교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   염증반응에 관여하는 prostaglandin의 생합성과정은 여러 가지 사이토카인이나 염증성 매개 물질이 관여하는 아주 복잡한 과정으로 이 중 cyclooxygenase(COX)가 중요한 역할을 담당한다.¹⁾ COX는 두 가지 형태가 존재하며 COX-1은 대부분의 세포에서 발현되어 세포의 항상성 유지에 관여하고,²⁾ COX-2는 특정세포에서 염증성 전구사이토카인³⁾이나 lipopolysaccharide,²⁾⁴⁾ 성장인자⁵⁾등에 의해서 발현이 증가되어 염증반응을 진행시키는데 중요한 역할을 하는 효소이다.
   사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현은 염증성 전구사이토카인에 의해서 이루어지며¹⁾ 이러한 COX-2의 발현과정에는 여러 단계의 신호전달(signal transduction) 물질이 관여할 것으로 생각된다. 한편, 염증반응에서 COX-2발현에 관여하는 신호전달체계를 이해하는 것은 사람의 호흡기 염증반응을 조절하는데 필수적이라고 생각된다.
   최근 연구에 의하면 Kim 등⁶⁾은 NCI-H292 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의해 COX-2 유전자 및 단백이 발현되며 이는 전사단계에서 조절된다고 보고하였다. 한편 Lin 등⁷⁾은 인체 호흡기 상피세포에서 IL-1β가 COX-2의 발현을 자극하는 과정에서 protein kinase C-γ(PKC-γ)의 관련여부를 연구하였고, Chen 등¹⁾은 인체 폐상피세포에서 TNF-α에 의한 COX-2의 발현에서 phospholipase C-γ2, protein kinase C-α, tyrosine kinase 등의 관련여부를 연구하였다. 하지만 인체 기도 상피세포에서 IL-1β가 COX-2 유전자의 발현과 단백생성을 촉진하는 과정에 있어서 mitogen-activated protein kinase(MAPK)와 PKC가 관여하는지 여부와 두 신호전달물질간의 상호관계는 명확하지 않다.
   이에 저자들은 사람의 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의한 COX-2 발현 과정에 PKC, MAPKs, tyrosine kinase, phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) 등과 같은 신호전달물질이 관여하는지 여부와 각 물질간의 상호작용에 대하여 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

세포배양 및 처치
   사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포(human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line, American Type Culture Collection, Rockville, MD)를 6개의 실험판에 1×10⁶ /ml의 세포 수로 RPMI 1640 배양액(10% fetal calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 추가)이 들어있는 배지에 분주하여 37°C, 5% CO₂에서 배양하였다. 배양이 어느 정도 이루어지면, 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 human recombinant IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 20 ng/ml의 농도로 투여하고 37°C에서 8시간 동안 배양하여 COX-2 유전자와 단백의 발현정도를 분석하였다.
   IL-1β에 의한 COX-2의 발현에 어떠한 신호전달체계가 관여하는지를 알아보기 위하여 mitogen-activated protein kinase kinase(MEK)/extracellular regulated kinase(ERK) 억제제인 PD98095(Biomol Research Labora-tories, Inc., Plymouth Meeting, PA), p38 억제제인 SB203580(Biomol Research Laboratories), protein kinase C(PKC) 억제제인 Ro31-8220(Biomol Research Laboratories), tyrosine kinase 억제제인 genistein(Bio-mol Research Laboratories), PI3K 억제제인 LY294002 (Biomol Research Laboratories) 등을 IL-1β를 투여하기 1시간 전에 각각 전처치하고, 8시간 동안 IL-1β를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 검토하였다.
   모든 실험과정은 같은 결과가 5회 이상 나오도록 반복하였다.

RT-PCR에 의한 COX-2 유전자의 분석
   총 mRNA의 추출은 배양한 NCI-H292 세포에서 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하였다. COX-2 유전자의 측정은 변형된 reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을 이용하였다.⁸⁾ 총 mRNA는 무작위 hexanucleotide primer와 Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. PCR과정은 94°C에서 12분간 전 처리하고 denaturation은 95°C에서 1분, annealing은 54°C에서 1분, extension은 72°C에서 1분간 22번을 반복 실시하였으며 마지막으로 72°C에서 20분간 반응하였다. PCR의 산물은 1% Tris-boric acid-EDTA(TBE) 완충용매와 2% agarose gel에서 전기영동을 이용하였다.
   COX-2 유전자의 primer의 염기서열은
   5'：TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT,
   3'：AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT이다.

Western blot에 의한 단백 측정
   COX-2 단백과 MAPKs 및 인산화되어 활성화된 MAPK의 측정에 Western blot 방법을 사용하였다.
   NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl , 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백질을 추출하여 정량을 하였다. 정량한 단백을 10% SDS-polyacrylam-ide gel에 80 μg을 주입하여 2시간 동안 20 mA에서 전기영동을 하였다. 분리된 단백을 300 mA로 3시간 동안 방치하여 니트로셀룰로오스막에 이동시킨 후, 5% non-fat milk로 비특이적 단백 결합을 방지하였다. 일차항체인 COX-2 polyclonal antibody(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) 및 ERK, p38, c-Jun NH₂ terminal kinase(JNK), phospho-ERK(New England BioLabs, Beverly, MA), phospho-p38(New England BioLabs), phospho-JNK(New England BioLabs) 항체를 각각 1：2,000으로 희석하여 4시간 동안 반응시킨 후, 이차항체인 goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugate(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)를 1：2,000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 세 번 세척 후 enhanced chemiluminescence(Amersham Pharmacia Biotech, Inc., Burkingham Shire, England) 시약으로 X-ray 필름에 감광시켜 COX-2 단백을 확인하였다.

결     과

IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현
   NCI-H292 세포를 IL-1β가 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml의 농도로 포함된 배지에서 37°C로 8시간 동안 배양하였다. IL-1β의 처리농도가 증가함에 따라 COX-2 단백질의 발현양이 증가하였다. COX-2 단백은 IL-1β의 농도가 0.02 ng/ml부터 증가하기 시작하여 20 ng/ml일 때 최고치에 도달하였다(Fig. 1). 양성 대조군으로 heat shock protein(HSP) 70을 사용하였으며 IL-1β의 농도에 관계없이 일정하였다. 이상의 결과는 저자들의 이전 연구와 일치하였다.⁶⁾ 

IL-1β에 의한 MAPK의 활성화
   IL-1β가 MAPK를 활성화시키는지의 여부를 알기 위해 IL-1β(20 ng/ml)를 투여한 후 MAPK인 ERK, p38, JNK의 인산화 정도를 시간경과에 따라 측정하였다. ERK, p38, JNK 모두 IL-1β 투여 후 인산화된 형태의 양이 증가하였고 20분에서 30분 사이에서 최대치를 나타내었다. 따라서 NCI-H292 세포에서 IL-1β는 ERK, p38, JNK를 활성화시킨다는 사실을 알 수 있었다. 양성 대조군으로 ERK2를 이용하였다(Fig. 2).

MAPK인 ERK, p38에 의한 COX-2 유전자 및 단백 조절
   IL-1β가 COX-2의 발현을 촉진하는 과정에 ERK가 관련되어 있는지의 여부를 알기 위해서 MEK/ERK 억제제인 PD98059(50 μM)를 전처치하고 IL-1β(20 ng/ml)를 처리한 후 ERK의 인산화 정도와 COX-2 유전자 및 단백을 관찰하였다. PD98059를 전처치한 세포에서는 ERK의 인산화가 억제되었고(Fig. 3A), COX-2 유전자와 단백의 발현도 감소하였다(Fig. 3B).
   IL-1β에 의한 COX-2 발현에 p38이 관계하고 있는지를 알기 위하여 p38 억제제인 SB203580(10 μM)를 전처치하고 IL-1β(20 ng/ml)를 처리한 후 p38의 인산화 정도와 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 관찰하였다. SB203580 을 전처치한 경우 p38의 인산화는 억제되었으나(Fig. 4A) COX-2 유전자와 단백의 발현은 억제하지 못하였다(Fig. 4B).

PKC에 의한 COX-2 유전자 및 단백 조절
   IL-1β에 의한 COX-2 발현과정에 PKC가 관련되어있는지를 검토하기 위해서 PKC 억제제인 Ro31-8220(20 μM)을 전처치하고 IL-1β를 처리한 후 MAPK들의 인산화 정도와 COX-2 유전자 및 단백의 정도를 알아보았다. Ro31-8220을 전처치한 세포에서는 COX-2 유전자와 단백의 발현이 억제되었다(Fig. 5B). 또한 Ro31-8220은 MAPK 중 ERK의 인산화만을 억제하였고, p38과 JNK의 인산화는 억제하지 못하였다(Fig. 5A).

Tyrosine kinase와 PI3K에 의한 COX-2 유전자 및 단백 조절
   IL-1β가 COX-2 발현을 자극하는 과정에 tyrosine kinase가 관계하고 있는지를 알아보기 위해서 tyrosine kinase 억제제인 genistein(100 μg/ml)을 전처치하고 IL-1β를 처리한 후 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 관찰하였다. Genistein을 전처치한 세포와 전처치하지 않은 세포사이에 COX-2 유전자와 단백의 발현정도의 차이는 없었다(Fig. 6).
   또한 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 PI3K의 관련여부를 검토하기 위해서 PI3K 억제제인 LY294002(25 μM)를 전처치하고 IL-1β를 처리한 후에 COX-2 유전자와 단백이 발현되는 양상을 관찰하였다. LY294002는 COX-2 유전자와 단백의 발현을 억제하지 못하였다(Fig. 7).

고     찰

   사람의 호흡기 염증반응에서 중요한 prostaglandin의 생합성에서는 COX-2의 발현이 중요한 역할을 한다.⁹⁾¹⁰⁾ 그러므로 COX-2의 발현에 이르는 신호전달체계에 관여하는 단백을 규명하는 것은 사람의 호흡기 염증반응의 발생을 억제하고 진행을 조절하는데 중요하다. 그래서 많은 연구자들이 사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현과 prostaglandin 생성 조절에 연구초점을 맞추고 있다.
   저자들은 이미 이전의 실험에서 IL-1β가 전사단계를 조절하여 COX-2 유전자와 단백을 조절한다고 보고하였다.⁶⁾ 따라서, 본 연구는 IL-1β에 의한 COX-2의 발현에 관계하는 신호전달체계를 규명하고자 일반적인 신호전달체계에 관여하는 것으로 알려진 대표적인 몇 가지 조절인자의 억제제를 사용하여 COX-2 유전자 및 단백의 발현정도를 관찰하였다. 비교적 상위 조절 인자로 생각되는 PKC, tyrosine kinase, PI3K 뿐만 아니라 MAPK(ERK, p38)의 관련여부를 알아보았다.
   IL-1β와 MAPK의 관계에 대한 지금까지 연구결과를 보면 인간의 기도 평활근에서 IL-1β투여 후 MAPK인 ERK, p38, JNK의 인산화가 증가된다고 하였고,¹¹⁾ 그 외 인체의 여러 세포에서 IL-1β가 ERK, p38, JNK의 신호전달체계를 거쳐 세포 내에 작용한다고 하였다.^12)13)14) 하지만 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현과정에 관여하는 여러 가지 신호전달물질에 대한 정확한 연구결과는 부족한 실정이며, 특히 PKC와 MAPK와의 상호 작용에 대한 연구는 부족한 실정이다.
   본 연구에서 MAPK중에서 MEK/ERK 억제제인 PD98059를 전처치한 경우에서는 COX-2 유전자 및 단백의 발현이 억제되었으나. p38 억제제인 SB203580를 전처치한 경우에서는 COX-2 유전자 및 단백의 발현에 영향이 없음을 알 수 있었다. 이는 MAPK 중에서 ERK는 COX-2의 발현에 관여하나 p38은 관여하지 않음을 나타낸다. 하지만 Newton 등¹⁵⁾은 A549 세포주를 이용한 실험에서 ERK 억제제인 PD98059와 p38 억제제인 SB203580이 PGE₂의 분비는 억제하지만 IL-1β에 의한 COX-2의 발현에는 영향을 미치지 않았다고 하여 IL-1β에 의한 COX-2 산물인 PGE₂의 분비조절은 COX-2가 직접 관여한다기 보다는 COX-2의 윗단계(upstream)에서 조절된다고 하였다. 이에 반해 본 연구에서는 MAPK 중 ERK 억제제만이 IL-1β에 의한 COX-2 유전자 및 단백의 발현을 억제하여, ERK가 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 관여하는 것을 알 수 있었다.
   Lin 등⁷⁾은 A549 세포주를 사용한 실험에서 PKC 억제제인 Go6976(3~20 μM)과 Ro31-8220(3~20 μM)을 사용한 경우 IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제된다고 하였다. NCI-H292 세포주에서 TNF-α가 COX-2 단백의 발현을 촉진한다고 보고한 Chen 등¹⁾은 PKC 억제제인 staurosporine(30 or 100 nM)을 사용한 경우에서 TNF-α에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제되었다고 하였다. 이번 실험에서는 PKC 억제제인 Ro31-8220을 전처치하고 IL-1β를 처리하였을 경우, IL-1β에 의한 COX-2 유전자 및 단백의 발현이 억제되었다. 이는 COX-2의 발현에 PKC가 신호전달체계로 관여하고 있음을 나타낸다. 또한 이때 ERK의 인산화가 억제된 것으로 보아 PKC가 ERK보다 상위 단계에서 COX-2의 발현에 관여한다는 사실도 알 수 있었다. 한편 Ro31-8220은 PKC를 억제하는 효과 이외에도 mitogen- and stress-activated protein kinase-1(MSK1)를 비롯한 다양한 protein kinase를 억제한다고 알려져 있으므로,¹⁶⁾ Ro31-8220에 의한 COX-2 억제작용이 반드시 PKC를 억제하는 것에만 의하지 않고 다른 protein kinase를 억제함으로써 나타날 가능성도 배제할 수 없을 것이다.
   본 실험에서 tyrosine kinase 억제제인 genistein은 COX-2 유전자 및 단백의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나 이러한 결과는 A549 세포주에서 tyrosine kinase 억제제인 genistein과 tyrphostin AG126을 사용한 경우 IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제된다.^7)11)17)는 것과는 상반되는 양상이었다. 이러한 상반되는 결과는 아마도 세포주의 차이이거나 처리한 억제제의 농도차이나 혹은 자극제로 사용된 사이토카인의 차이일 가능성이 있다.
   대부분 PKC보다는 상위에 존재하여 세포의 성장과 분화에 관여하는 것으로 잘 알려져 있는¹⁸⁾¹⁹⁾ PI3K의 억제제인 LY294002를 전처치한 경우에서도 IL-1β에 의한 COX-2 유전자 및 단백의 발현에 영향을 미치지 않았다.
   이상의 결과로 볼 때 배양 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백의 발현에는 PKC와 ERK가 신호전달체계에 관여하며, PKC가 ERK의 상위 단계에서 조절에 관여한다. 그러나 IL-1β에 의한 COX-2의 발현과정에서 신호전달체계에 관여하는 단백들의 특이적 억제제를 사용했을 때 COX-2 유전자 및 단백의 발현이 완전하게 억제되지는 못하였다. Phosphatidylcho-line-specific phospholipase C(PC-PLC)의 경우, Lin 등⁷⁾은 A549 세포주를 사용한 실험에서 PC-PLC 억제제인 D609를 사용한 경우 IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제된다고 하였으나, NCI-H292 세포주에서 TNF-α에 의한 COX-2 단백의 발현과정에 대한 연구에서는 D609에 의해 COX-2 단백의 발현이 억제되지 않았다.¹⁾ 또 Pype 등²⁰⁾은 인간 호흡기 평활근세포에서 IL-1β의 COX-2 유도작용에 p38과 nuclear factor(NF)-kB의 활성이 필요하다고 하였다. 그러므로 앞에서 언급된 신호전달체계 이외에 PL-PLC, NF-κB 등과 같은 다른 신호전달물질도 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 관여할 가능성이 많으므로 이에 대한 추가적인 연구도 필요할 것이다. IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백의 합성에는 여러 단계의 조절 단백이 참여하고 있으며 이러한 단백들은 특이적 억제제에 의해서 어느 정도 조절될 수 있으므로 이를 기반으로 사람의 호흡기 염증을 치유하는 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

결     론

   사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백의 발현은 PKC-MEK/ERK 신호전달체계에 의해 조절됨을 알 수 있었다.

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