교신저자：장선오, 110-744 서울 종로구 연건동 28번지  서울대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

    살리실산은 진통을 억제하기위해 사용되어진 약제로서 오랜 세월동안 인류에게 사용되어져 왔다. 기원전 1500년 전 고대 이집트에서 진통을 억제하기 위해 살리실산을 함유한 약초를 처방한 기록이 있고 기원전 400년 전 히포크라테스도 진통을 목적으로 버드나무껍질의 가루를 사용한 적이 있다. 1829년 Leroux가 버드나무 껍질 중 진통작용을 일으키는 주된 활성물질이 살리실산이라는 것이 밝힌 이후 화학적으로 합성되어 오늘날 세계에서 가장 많이 처방되는 약제가 되었다.¹⁾ 하지만 살리실산은 위장장애나 신장기능이상, 간장애나 알러지 반응 등 여러가지 부작용을 유발시킬 수 있고 이명을 동반한 가역적 청력장애를 초래할 수 있는 이독성 물질이다. 사고에 의한 살리실산 중독에서는 물론이고 치료용량에서도 이러한 가역적인 청력장애는 일어날 수 있는 것으로 보고되어 있으며 살리실산에 의한 이명은 높은 주파수의 계속적이고 약한 소리를 특징으로 하며 개인에 따라 감수성의 차이가 있는 것으로 알려져 있다.²⁾³⁾⁴⁾ 
   살리실산의 이독성에 의한 와우의 전기생리학적 변화는 다양한 동물들에서 증명되었으며 인간에서 보이는 가역적인 청력변화와 비슷한 결과를 보여주고 있다. 살리실산에 의해 와우활동전위의 진폭 감소와 이음향반사의 감소⁵⁾가 관찰되었으며 체외실험에서 살리실산에 의한 외유모세포막 투과성의 증가⁶⁾ 등이 보고되었다. 전자현미경적인 관찰에서 외유모세포의 subsurface cisternae의 형태 변화⁷⁾와 neural degeneration⁸⁾이 관찰되었다는 보고도 있다.
   이러한 살리실산의 이독성의 기전으로 다양한 가설들이 제시되어 왔지만 가장 가능성있는 가설로는 와우혈류량의 감소로 인한 저산소 상태,⁹⁾ 외유모세포 측벽의 미세구조의 변화,⁷⁾ 그리고 외유모세포 기저부의 K＋이온에 의한 투과성의 증가⁵⁾¹⁰⁾ 등이 있고 혈류감소의 기전으로는 프로스타글란딘의 합성저해¹¹⁾와 류코트리엔 생성 증가¹²⁾¹³⁾ 등이 제시되고 있다. 그러나 혈류감소와 미세구조의 변화 또는 전기생리학적 변화를 연결시켜주는 기전은 아직 완전히 밝혀져 있지 않다.
   이 연구는 살리실산 나트륨 투여 후 기니픽의 와우혈류량 측정과 동시에 변조이음향방사를 측정함으로써 살리실산에 의한 청력역치의 저하가 혈류 감소로 인한 외유모세포의 손상 때문이라는 것을 밝혀보고자 시도하였다.

재료 및 방법

대  상
   실험동물은 이개반사 양성을 보이고 현미경상 정상 고막소견을 보이는 체중 400에서 600 g 사이의 백색 수컷 기니픽 5마리를 사용하였다.

마  취
   Ketamine(87 mg/kg)과 Xylazine(13 mg/kg)을 섞어 복강 내 주사하였고 15분간 조용한 환경에 있게 하였다. 이후 1시간마다 위 용량의 절반을 투여하면서 마취를 유지시켰다.

실험동물 준비과정
   마취를 한 기니픽의 우측 귀 주변과 머리부분, 그리고 목부위의 털을 제거하였다. 앙와위 상태에서 목 부위에 피부절개를 가하고 기관을 노출시켜 절단한 다음 가능한 최대 직경의 T-tube를 삽입하고 실로 고정하였다. 두부 고정을 위하여 양미간에 절개선을 넣은 다음 넓게 벌린 후 두개골의 골막을 거상하였다. 골 시멘트를 머리고정기와 두개골 사이에 넣어 굳게 한 다음 머리고정기를 동물고정기에 연결하였고 좌측귀가 위로가게 하여 수술적 조작을 쉽게 하는 자세로 고정하였다. 이때 Physiograph(Eagle1000, GE-Marqutte, USA)을 이용하여 혈중산소농도와 맥박의 변화를 측정하여 자세에 의한 혈중산소농도와 맥박의 변화가 최소화되도록 하였다. 체온은 직장온도를 모니터링하면서 heat pad를 이용하여 37°C로 일정하게 유지시켰다.
   기니픽의 좌측 측두골 골포를 노출시키기 위해 피부에 절개를 가하고 좌측 하악골을 바깥쪽으로 골절시킨 후 조심스럽게 골포 주변의 연부조직을 제거하였다. 이때 발생하는 출혈은 surgicell과 gelfoam을 이용하여 지혈하였다. 측두골 골포가 노출된 후 15번 수술도를 이용하여 얇게 반복해서 벗겨나갔다. 골포가 일부 열리면 작은 절골도를 이용하여 3~4 mm정도 앞뒤로 넓혀나가 앞쪽에 위치한 와우 전체가 현미경 시야에서 잘 보일 수 있게 하였다. 와우의 점막혈류에 의한 와우혈류량의 왜곡을 최소화하기 위해 작은 면봉을 이용해 조심스럽게 와우를 덮고 있는 점막을 제거하였다. 살리실산 나트륨은 300 mg/kg를 증류수에 희석하여 복강을 통해 투여하였다.

와우혈류량의 측정
   와우혈류량은 Laser Dopper flowmeter(PeriFlux 4001, Perimed AB, Sweden)을 사용하여 측정하였다. 지름 0.8 mm의 Angled steel probe(Fiber separation 0.25 mm)를 와우의 중간회전에 위치시키고 미세조작기를 이용하여 고정하였다. 와우혈류량은 보정하지 않은 임의의 tissue perfusion unit(TPU)값을 사용하였으므로 arbitrary unit(AUs)의 의미이나 편의상 TPU로 표기하였다. 살리실산 나트륨 투여 전과 투여 후 30분 그리고 1시간 간격으로 와우혈류량을 측정하였다. 5초 간격으로 1분동안 AUs 값을 샘플링하여 산술적 평균치를 구하여 와우혈류량으로 하였다.

변조이음향방사(distorsion product otoacoustic emission, DPOAE)의 측정
   변조이음향방사는 좌측 귀의 변조이음향방사청력도와 3 kHz, 4 kHz, 6 kHz, 8 kHz에서 입출력 곡선을 측정하였다. Virtual Model 330 Instrument version 1.9 for Macintosh(Virtual Corporation, Fortland, Oregon)를 이용하였고, Virtual OAE 프로브에 마이크로폰을 연결하여 측정하였다.
   입출력곡선은, f2과 f1의 주파수 비는 1.21로 설정하고 f1과 f2의 강도는 30에서 75 dB SPL로 2 dB씩 증가시켜 자극하여 얻어진 f1과 f2의 기하평균 주파수(Fe)의 진폭을 측정하였다. 이때 얻어진 변조산물의 진폭(Fdp Amp)이 소음수준(Fn Amp)보다 3 dB이상 클 때의 f1과 f2값의 진폭을 역치로 판정하였다. 변조이음향방사의 측정은 프로브의 거치에 따른 변동을 방지하기 위하여 살리실산 나트륨 투여 전후에 프로브를 빼지 않고 연속해서 측정하였다. 기니픽의 이개를 제거한 좌측 외이도에 프로브를 넣고 고무찰흙으로 감싸 밀폐함으로써 고정과 동시에 fitting이 되도록 하였다. 노출된 골포 사이로 레이저 Laser Dopper flowmeter의 Angled steel probe을 넣고 고정한 다음, 열려있는 골포를 고무찰흙을 이용하여 완전히 밀폐하여 변조이음향방사 측정시 오차를 최소화하였다.

통계처리
   결과값들은 SAS(SAS Institute U.S.A)를 이용하여 비교하였다. 살리실산 나트륨 투여 전후의 와우혈류량의 평균치와 변조이음향방사상 역치의 평균치를 주파수별로 비교하였다. 평균 와우혈류량과 변조이음향방사상 역치 평균값의 연관관계는 Spearman correlation test를 사용하였고 실험의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검증하였다.
   이 연구에 사용된 동물들은 동물 마취상의 일반적인 윤리원칙에 준하여 취급하였다.

결     과

와우혈류량의 변화
   이개 반사 양성을 보이는 5마리의 기니픽에서 와우를 노출시킨후 angled probe를 와우의 중간회전에 위치시키고 DPOAE와 동시에 측정한 와우혈류량은 살리실산 나트륨 투여 후 30분에 평균 19.2%의 혈류감소를 보이기 시작해서 1시간째 24.6%의 혈류저하를 보였으며 2시간째와 3시간째에 27.9%와 29.1%의 감소를 보였다(Table 1). 살리실산 나트륨 투여 후 1시간까지 급격한 와우혈류의 저하를 보이다 시간이 흐를수록 혈류의 저하율은 완만해지는 경향을 보였다(Fig. 1).

변조이음향방사 입출력곡선상 청력역치의 변화
   와우 골포를 노출시켰으나 Laser Dopper flowmeter의 Angled steel probe을 넣고 고무찰흙을 이용하여 완전히 밀폐시켰기 때문에 비교적 정상에 가까운 변조이음향방사값을 얻을 수 있었다. 소음이 완전히 차폐되지 않은 공간에서 실험을 시행했기 때문에 2 kHz이하에서는 높은 소음수준을 보여 측정에 의미가 없었고 3 kHz, 4 kHz, 6 kHz, 8 kHz의 입출력곡선상의 역치만을 구하였다. 살리실산 나트륨 투여 후 3 kHz, 4 kHz, 6 kHz, 8 kHz 네 개의 주파수 모두에서 청력역치의 증가를 관찰할 수 있었고 와우혈류량의 저하와 강한 상관관계를 보였다(Table 2). 와우혈류량이 살리실산 나트륨 투여 후 1시간까지 급격한 혈류의 저하를 보이다가 점차 완만한 저하를 보여주는 반면 입출력곡선상의 역치의 상승은 시간에 따라 비교적 일정하게 증가하는 양상을 나타내었다(Fig. 2).

고     찰

   아스피린같은 살리실산과 기타의 비스테로이드성 소염제는 류마티스 관절염 등의 교원성 질환에 많이 처방되는 약제로 보통의 치료 용량에서도 가역성 감각신경성 난청과 이명을 일어키는 이독성물질로 알려져 있다. 살리실산은 경구투여 후 장에서 빨리 흡수되어 약 2시간 후면 혈중농도가 최고치에 도달하고 외림프의 살리실산의 농도는 혈장의 약 1/3~1/4에 해당한다고 한다.¹⁴⁾ Day등(1989)은 혈장내의 단백질과 결합하지 않은 salicylate의 농도가 청력감소와 밀접한 관계에 있다고 하였다.¹⁵⁾
   살리실산의 이독성의 기전으로는 외유모세포 기저부의 K＋이온에 대한 투과성의 증가와 외유모세포의 측하벽 미세구조의 변화가 주목받고 있다. Stypulkowski(1990)은 살리실산 투여 후의 여러 가지 전기 생리학적 변화를 관찰하였는데 살리실산 투여 후 compound action potential(CAP)의 진폭은 감소하나 cochlear microphonic(CM)의 진폭은 증가한다는 것을 관찰하였다. 또한 two-tone distortion product, electrically evoked emission, electrophonic action potential 등도 감소한다고 보고하였고 이 모든 전기생리학적인 변화가 외유모세포 기저부의 K＋ 이온에 대한 투과성의 증가로 설명이 가능하다고 주장하였다. 또한 이러한 기전은 외유모세포에 대한 efferent system과 동일한 기전으로 중저 강도의 음에 대한 와우의 능동적 증폭기전이 소실되어 청력장애가 나타나게 된다고 하였다.⁵⁾
   미세구조의 변화로는 외유모세포의 subsurface cisternae의 형태 변화로 요약될 수 있는데 이것은 외유모세포의 electromotility의 소실과 동반된다. Dieler등(1991)은 살리실산 투여 후 subsurface cisternae의 dilatation과 vesiculation을 관찰하였고 electromotility의 가역적 소실을 보고하였다.⁷⁾ 또한 이러한 electromotility의 소실은 와우의 능동적 증폭 기전의 소실과 동반된다. Lue등(1999)은 살리실산 투여 후 외유모세포의 측벽의 stiffness가 감소되고 이는 subsurface cisternae의 변화와 관계가 있다고 보고하였다.¹⁶⁾
   최근 밝혀진 살리실산 이독성의 또다른 기전으로는 와우 혈류량 감소로 인한 허혈상태가 일부 기여를 한다는 사실이다. Didier등(1993)은 기니픽에 살리실산을 투여하고 와우혈류량(CBF)과 전기와우도를 동시에 측정하였는데 살리실산로 인하여 와우혈류량이 약 25%가 감소하며 동시에 compound action potential(CAP)의 역치도 10~25 dB 증가한다고 하였다. 그러나 살리실산과 동시에 혈관확장제인 hydralazine을 정원창에 국소투여하면 CAP역치의 상승을 의미있게 감소시킬 수 있다고 보고하였다.¹⁷⁾
   Jung등(1992)은 arachidonic acid metabolite가 살리실산 이독성과 밀접한 관계가 있다고 보고하였는데 친칠라의 정원창막에 살리실산 또는 indomedthacin을 투여한 후에 뇌간유발 청력검사의 역치의 상승과 더불어 혈관확장 물질인 6-keto-PGF1 alpha가 감소하고 혈관수축 물질인 leukotriene이 증가한다고 보고하였다.¹²⁾¹³⁾ Escoubet등(1985)도 살리실산 투여 후 와우의 측벽에서의 프로스타그란딘의 생성이 감소하고 외림프에서의 프로스타그란딘의 농도가 감소한다고 보고하였다.¹¹⁾ 그러나 Puel등(1990)은 프로스타그란딘 생성 억제제인 mefenamate나 meclofenamate의 투여에도 compound action potential의 역치의 변화가 없음으로 살리실산 이독성과 cyclooxygenase의 inhibition과는 관계가 없음을 시사하였다.¹⁸⁾ Fitzgerald등(1993)도 약한 프로스타그란딘(PG) 억제제인 bromosalicylate와 강한 PG 억제제인 indomethacin과 비슷한 효과를 보이므로 PG 생성억제 이외의 다른 기전이 존재할 것이라고 주장하였다.¹⁹⁾
   살리실산에 의한 와우혈류감소의 또 다른 기전으로는 카테콜아민의 증가를 들 수 있다. Kim등(1992)은 살리실산 투여 후 외림프에서 epinephrine이 4배 증가한다고 보고하였다.²⁰⁾ Cazal등(1988)은 카테콜아민의 길항제를 투여하면 살리실산에 의해 유발된 청력역치의 상승이 호전될 수 있다고 보고하였다.⁹⁾ 하지만 살리실산이 어떤 기전으로 카테콜아민을 상승시키는 지는 아직 밝혀지지 않았다.
   와우의 혈류감소로 인한 허혈상태와 외유모세포의 미세구조의 변화 및 청력역치의 증가를 매개하는 인자로는 유리 산소 라디칼이 유력하게 거론되고 있다. Seidman등(1991)은 anterior inferior cerebellar artery(AICA)를 15분간 압박하여 와우의 허혈상태를 유발시켜 CAP와 cochlear microphonic의 역치를 상승시켰다. 그러나 산소 라디칼 억제제인 allopurinol과 산소라디칼 제거제인 superoxide dismutase로 전처치한 동물에서는 이러한 CAP와 CM의 역치상승이 감소하는 것을 관찰하였다.²¹⁾ Seidman등(1993)은 소음성 난청에서도 부분적으로 혈관 수축이 발생하고 이에 따르는 저산소 상태에서 산소 라디칼이 생성되어 세포손상 및 난청을 유발시킬 가능성이 있다고 보고하였고 소음을 주기전에 allopurinol 또는 superoxide dismutase를 투여하면 와우를 소음에서 부분적으로 보호할 수 있다고 주장하였다.²²⁾
   이번 연구 결과에서 와우혈류량이 살리실산 나트륨 투여 후 1시간까지 급격한 혈류의 저하를 보이다가 점차 완만한 저하를 보여주는 반면 입출력곡선상의 역치의 상승은 시간에 따라 비교적 일정하게 증가하는 양상을 나타내었다는 사실은 주목할만하다. 이것은 살리실산 나트륨에 의해 먼저 와우혈류량이 줄어들고 이차적으로 산소라디칼의 생성과 같은 화학적 변화가 서서히 진행되어 일정한 역치의 상승이 있었다고 추정해볼 수 있다. 하지만 와우의 허혈성 변화에 의한 산소라디칼이 외유모세포에 영향을 미치는 것을 증명하기 위해서는 정상대조군 연구와 분자생물학 수준에서 외유모세포 손상의 기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것이다.
   이상의 연구들에서와 같이 살리실산에 의한 청력감소는 단순한 한가지 기전으로 이루어지는 것이 아니라 호르몬을 비롯한 여러가지 복합적인 요소에 의해 유발되어짐을 알 수 있다. 살리실산의 이독성을 밝히는 연구의 앞으로의 진행 방향은 살리실산 수용체와 또 이와 연관된 호르몬의 신호전달 과정을 규명하는 것으로 모아져야 한다. 살리실산 이독성의 기전이 분자생물학적으로 완전히 밝혀진다면 이는 돌발성 난청이나 소음성 난청 및 기타 허혈 상태에 의한 내이 질환의 예방 및 치료제 개발에 획기적인 발전이 올 것으로 기대된다.

결     론

   Ventral approach를 통하여 기니픽 와우를 노출시킨 후 살리실산 나트륨 300 mg/kg를 복강 투여 후 시행한 와우혈류량측정과 변조이음향방사 입출력곡선 측정을 통하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 3시간 만에 29.1%의 와우혈류량 감소를 관찰할 수 있었다. 동시에 시행한 변조이음향방사 입출력곡선에 의한 청력역치에서도 3 kHz와 4 kHz, 6 kHz, 8 kHz 등 측정가능한 모든 주파수에서 청력역치의 증가를 관찰할 수 있었다. 본 연구를 통해서 혈류감소와 동시에 변조이음향방사상 청력 역치의 증가가 일어남으로써 살리실산에 의한 이독성의 주된 기전이 혈류 감소에 의한 외유모세포의 손상성 변화 때문이라는 것을 추론할 수 있었다. 와우의 허혈성 변화가 외유모세포에 영향을 미치는 명확한 기전을 밝히기 위해서는 분자생물학 수준의 연구가 이루어져야 할 것이다.

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