교신저자：여승근, 139-231 서울 노원구 하계 1동 280-1  을지의과대학 을지병원 이비인후과학교실
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서     론

   절식은 노화를 지연시킬 뿐만 아니라 최대 평균수명을 연장시키는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 절식이 노화와 질병에 대하여 미치는 영향을 크게 두 가지 기전으로 나누어 볼 수 있는데, 첫째는 oxygen radical의 생산을 줄여 oxygen radical에 의한 단백질, DNA와 막지질의 손상을 방지시키며, 둘째는 스트레스 단백질의 발현을 촉진시켜 질병에 대한 저항력을 증가시킨다. 그 결과 내분비계의 변화, 뼈조직의 손실, 생식기능의 퇴화, 골 근육의 약화, 중추신경계의 변화와 면역기능의 감소를 지연시킬 뿐 아니라 평균수명을 연장시키는 것으로 알려져 있는 상태이다.²⁾³⁾ 지금까지 중추 신경계와 중추신경계에서의 각종 물질에 대한 연구는 다양하게 보고되고 있으며, 말초신경계에 대한 연구는 주로 noradrenalin과 acetylcholine과 같은 고전적 신경전달물질을 대상으로 하여 왔으나 최근 면역 조직화학적 방법의 발달로 수종의 펩티드계 신경 조절물질이 발견되어 자율신경계에 대한 지식들이 많이 밝혀지게 되었다. 이와 같은 신경전달물질의 발견은 단일 신경세포에는 단일 신경물질이 존재한다는 Dale의 법칙을 반증하는 계기를 만들어 주었으며 최근에는 복수의 신경조절물질이 동일세포 내에 공존하고 있음이 알려지게 되어 자율신경연구에 획기적 발전의 계기가 되었다고 하겠다. 이러한 신경전달물질의 대부분은 단순히 신경계에서의 역할뿐만 아니라 혈류를 통하여 말초조직으로 운반되어 호르몬으로서의 기능도 갖고 있어 정보전달 물질로서 중요한 위치를 차지하고 있다. 하지만 후구에 대해선 자세한 언급이 적을 뿐 아니라 이에 대한 연구가 아직 미비한 실정이다.⁴⁾⁵⁾ 이에 저자들은 절식이라는 환경에서 후각의 전달과정에 필요한 신경전달 물질 중 cholecystokinin(CCK), tyrosine hydroxylase(TH), 그리고 neuropeptide-Y(NPY)의 분포 상태와, 변화양상을 보고자 신경전달 물질에 대한 항체를 이용하여 면역조직화학적 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

실험동물
   10주된 수컷 Sprague-Dawley계 백서 36마리를 이용하였으며, 실험동물에게 casein 20%, corn oil 15%, cellulose 10%, sucrose 5%, starch 45%, DL-methionine 0.3%, choline-Cl₂ 0.2%, AIN-76 mineral mix 3.5%, AIN-76 vitamin mix 1.0%로 조성된 정제사료를 급식하였다. 대조군은 자유 급여를 실시하여 1마리가 24 g의 정제사료를 섭취하였고, 실험군 30마리는 12 g으로 줄여서 식이 제한을 시킨 다음 6마리씩 나누어 식이 제한 3일군, 1주군, 2주군, 4주군 및 9주군으로 분류하였다.

검체 및 조직의 처리
   10주된 수컷 Sprague-Dawley계 백서를 pentobarbital sodium(60 mg/kg)으로 복강 내 주사하여 마취시킨 후 좌심실을 통하여 0.05 M 인산염완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 1분간 주입하고, 0.1 M 인산염완충액(phosphate buffer)에 녹인 4% buffered paraformaldehyde용액(4°C)을 50~60 ml/min의 속도로 10분간 관류 고정하였다. 먼저 후구를 적출 하여 두께 40 μm의 관상 절편을 얻은 후 동일한 고정 액에 담가서 16~18시간 동안 후고정을 실시한 다음 0.1 M PBS에 탄 20% sucrose용액에 2~5일간 보관하였다. Cryostat으로 40 μm 두께의 연속 동결절편을 작성하였다.

면역 조직화학법
   1차 항체로는 신경전달물질인 CCK, TH 및 NPY를 사용하였다. 1차 항체용액에서의 반응이 끝나면 조직을 PBS로 10분씩 3번 세척한 후, Vectastain-elite kit의 biotylated horse anti-mouse IgG(Vector, Burlingame, USA)를 1：200으로 희석한 2차 항체용액에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
   2차 항체용액과 반응 후, 조직을 PBS로 10분씩 3차례 세척한 후, avidin-biotin-peroxidase complex용액에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다.
   발색제로는 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride를 0.05 M Tris완충 액에 0.02%, H₂O는 0.003%로 사용하였다. 발색반응은 상온에서 3~5분간 시켰으며, 반응이 끝난 후 조직은 gelatin-coated slide에 얹어서 2시간 동안 실온에서 건조시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. 일부는 면역조직화학 염색한 조직과 각 층을 비교 관찰할 목적으로 cresyl violet염색을 시행하였다. 면역염색을 시행한 각 절편을 각 부위별로 CCK, TH 및 NPY의 면역염색성을 영상분석기(Multiscan, USA)를 이용하여 gray scale로 측정하였다. Gray scale은 흰색을 0, 검은색을 255로 정의하였으며, 염색된 조직은 그 사이의 값을 갖고, 이때는 광원의 밝기에 따라 gray scale의 값이 달라지므로 광원을 고정시킨 후 측정하였다. 측정된 광원의 밝기에 따라 염색된 전체 조직과 조직이 없는 부위를 각각 영상분석기로 측정하여 광원과 gray scale사이의 상관관계에 대한 표준곡선을 얻은 후 가장 차이가 많은 영역을 측정 광원으로 정하였다. 하지만 승모층과 내망상층은 넓이가 작아 측정에서 제외시키고 후각신경섬유층, 사구체층, 외망상층, 과립세포층, 상의하세포층만을 측정하였다.

통계분석
   통계처리는 Mann-Whitney's U-test를 시행하여 분석하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

   백서 후구의 조직학적 구조는 광학현미경하에서 후각신경섬유가 들어오는 바깥쪽부터 안쪽으로 후각신경섬유층, 사구체층, 외망상층, 승모세포층, 내망상층, 과립세포층, 상의하세포층으로 구분되었다(Fig. 1). 후구에서 CCK의 광학밀도는 대조군에 비해 절식 1주와 2주째 전 층에서 면역염색성이 의미 있게 증가하였고 4주째는 과립세포층, 사구체층, 그리고 후각신경섬유층에서만 면역염색성이 유의하게 증가하였다(Fig. 2, Table 1). TH는 절식 1주와 2주째 전 층에서 면역염색성이 의미 있게 증가하였고 4주째는 상의하세포층에서만 면역염색성이 유의하게 증가하였다(Fig. 3, Table 2). NPY는 절식 1주째 전 층에서 면역염색성이 의미 있게 증가하였고 2주째는 과립세포층, 외망상층, 그리고 사구체층에서만 면역염색성이 유의하게 증가하였다(Fig. 4, Table 3). 절식 4주 후부터 NPY의 면역염색성은 대조군과 같았으며, 절식 9주 후부터는 CCK와 TH의 면역염색성도 대조 군과 비교해 보았을 때 의미 있게 증가하지는 않았다.

고     찰

   신경전달물질은 신경원 사이에 존재하는 시냅스를 건너면서 신경원 사이의 정보교환을 매개하는 화학물질로 신경원으로부터 방출되어 시냅스를 건너서 다음 신경원의 특수부위인 시냅스 후 수용체에 의해 수용되어진다. 고전적으로 진정한 의미의 신경전달물질의 작용은 전기 생리학적으로 두 가지 범주로 나뉘는데, 첫째, 이온채널이 열려 양이온이 세포 내로 들어와 전기저항이 감소하여 탈분극이 야기되는 흥분과 둘째, 선택적인 이온의 수송에 따라 세포막저항이 감소하게 되는 억제작용이 있다. 일반적으로 신경전달물질계는 아미노산계(I형) , 아민계(II형), 펩티드계(III형)의 3가지로 분류할 수 있다.⁶⁾ 
   신경전달물질 중 각종 척추동물의 후구에 gamma aminobutyric acid(GABA), cholecystokinin(CCK), dopamine, acetylcholine, enkephalin, serotonin, neuropep-tide-Y(NPY), somatostatin, tyrosine hydroxylase(TH), gluta-mine 등이 존재한다고 밝혀지고 있다.⁷⁾⁸⁾⁹⁾ 본 연구에서는 후구에서 표현되는 여러 가지 신경전달물질 중 대표적인 CCK, TH과 NPY에 대한 면역조직화학적 연구를 시행하였다.
   CCK는 장과 뇌에 분포하며, 중추신경계에 풍부히 분포하는 신경펩티드 중 하나로 알려져 있으며, 본 연구 상 CCK는 대조군의 후구 내에서는 후각신경섬유층, 상의하세포층, 외망상층에 주로 분포함을 알 수 있었다. 또한 파킨슨병, 헌팅톤병, 정신분열증과 같은 임상적 질환뿐 아니라 섭식, 분노, 공포, 통증, 수면, 생식, 기억 등 다양한 기능에 관여한다고 알려져 있다.¹⁰⁾
   TH는 세포분열을 조절하고 중추신경계에서 행동과정과 생리과정에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. Chung 등¹¹⁾에 의하면, 사구체주위에 위치하는 TH 양성반응세포체는 직경이 7~10 μm정도이며, 사구체내부는 팽창한 혈관을 가지는 무수한 수상돌기들에 의하여 채워져 있었으며, 수상돌기의 분지 양상은 세포체에서 나온 하나의 수상돌기가 가지를 내면서 한 사구체에만 분포하거나, 세포체의 양극에서 나온 두 개의 수상돌기가 인접한 사구체내로 가지를 내고 있었고, 한 사구체 단면 당 존재하는 세포 수는 15~20개 정도였다고 보고하였다. 본 연구 상 TH는 대조군의 후구 내에서 주로 상의하세포층, 후각신경섬유층, 사구체층에 분포하고 있었다.
   NPY는 신경내분비물 분비, 혈압, 일간리듬, 생식활동을 조절하고 스트레스에 반응하며, 불안과 우울증을 조절하는 것으로 알려져 있으며, Ohm 등⁶⁾에 의하면, 세포체의 모양은 방추상 혹은 구형이고 직경은 14~16 μm정도이며, 세포체의 양극에서 기시한 굵은 수상돌기는 사구체의 기저부와 사구체 사이 지역에 주로 분포하였으며, 주행 중에 팽창한 혈관을 보이기도 하였다고 보고하였다. 본 연구 상 NPY는 대조군의 후구 내에서 주로 후각신경섬유층, 상의하세포층과 사구체층에 분포함을 알 수 있었다.⁷⁾ 
   후각 기능에 대한 정확한 기전은 아직 명확하게 밝혀져 있지는 않으나 이론적으로는 여러 가지 단계가 필요하다. 후각물질의 후점막상피까지의 도달, 후각 점막 표면의 점액층으로의 흡수, 후각상피섬모에 존재하는 후각수용기와의 결합, 결합에 따른 칼슘채널의 변화, 이에 따른 탈분극, 후구까지의 전달, 중추신경계로의 전달 등의 과정을 거쳐야 한다.¹²⁾ 이중 후구 전까지의 기전에 대해서는 다양한 연구가 되어 왔으나,¹¹⁾ 여러 후각말초신경을 모아 하나의 신경을 형성하고 있는 중추신경계의 하나인 후구의 기능을 활성화시키는 연구는 극히 미비한 상태이다. 최근 중추신경계의 노화를 지연시키거나 신경변성을 예방하는 방법으로 식이제한에 대해 관심이 많아지고 있다. 장기적으로 식이량을 요구수준 이하로 감소시키면 최고수명이 연장된다고 알려져 있으며, 또한 식이제한에 따라 노화에 따른 생리기능의 감퇴도 억제되어 칼시토닌, 부갑상선호르몬, 인슐린, 글루카곤, 에피네프린 등 내분비계의 변화, 뼈 조직 손실, 생식기능의 퇴화, 골격근육의 약화, 중추신경계의 변화, 면역기능의 감소 등이 지연된다고 보고되고 있다.¹⁾²⁾ 
   본 연구에서 절식이 후구 내 신경전달물질에 미치는 영향은 절식 1주 후 CCK, TH와 NPY 모두 전 층에서 면역염색성이 유의 있게 증가하였으며, 절식 2주 후 CCK와 TH는 전 층에서 면역염색성이 유의 있게 증가하였으나, NPY는 과립세포층, 외망상층, 사구체층에서만 유의 있는 증가를 보였다. 절식 4주 후에는 CCK가 과립세포층, 사구체층, 후각신경섬유층에서만 유의 있는 증가를 보였으며, TH는 상의하세포층에서만 유의 있는 증가를 보였다. 절식 4주 후에 NPY의 면역염색성은 대조군과 같았으며, 절식 9주 후에는 CCK와 TH의 면역염색성도 대조군과 비슷한 값을 보였다. 이상의 결과를 분석해 보면 절식은 후구 내에 존재하는 신경전달물질에 영향을 미친다고 사료되었다. 특히 절식 1주와 2주 후에 유의 있는 증가를 보이며, 4주 또는 9주 후부터는 대조 군과 다르지 않은 것으로 보아 일정시간이 지나면 후구가 절식에 적응하는 것으로 사료되며, 절식은 후구 내 각 층별로 각각 다르게 영향을 미친다고 할 수 있다. 또한 절식이라는 환경 하에서 CCK와 TH는 절식 1~4주 때 NPY는 1~2주 때에 증가되어 신경전달물질 별로도 다소 다르게 영향을 받고 있음을 알 수 있었다. 최근에 Micheal 등¹³⁾은 절식이 노인성 난청에 있어서 청각의 민감도를 증가시키며 외유모세포의 손실도 최소화시킨다고 보고하였다. 본 연구도 절식이라는 환경 하에서 쥐에서 먹이를 찾으려는 생리현상으로 후각의 민감도 증가를 위해 후구에서 신경전달물질의 분비가 증가하였으리라 생각되었지만 본 연구의 결과만으로 절식이 후각에 대한 기능과 정보분석에 대한 민감도를 향상시킨다고 단정할 수는 없었다.

결     론

   이상의 결과에서 절식이라는 환경 하에서 후구의 영역별로 CCK, TH와 NPY에 대한 신경활성이 영향을 받는 정도가 다르다는 것을 알 수 있었으며, 절식 초기에는 후구 내 신경전달물질에 영향을 미쳐 그 면역염색성이 증가 하지만 시간이 흐르면 대조군과 비슷한 값을 보여 절식이라는 환경이 지속되면 후각 내의 신경전달물질 분비도 어느 정도 환경에 적응이 되어 다시 감소함을 알 수 있었다.
   본 실험의 결과만으로 절식이 후각정보의 분석과 처리과정에 대한 민감도를 증가시키는 지에 대해서는 알 수 없었으며, 단기적이 아닌 장기적으로 신경전달물질에 어떤 영향을 미치는 지에 대한 더 많은 연구가 필요하리라 사료된다.

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