교신저자：이흥만, 152-703 서울 구로구 구로동 80번지  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   만성 비부비동염은 이비인후과 외래에서 흔히 볼 수 있는 만성 염증성 질환으로 치료로는 항생제가 필요하고 항생제 치료에 반응이 없는 만성 및 재발성 환자의 경우에는 수술적 치료가 필요하다. 따라서 이러한 만성 비부비동염 질환의 병태를 이해하는 것은 새롭고, 효과적인 치료 선택을 제공할 수 있다.
   계면활성제(surfactant)-관련 단백인 surfactant protein A(이하 SP-A로 약함)와 surfactant protein D(이하 SP-D로 약함)는 collectin이라고 명명지워진 교원성 숙주방어 lectin 군의 하나이다. 계면활성제 단백은 폐 상피세포에서 유래된 단백으로 여러 병원성 세균에 대한 선천 면역 반응의 구성요소로서 중요하고, 면역 및 염증 반응에도 관여한다.¹⁾ Collectin은 여러 미생물에 의하여 표현되는 glyco-conjugate와 지질 모이어티(moiety)에 부착하며, 백혈구의 기능을 조절하고 미생물의 살균력을 증가시키며, 보체와 상호 작용하여 신체의 방어기전에 관여한다. 따라서 기도에서 collectin의 후천적 혹은 유전적 변형은 감염에 쉽게 이환된다.
   최근 폐에서 존재하여 표면장력을 줄이고 국소 면역에 관여하는 계면활성제는 중이강(middle ear cavity)의 세척액과 중이 상피세포에서 존재가 보고되었다.²⁾ 위축성 비염 환자의 비즙에서는 생화학적으로 계면활성제의 구성 성분인 인지질(phospholipid)이 유의하게 감소되어 있고,³⁾ 전자현미경적으로 계면활성제와 같은 층판체(lamellar body)가 인간의 비점막에서 관찰되었다.⁴⁾ 그러나 인간의 비강 및 부비동 점막에서 이러한 계면활성제의 존재를 조직학 및 분자생물학적으로 관찰한 보고는 없다.
   본 연구의 목적은 정상인과 만성 비부비동염 환자의 비점막에서 SP-A와 SP-D mRNA 발현을 역전사-중합효소반응(RT-PCR로 약함)의 방법으로 비교 관찰하고, SP-A와 SP-D단백의 국재를 면역조직화학적 염색으로 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

대  상
   만성 비부비동염으로 진단 받은 10명(남 5명, 여 5명, 평균연령 34.5세)의 환자를 대상으로 하였다. 만성 비부비동염의 진단은 만성 비부비동염에 대한 미국 이비인후과학회의 기준에 따랐다.⁵⁾ 즉 병의 이환 기간이 12주 이상이고, major factor(facial pain/pressure, facial congestion/fullness, nasal obstruction, nasal discharge, hyposmia/anosmia, purulence in nasal cavity on examination, fever)가 2개, 1개의 major factor와 2개 이상의 minor factor(headache, fever, halitosis, fatigue, dental pain, cough, ear pain/pressure/fullness) 혹은 신체 검사상 비루가 있는 경우로 하였다. 또한 부비동 컴퓨터 단층 촬영에서 각각의 부비동에서 범발성 점막 비후를 보이는 경우로 하였다. 최근 1개월간 상기도 감염이나 스테로이드 및 기타 약제의 투약한 환자와 비내 수술을 받았던 환자는 대상에서 제외하였다. 대조군은 외비성형술을 시행한 환자 10예(남자 6예, 여자 4예, 평균연령 32.3세)에서 채취한 정상 하비갑개 점막을 사용하였다. 모든 대상은 알레르기 검사에서 음성을 보였다.

검체의 채취 및 처리
   국소 마취하에 하비갑개 전단으로부터 1 cm 뒤에서 비점막을 겸자를 이용하여 채취한 후 일부조직은 10% formal-dehyde 용액(pH 7.6)으로 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μm두께의 절편을 만들었고, 다른 조직은 역전사-중합효소반응을 위해 -70°C의 냉동고에 보관하였다.

면역조직화학적 염색 및 관찰
   면역조직화학적 염색은 universal LSAB kit(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase comlpex법으로 하였다. 파라핀 조직 슬라이드를 탈파라핀시킨 후 내인성 페록시다아제 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H₂O₂로 15분간 처리하고 인산완충용액(pH 7.6)으로 세척하였다. 비특이적 항원-항체반응을 억제하기 위하여 30분간 정상 염소혈청으로 처리한 후 다크론성 SP-A(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)항체와 SP-D 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)로 4°C에서 24시간 동안 처리하였다. 이차항체로 biotinylated anti-goat immunoglobulin을 사용하여 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척 후 avidin conjugated horse-radish peroxidase에 30분, 3,3'-diami-nobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. 대조염색은 Meyer's hematoxylin으로 5분간 반응시켰고 음성 대조군은 위 과정 중 일차항체 대신 인산완충용액 혹은 비-면역 혈청 IgG를 사용하여 실험하였다.

역전사-중합효소반응
   총 RNA는 TRIzol reagent(Life technologies, Gaithersburg, MD)를 사용하여 표본으로부터 분리한 후 총 0.5 μg의 RNA를 oligo-(dT)12-18 primers와 Molohey murine leukemia virus역전사 효소(Life technologies, Gaithersburg, MD)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. SP-A1, A2와 D의 exon을 증폭시키기 위하여 시발체(primer)를 사용하였으며(Table 1), 중합효소반응 산물의 길이는 SP-A1에서 376 bp, SP-A2에서 376 bp, SP-D에서 972 bp이었다. 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer, Foster City, CA)에서 94°C에서 5분간 변성시킨 후, 94°C에서 45초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분 주기로 약 35회 증폭한 후 최종 72°C에서 약 7분간 반응을 연장시켰다. 중합효소반응 산물은 2% agarose 겔에서 전기 영동을 한 후 관찰하였다. 비점막으로부터 얻은 PCR 산물은 agarose 젤로부터 짤라서 TA cloning kit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA)을 사용하여 subclone 시킨후 염기서열을 확인하였다.
   양성 대조군으로 인간 폐조직을 이용하였고 음성 대조군으로는 시발체 대신 인산완충용액을 사용하였다. Housekeeping 유전자는 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하여 각각의 중합효소 반응 띠의 강도를 NIH image analysis software(National Technical Information Service, Springfield, VA)를 이용하여 분석하였다.

통계학적 처리
   모든 통계자료는 Macintosh용 통계 프로그램인 StatView II(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA)를 이용하여 mean SE로 나타내고, 각군 간의 비교는 Mann-Whitney U test로 시행하였으며, p<0.05를 통계적 의미로 두었다.

결     과

SP-A mRNA와 SP-D mRNA의 발현
   SP-A1 mRNA와 SP-D mRNA는 정상 비점막과 만성 비,부비동염 환자의 비점막 모두에서 발현되지 않았다(Fig. 1). 그러나SP-A2 mRNA는 만성 비부비동염과 정상 대조군 모두에서 발현되었으며(Fig. 1), SP-A2/GAPDH mRNA ratio는 만성 비부비동염에서 정상 대조군 보다 유의하게 증가하였다(p<0.05, Fig. 2). SP-A1, SP-A2, SP-D mRNA는 양성 대조군에서는 발현되었고 음성 대조군에서는 발현되지 않았다. 비점막으로부터 얻은 PCR 산물은 분리하여 염기서열을 확인하였다. 각각의 비점막 조직에서 얻어진 SP-A1, SP-A2에 대한 염기서열은 이미 발표된 염기서열과 일치하여 정확한 전사물(transcript)이 PCR 에서 증폭되었다는 것을 확인할수 있었다.

SP-A와 SP-D 단백의 국재
   SP-A단백은 정상인과 만성 비, 부비동염 환자의 비점막에서 상피세포와 점막하 분비선에서 발현되었다(Fig. 3). 만성 비부비동염 환자의 비점막에서의 면역염색 정도는 정상인에 비하여 강하게 염색되었다. 그러나 SP-D 단백은 정상 비점막과 만성 비, 부비동염 환자의 비점막에서는 모두 발현되지 않았다(Fig. 4). 음성 대조군에서는 면역염색 양성세포가 관찰되지 않았다.

고     찰

   폐포의 계면활성제는 주로 dipalmitoyl phosphatidyl-choline으로 구성되는 인지질로 폐포의 안정성을 유지하는 필수적인 단백이다. SP-B와 SP-C는 국소 면역기능이 없지만 표면 장력을 낮추는 반면에 SP-A와 SP-D는 국소적으로 면역기능을 나타내며, SP-A는 표면장력을 낮추는 기능도 가지고 있다.¹⁾ 이관에서는 SP-A와 SP-D가 모두 존재하여 국소 면역을 담당하나 이관 개존성 유지에 관한 이들 단백의 기능은 밝혀져 있지 않다.⁴⁾ 
   인간의 SP-A는 SP-A1와 SP-A2의 두 유전자에 의해 합성되며 이 두 유전자의 핵산 서열은 94%가 일치하고 아미노산 서열은 96%가 동일하다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾ SP-A 삼합체(trimer)는 두개의 SP-A1 분자와 한 개의 SP-A2 분자로 이루어지며 여섯 개의 SP-A 삼합체가 모여 SP-A 한 분자를 구성하여 작용을 나타낸다. 반면 SP-D는 SP-D라는 한 개의 유전자에 의해 합성되며 네 개의 SP-D 삼합체가 모여 SP-D 한 분자를 구성하여 작용을 나타낸다.¹⁾⁹⁾ SP-A mRNA는 태아의 기관과 주기관지에서 발현되며, 특히 기관에서 가장 높게 발현되었다.⁶⁾ 
   저자들은 정상 비점막과 만성 비부비동염 점막에서 SP-A1, A2 및 D mRNA의 발현과 SP-A와 SP-D 단백의 발현 여부를 연구하였다. SP-A단백은 정상 대조군과 만성 비부비동염 환자 모두에서 비점막 상피층과 점막하 분비선에서 발현되었다. 그러나 SP-D 단백은 발현되지 않았다.
   SP-A와 SP-D는 주로 2형 폐세포(pneumocyte)에서 합성되는 collectin계열의 단백으로 폐포에서 세균이나 바이러스에 대한 국소적인 방어 기능을 나타낸다.²⁾¹⁰⁾ 옵소닌(opsonin)으로 작용을 하여 대식세포의 병인체 포식작용을 촉진시키고, 대식세포 자체의 활성도를 증가시킨다.^2)10)11) SP-A와 SP-D는 이러한 선천면역반응(innate immune response)뿐만 아니라 입양면역반응(adaptive immune response)에도 관여하여 임파구의 증식을 억제하여 폐조직 손상을 방지한다.¹²⁾ SP-A와 SP-D는 이러한 면역기능이외에도 산소의 자유기(free radical)로부터 폐포내 인지질과 대식세포를 보호한다.¹³⁾ 이들 단백은 폐포에서 뿐만 아니라 기관이나 주기관지의 호흡기 상피층과 점막하 분비선에서도 발현되고 이관이나 중이 점막에서의 발현된다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 또한 SP-D는 타액선과 누액선에서도 발현된다.²⁾⁴⁾ 부비동과 비점막은 같은 호흡기 상피로 구성되어 있기 때문에 SP-A나 SP-D가 존재할 가능성이 있다.
   McIntosh등¹⁶⁾의 백서 기관을 통해 lipopolysaccharide로 자극을 주어 급성 염증을 유발한 실험에서 백서 폐 조직에서 자극 후 첫 24시간에 SP-A 농도가 가장 높게 오른 후 72시간까지 지속되었고, 폐세척액에서 SP-A와 SP-D의 농도는 자극 72시간 후 유의하게 증가하였다. 급성 염증기때 SP-A와 SP-D의 증가는 TNF-α와 IL-6등의 cytokines의 증가에 기인하며, 만성 염증기 때에도 이런 cytokines에 의해 염증반응이 지속된다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 천식 환자의 기관지 세척액에서는 SP-A와 SP-D가 증식되어 알레르기 염증으로부터 폐 조직을 방어한다.¹⁸⁾ 
   본 연구에서 정상 비점막과 만성 비부비동염의 비점막에서의 역전사-중합효소반응을 이용하여 SP-A1, A2와 D mRNA의 발현을 조사하여 SP-A2 mRNA만이 비점막에서 발현되었다. 또한 만성 비부비동염의 비점막 조직에서 정상대조군의 비점막 조직에서 보다 SP-A2 mRNA 발현이 유의하게 증가되었다. SP-A1 mRNA는 전혀 발현되지 않는 것으로 미루어 비점막에서 발현되는 SP-A 단백은 SP-A2 단백이라고 생각되며 폐 조직에서 발현되는 surfactant 체계와는 다른 것으로 생각된다.
   본 실험의 결과에서 인간 비점막에서는 SP-A 단백과 SP-A2 mRNA가 발현되며, 만성 비부비동염 환자에서의 SP-A2 mRNA의 발현이 증가되는 것은 만성 염증에 대한 방어 기전으로 발현이 증가되는 것으로 생각되며, 추후 만성 비부비동염에 있어 SP-A 발현기전에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   SP-A는 인간 비점막에서 발현되며, 만성 비부비동염 환자의 비점막에서는 SP-A2 mRNA가 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 폐에서와 같이 인간 비점막에서도 SP-A는 외부 세균의 침입에 대하여 방어 작용을 하는 것으로 생각된다.

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