 신경아세포들이 주변부로 이동하면서 여러개의 돌기들을 가지는 성숙한 사이신경세포들로 분화해 나가기 때문에 주변부는 신경세포의 숫자에 비하여 광학밀도가 높게 측정된 듯 하였다.
   특히 과립세포층에서 관찰된 doublecortin 양성 신경 섬유들의 주행방향은 후구에서 일어나는 신경이동의 방향과 일치하여 doublecortin과 신경이동과의 연관성을 확인할 수 있었는데, 이것은 다른층에서는 여러 방향으로 뻗어있는 돌기들과 여러 신경세포의 체부, 그리고 복잡한 신경연접들이 산재해 있는 반면, 과립세포층은 2차 신경발생으로 생성되는 과립세포의 체부와 신경이동 방향으로 뻗어있는 돌기들이 밀집해 있는 비교적 두터운 층이므로 신경이동의 방향이 잘 나타난 듯 하였다.
   그러나 doublecortin은 신경이동과 분화중인 신경세포에서 발현되는 단백질이므로 세포의 분열이나 증식의 단계에서의 변화는 배제되었다고 볼 수 있다. 또한 출생 후 발생되는 사이신경세포(과립세포, 사구체주위세포)는 발생과 동시에 먼저 발생된 신경세포의 소멸이 진행되므로 이 두가지 단계의 비율도 노화에 영향을 미칠 것으로 사료되며 또한 태생기에 발생한 승모세포와 속모세포의 위축과 소멸도 후구의 노화에 영향을 미칠것이기 때문에 신경발생과 소멸에 있어서 이러한 여러 가지 복합적인 요소가 후구의 노화에 따른 변화를 초래할 것이다. 그리고 이러한 변화의 과정들이 후각기능의 최소한 일부분을 퇴화 시킬 것으로 사료된다.

결     론

   쥐의 후구에서는 일생동안 신경발생이 일어나며 신경이동과 분화의 과정에서 doublecortin이 발현됨을 관찰할 수 있었다. 또한 후구에서 출생 후 일어나는 2차 신경발생이 노화에 따라 변화하는 것을 doublecortin을 이용하여 간접적으로 관찰하였으며 노화가 진행함에 따라 신경발생이 감소함을 알 수 있었다.

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