교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   정상 상태에서 점액은 방어 기능을 하지만, 천식, 만성기관지염, 부비동염 혹은 비염 등과 같은 염증성 호흡기 질환에서는 점액의 분비가 과다해져서 증상이 유발된다.^1)2)3)4) 점액의 분비는 여러 가지 종류의 사이토카인이나 혹은 염증성 매개물질이 직·간접적으로 관여하며, 점액유전자에 의해 그 분비가 조절된다.
   여러 가지 종류의 사이토카인이나 염증성 매개 물질이 염증성 상기도 질환의 병인에 관여한다. 이 중 IL-1β는 급·만성 상기도 감염에서 중요한 역할을 하는 다기능의 염증성 전구사이토카인으로 천식, 기관지염이나 부비동염과 같은 호흡기 질환에 밀접한 관련이 있는 물질이다.^1)9)10) IL-1β가 상기도 상피세포에서 점액유전자의 발현 또는 점액 생성에 어떠한 영향을 미치는가는 아직까지 명확하지 않으나, 최근 Kim 등¹¹⁾이 IL-1β가 MUC2 점액유전자의 발현과 점액의 분비를 증가시킨다고 보고하였다.
   임상에서 스테로이드는 점액의 과다분비를 조절하기 위해 주로 사용되나, 점액유전자와 점액에 대한 스테로이드 효과에 대한보고는 미미하며 아래와 같은 두 가지의 상반된 보고가 있다. Kai 등¹²⁾은 NCI-H292(human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line)배양 세포에서 dexamethasone이 점액유전자의 발현을 억제한다고 하였고, Gollub 등¹³⁾은 자궁 내막의 선암에서 얻어진 Ishikawa 상피세포주를 이용하여 이와 상반되는 결과를 보고하였다. 또한 이들은 배양상피 세포에서 어떤 염증반응 등으로 발현이 증가된 점액유전자의 변화를 관찰한 것이 아니라 점액유전자의 단순 기저치(constitutive level)의 변화만을 관찰하였다.
   이에 저자들은 호흡기 상피 세포주인 NCI-H292 세포를 배양하여 IL-1β에 의해 상향 조절되는 MUC2와 MUC5AC 점액유전자 발현 및 점액 분비에 대한 budesonide의 효과를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

세포배양 및 실험 디자인
   사람 호흡기 상피세포인 human pulmonary mucoepi-dermoid carcinoma cell line(NCI-H292 cells, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 6개의 실험판에 1×10⁶ 세포의 농도로 배양하고, 95%의 공기와 5%의 이산화탄소가 가습화된 대기에서 37°C의 온도로 RPMI 1640 배지(10% fetal calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 추가)에 배양하였다. 배양이 어느 정도 이루어지면, 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고 phosphate buffered saline(PBS)에 헹구어낸 후 human recombinant IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN) 20 ng/ml을 투여하여 8시간 동안 처치하였다. 이 중 몇 개의 배양세포에는 IL-1β를 투여하기 전에 1시간 동안 bu-desonide(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 전처치하였다. Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 전체 세포의 RNA를 추출하였다. 점액 분비의 양상을 관찰하기 위하여 시험 배양세포에서 단백을 lysis buffer를 이용하여 추출한 다음 정량하고 4°C에서 보관하였다. 대조세포군은 처치하지 않았고, IL-1β은 PBS에, budesonide는 에탄올에 용해하였다. 에탄올과 다른 용매의 최종농도는 0.1% 이하로 유지하였다.

MUC2/5AC 유전자의 RT-PCR 분석
   MUC2/5AC 점액유전자의 mRNA의 측정은 변형된 RT-PCR 방법을 이용하였다.¹¹⁾¹³⁾ 요약하면, 전체 RNA는 무작위 hexanucleotide primer와 MMLV 역전사효소(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. PCR의 산물은 1% TBE 완충용매에 2% agarose gel을 통한 전기영동을 하여 사진을 찍어 관찰하였다. 띠의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다.
   MUC2 점액유전자의 primer 염기 서열은 5'-TGC CTC GCC CTG TCT TTG, 3'-CAG CTC CAG CAT GAG TGC였으며 MUC5AC 점액유전자 primer의 염기 서열은 5'-TCC GGC CTC ATC TTC TCC, 3'-ACT TGG GCA CTG GTG CTG였다.

Immunoassay를 이용한 MUC2/5AC 점액의 분석
   배양 NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·HCl , 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백을 100 μg을 96 well에 첨가하여 40°C에서 배양시켰다. 2% bovine serum albumin으로 1시간 동안 실온에서 배양한 후, PBS용액으로 세 번 씻어냈다. 1：100으로 희석한 MUC2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)또는 MUC5AC 일차항체(Neo-Markers, Inc., Fremont, CA)를 첨가하여 1시간 동안 배양시킨 후, 이차항체인 horeseradish peroxidase-goat anti-mouse IgG conjugate(1：10,000)를 첨가시켜 1시간 동안 배양시켰다. PBS로 세 번 씻은 후 3, 3, 5, 5-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색반응을 시켜서 ELISA 판독기로 450 nm에서 측정하였다.
   실험세포군에서 측정된 MUC2/5AC 점액의 양은 IL-1β를 처리하지 않은 대조세포군에서 검출된 양을 초과하는 만큼의 양을 백분율(% above control)로 나타내었다.

결     과

IL-1β에 의해 유도되는 MUC2/5AC 점액유전자 발현과 점액 분비에 있어서 budesonide의 효과
   IL-1β에 의한 MUC2/5AC mRNA 발현에 대한 budes-onide의 효과를 알아보기 위하여 NCI-H292 세포에 IL-1β(20 ng/ml)를 처치하기 1시간 전에 budesonide를 10^­12~10^­7 M 범위의 다양한 농도로 첨가하였다. 10^­9~10^­7 M 범위의 budesonide 농도에서 MUC2/5AC가 억제되는 것이 관찰되었으며, budesonide의 억제 효과는 10^­7 M에서 최대였으며 budesonide의 농도가 낮아질수록 억제효과는 약해졌다. 한편 budesonide만 투여하고 IL-1β를 처리하지 않은 경우에서는 budesonide의 첨가농도와는 관계없이 어떠한 처리도 하지 않은 대조세포군과 비슷한 정도로 mRNA가 발현되었다(Fig. 1A and B). MUC2와 MUC5AC는 유사한 결과를 나타내었으나 10^-7~10^-9 M 범위의 budesonide농도에서 mRNA가 억제되는 정도는 MUC5AC가 MUC2보다 더 큰 양상을 나타내었다. MUC2/5AC 점액단백의 발현도 budesonide에 의해 억제되었으며, 그 양상은 점액유전자의 억제 양상과 비슷하였다(Fig. 2).

Budesonide에 의한 점액유전자 및 점액의 억제에 대한 RU-486의 효과
   Budesonide에 대한 스테로이드 수용체 길항제(glucoc-orticoid receptor antagonist, RU-486, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 효과를 알아보기 위하여 NCI-H292 세포에 IL-1β(20 ng/ml)와 budesonide(10^­8 M), RU-486(10^­7 M)을 각각 단독으로 전처치한 경우, IL-1β를 투여하기 전 1시간 동안 budesonide만 처치한 경우, IL-1β투여 전 budesonide와 RU-486을 같이 처치한 세포군으로 나누어 실험하였다. RU-486과 budesonide를 같이 전처치한 경우 IL-1β에 의한 MUC2/5AC mRNA 발현이 억제되지 않았고, IL-1β만 투여한 세포군과 비슷한 정도로 발현되었다(Fig. 3A and B). 또한 조건에서 실험한 점액 분비의 양상도 같은 결과였다(Fig. 4).

고     찰

   저자는 본 실험에서 점액유전자 조절에 관한 연구에 주로 사용되는 세포인 NCI-H292 세포에서 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액 분비가 budesonide의 농도에 비례하여 억제되는 것을 관찰하였다. Budesonide에 의한 MUC2/5AC의 억제효과는 glucocorticoid 수용체 길항제인 RU-486에 의해 복원되었다.
   스테로이드는 IL-1 전사의 효과적인 억제제로 천식이나 기관지염과 같은 호흡기 염증질환의 과도한 점액 분비를 감소시키는 약제로서 사용된다.⁹⁾ 그러나 스테로이드가 점액 분비를 억제하는 기전은 아직까지 명확하지 않지만 일반적으로 스테로이드에 의한 유전자 생성의 억제 작용은 다음과 같은 기전으로 이루어진다. 먼저 스테로이드가 세포질내의 glucocorticoid receptor(GR)에 작용하여, 스테로이드/GR 복합체를 형성한 후 세포내의 핵으로 이동하여 glucocorticoid response element(GRE)에 부착하여 유전자 억제 작용을 나타낸다.^14)15)16) 그러나 이러한 스테로이드의 작용 기전이 점액유전자의 발현이나 점액 생성에도 적용되는지는 확실하지 않다. 본 실험에서는 budesonide가 IL-1β에 의한 점액 생성뿐만 아니라 MUC2/5AC 점액유전자의 발현을 억제하는데, 이것은 glucocorticoid 수용체 길항제에 의해 복원되는 것으로 보아, budesonide는 glucocorticoid receptor를 통해 점액유전자의 전사과정에 영향을 미쳐 MUC2/5AC 점액유전자의 발현을 억제하는 것으로 생각된다.
   스테로이드에 의한 점액유전자와 점액 생성의 억제 효과는 Kai 등¹²⁾과 Gollub 등⁵⁾이 서로 상반되는 결과를 보고하였다. Kai 등¹²⁾은 NCI-H292 세포에서 dexamethasone이 MUC2와 MUC5AC 점액유전자의 발현을 억제시킨다고 보고하였으나, 이들은 점액유전자의 단순 기준치(constitutive level)에 대한 보고였다. 본 연구에서는 Kai 등¹²⁾과 달리 budesonide를 전처치하여 점액유전자의 발현을 억제한 상태에서 IL-1β로 염증반응을 유도한 후 그 효과를 관찰하였다. 한편, Gollub 등⁵⁾은 Ishikawa 상피세포주를 배양하여 dexamethasone을 투여한 결과 오히려 MUC4와 MUC5AC 점액유전자가 발현이 증가된다고 보고하였다. 또한, Tanaka 등¹⁷⁾은 백서의 위점막에서 백서 MUC5AC 발현에 대한 스테로이드 효과를 알아보기 위한 in vitro, in vivo 실험에서 생리적 농도의 hydrocortisone은 간접적으로 rMUC5AC mRNA를 증가시켰으며, 대량의 hydrocortisone은 직접적으로 rMUC5AC mRNA의 발현을 억제시킨다고 보고하였다. 이와 같이 본 연구와 상기 다른 보고자와의 차이는 아마도 세포의 종류, 사이토카인의 자극여부, 스테로이드 종류와 점액유전자의 종류에 따른 차이로 해석된다.
   결론적으로 저자는 NCI-H292 세포에서 budesonide가 IL-1β에 의해 항진되는 MUC2/5AC 점액유전자와 점액단백 생성을 억제하는 것을 관찰하였으며, budesonide에 의한 점액유전자와 점액단백의 억제 효과는 glucocorticoid receptor를 경유하는 것을 알 수 있었다. 한편, 점액유전자와 점액에 대한 억제 효과의 더 정확한 기전을 밝히기 위해 정상 호흡기 상피세포를 포함한 다양한 상피세포에서 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포를 배양하여 스테로이드인 budesonide를 전처치한 경우 IL-1β에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액단백의 생성이 억제되었으며, 이것은 glucocorticoid receptor antagonist인 RU-486에 의해 복원되었다.

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