교신저자：김보형, 380-704 충북 충주시 교현2동 620-5  건국대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Cisplatin은 종양세포의 증식을 억제하는 항암제로 난소 종양, 두경부 영역의 편평상피세포 종양치료제로서 널리 사용되고 있지만 정상세포에도 손상을 주는 부작용을 가지고 있다. 고농도 투여 후 발생되는 부작용으로 신독성, 말초신경병증, 저마그네슘혈증 뿐만 아니라 오심, 구토 및 이독성을 유발하는 것으로 알려지고 있다.¹⁾²⁾ 
   고농도의 cisplatin을 투여한 243명을 관찰한 연구에서, Laurell²⁾은 81%에서 각 주파수당 15 dB 이상의 청력 역치가 감소됨을 관찰하였고, 또한 이 연구에서 반수의 경우는 고주파수 영역에서만, 나머지 반수는 중주파수 영역에까지 그 청력 역치가 감소됨을 관찰하였다. Cisplatin에 의한 와우기능의 변화뿐만 아니라 그 형태학적 변화에 대한 연구에서, Tange 등³⁾은 유모세포 특히 외유모세포의 손상이 온다고 보고하였고, 혈관선조내의 퇴행성 변화가 보인다고 기술하였다. 또한 이러한 이독성 약제 및 소음성 영향에 의한 와우의 손상이 영구적인 것이냐, 일시적인 것이냐는 많은 논란의 대상이 되어 왔다.
   본 연구에서는 Cisplatin을 일정기간 치료농도로 투여한 뒤 흰쥐 와우에 어떠한 병리학적 변화가 있는지, 광학현미경 및 전자현미경을 이용하여 정상구조와 비교 관찰하였으며, 투여 후에 시간대 별로 나누어 조직학적 소견과 청력역치의 변화를 관찰하여, 손상된 와우의 조직학적 변화양상 및 회복여부에 대해 연구하고자 하였다.

대상 및 방법

실험동물
   중이감염의 증거가 없으면서 음향성 자극이나 이독성 약물에 노출된 경력이 없는, 체중이 80~100 g 정도인 생후 3주된 미성숙 흰쥐 15마리(Sprague-Dawley계)를 사용하여 실내온도 23°C, 실내습도 50%의 소음이 없는 환경에서 실험하였다. 대조군 3마리(6귀)와 Cisplatin 투여군 12마리(24귀)로 나누고, Cisplatin 1.5 mg/kg을 8일 연속 복강내 투여한 후 관찰하였다. 관찰은 투여 종료 후 1일, 4일, 10일, 20일째에 3마리씩(6귀) 희생시켜 약물 투여 후 청력변화 및 와우내 구조물의 형태학적 변화를 관찰하였다.

조직고정 및 관찰
   전신마취하에 개흉하여 심장을 노출시킨 후 인산화식염수 용액(0.1M, pH 7.4)에 용해한 4% paraformaldehyde로 심장관류를 통해 용해하였다. 측두골을 적출하고 동일 고정액으로 4°C에서 24시간 후고정 하였다. 고정된 와우를 인산완충식염수용액(0.1M, pH 7.4)으로 세척하고 10% EDTA에 3주동안 탈회한 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 와우를 와우측에 평행하게 6 μm로 절편하여 관찰하였다.
   조직관찰은 Hematoxylin & eosin을 이용하여 염색 후 광학현미경으로 관찰하였다. 기저막, 코르티기관, 나선인대, 혈관선조, 라이스너막을 중심으로 관찰하였고 대조군과 비교하였다.
   전자현미경을 이용한 관찰에서는 200 A°두께로 초박절편을 만들어 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 투과전자현미경(Joel 1200 EX, Japan)으로 관찰하였다. 주로 손상된 세포의 핵, 세포질 변화, 섬모의 변화를 중심으로 각각 광학현미경으로 비교하였던 부위를 정밀하게 관찰하였다.

청성뇌간유발반응검사(ABR)
   뇌간유발청각계기(Neuropack 8, Japan)를 사용하여 대조군의 역치를 먼저 측정하였고, 실험군은 cisplatin 1.5 mg/kg을 8일 연속 복강내 투여한 후 1, 4, 10, 20일째 1, 3, 8 kHz에서의 ABR 역치를 측정하였다. 

결     과

코르티기관
   대조군을 희생시킨 후 광학현미경을 이용하여 와우를 기저부(basal turn), 중간부(middle turn), 첨부(apical turn)로 나누어 관찰하였다. 기저부 조직소견상 기저막(basilar membrane) 상부에서 손상되지 않은 코르티기관을 관찰할 수 있었으며, 외유모세포 및 내유모세포가 관찰되었고, 나선인대(spiral ligament)의 내측으로 내림프액의 생성장소인 혈관선조(stria vascularis)가 관찰되었다. 또한 코르티기관의 위쪽으로는 덮개막(tectorial membrane)이 관찰되었다(Fig. 1). 투여 종료 후 1일째 희생시킨 실험군 3마리(6귀)의 와우에서, 광학현미경 소견상 모두 기저부 외유모세포의 손상이 관찰되었으며, 이 중 한마리(2귀)는 중간부에서도 기저부와 함께 외유모세포의 파괴가 있었다. 코르티기관의 손상은 대조군에서 잘 관찰 할 수 있었던 외유모세포가 소멸되어 관찰되지 않았다. 그 밖의 혈관선조(stria vascularis)와 덮개막(tectorial membrane) 및 기저막(basilar membrane)은 광학현미경상 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 전자현미경 소견상, 대조군에서는 원통형의 외유모세포가 첨부쪽에서 서로 망상형의 막에 의해 서로 연결되어 있고, 미토콘드리아는 소피판(cuticular plate) 바로 아래쪽으로 모여 있는 듯한 양상이며 섬모가 그 상부에서 관찰되었다. 핵은 염색질이 풍부하며 진하게 관찰되었다(Fig. 3). 투여 종료 후 4일째의 전자현미경 사진에서 유모세포는 파괴되어 형태를 관찰할 수 없었고, 주위의 지지세포(supporting cell)만이 관찰되었다. 지지세포는 전반적으로 종창(swelling)되어 있었으며, 세포질내 수포화 현상이 관찰되었다(Fig. 4).
   시간에 따른 변화의 관찰에서 투여 종료 후 4일, 10일, 20일째의 와우에서 기저부의 손상은 투여 종료 후 1일째 관찰한 결과와 유사하였다. 투여 종료 후 20일째의 현미경 소견에서 외유모세포의 손상이 관찰되었고, 지지세포 또한 세포종창의 소견이 계속되었으며 회복은 보이지 않았다(Fig. 5).

혈관선조(Stria vascularis)
   대조군에는 모세혈관 주위의 내피세포의 세포질과 핵이 잘 관찰되고 혈관선조내 중간세포의 미토콘드리아도 풍부한 양상이었다(Fig. 6). 투여 종료 후 1일째 희생된 실험군 흰쥐와우에서 전자현미경상 세포위축(atrophy) 및 공포형성(vacuolization)의 변화를 관찰할 수 있었다. 가장 심한 변화는 투여 종료 후 10일째의 개체에서 볼 수 있었다. 이 개체에서 모세혈관주위의 내피세포는 위축된 형태로 핵과 세포질을 잘 관찰할 수 없었으며 중간 세포(intermediate cell)에 공포성 변화가 관찰되었다(Fig. 7).
   4일째, 10일째, 20일째 각각 3/6, 4/6, 4/6 귀에서 비슷한 양상을 관찰할 수 있었지만, 공포형성의 정도와 혈관 내피세포의 위축 정도는 각각 달랐고, 외유모세포의 손실 정도와 혈관선조의 손상 사이에 연관성이나, 시간에 따른 손상의 체계적인 경향도 보이지 않았다.

청성뇌간유발반응검사(ABR)
   대조군의 ABR 역치는 평균 1.7±2.6 dB였다. 8일간의 Cisplatin 투여 종료 후 1, 4, 10, 20일째 청력 역치는 34.3 ±5.5, 35.5±4.8, 36.0±5.1, 37.5±5.4 dB로 상승되었다(Fig. 8).

고     찰

   항암제로 널리 쓰이는 Cisplatin은 신독성, 이독성, 말초신경장애 등의 부작용으로 인해 그 사용이 제한되어 왔으며, 전신 투여에 의한 실험동물에서의 그 효과는 잘 알려져 있다.⁴⁾⁵⁾ 이독성의 발생 및 심각성은 임상연구 마다 다양하지만 대개 양측성이면서 대칭성을 띈다고 보고되었다. 또한 용량상관관계가 있으며 영구적 고주파성 난청과 이명이 나타난다고 하였다.⁶⁾¹⁴⁾ 주로 이명이 먼저 나타나며 4000~8000 Hz이상의 고주파에서 난청이 나타나고,¹³⁾ 이러한 고주파수성 난청은 주로 기저부의 손상에서 기인된 결과일 것으로 추측된다. 이독성은 약 7%정도의 환자에서 발생하며, 대부분이 와우독성이며 미로독성은 드물다고 보고되고 있다. 발생빈도나 정도에 있어서는 연령, 다른 이독성 약제의 동반여부, 소음, 신기능의 감소, 두부의 방사선조사, 기존의 청력감소등이 영향을 미친다고 한다.
   Komune⁴⁾는 기니아 피그를 이용하여 Cisplatin을 투여 후 관찰한 와우에서 외유모세포의 특징적 파괴와 감소를 연구 발표하였고, 이는 Tange등³⁾과 Nakai등⁷⁾의 연구에서도 지지되었다. Fleischman등⁸⁾은 외유모세포의 감소가 특히 기저부에서 뚜렷하며 첨부에서는 미미하고, 내유모세포의 파괴는 많지 않았다고 하였고, Konishi등⁹⁾은 유모세포의 감소와 cochlear microphonic과 밀접한 관계가 있다고 주장하고, 기저부의 endocochlear potential이 Cisplatin 투여 후 현저히 저하되는데 비해 첨부에서는 큰 변화가 없음을 증명하였다. 그외 많은 동물연구에서는 와우의 기저부의 외유모세포들이 처음으로 손상받으며, 이 손상은 첨부와 내유모세포로 범위가 확장된다고 보고되고 있다.
   Fleischmann등⁸⁾이 Cisplatin은 외유모세포에 주로 영향을 주며 혈관선조에는 큰 영향을 주지 않는다는 주장과는 달리, Tange등³⁾은 전자 현미경을 이용하여 관찰한 기니아 피그의 와우에서 혈관선조의 변형은 점진적이며 특히 연변세포의 변형이 두드러지고, 그 변형은 세포의 수포화 및 공포형성에서 세포파괴 등으로 다양하다고 하였다. 또한 그는 혈관선조의 변형은 와우 기저부에 근접한 곳에서 특히 심한 변성을 보인다고 하였다.
   본 실험에서도 Cisplatin 투여 후 관찰한 실험동물의 외유모세포의 감소는 와우기저부에서 첨부보다 감소하여 관찰되었고, 특히 외유모세포의 형태 및 숫적 감소의 변화가 두드러졌다. 내유모세포의 감소는 어느 투여군의 관찰에서도 뚜렷하지는 않았고, 혈관선조의 변화는 두드러진 변화는 없었지만 세포의 공포성 변화와 모세혈관의 내피세포의 퇴화가 관찰되었다. 신경축삭의 관찰에서는 정상대조군과 비교하여 큰 조직학적 변화는 관찰할 수 없었다.
   이독성 약제에 의한 와우 손상 후 청력회복 및 조직재생에 관한 문제는 많은 논란이 되어 왔다. Low등¹⁰⁾은 흰쥐를 이용한 실험에서 Cisplatin 투여후 일정기간 관찰한 결과, 손상된 외유모세포의 재생의 변화는 관찰되지 않았다고 보고하였다. 하지만 Nakai등⁷⁾은 기니아 피그 실험에서 Cisplatin투여 후 일정기간이 지나면서 청력이 회복됨을 관찰하였고, Stengs등¹¹⁾은 1.5 mg/kg를 8일간 투여한 기니아 피그에서 생존기간을 달리하여 관찰한 결과 2주 정도에 기능적 회복이 있음을 보고하여 조직재생의 가능성을 시사하였으며, Cardinaal등¹²⁾은 투여 종료 후 4주 정도부터 외유모세포의 숫적 회복이 있음을 관찰하였다. 하지만 숫적 회복이 새로운 외유모세포의 발생인지, 손상된 유모세포의 회복인지는 의문점으로 남아있다.
   Aminoglycoside의 독성작용은 세포막 표면에 붙어 투과성을 변화시킴으로서 이독성을 보이는 것으로 알려져 있다. 반면 Cisplatin의 항암효과는 DNA에 비가역적으로 결합하여 구아닌 잔기(guanine residue)와 교차결합(intrastrand crosslinks)을 만들어 염기치환 변이를 일으켜 나타난다. 하지만 Cisplatin의 이독성은 항암효과와는 다른 기전으로 일어날 것이라 추측될 뿐 정확한 기전은 알려진바 없고, McAlpine등¹⁵⁾은 혈관선조의 허혈이나 유모세포의 칼슘전달통로의 폐쇄 등이 거론하였으며, Kohn¹⁶⁾은 Cisplatin에 의해 혈관선조에 높은 농도로 분포하고 있는 adenylate cyclase가 저해되어 미토콘드리아의 파괴, 소포체(endoplasmic reticulum)의 팽창, 핵의 분절화와 같은 조직학적 소견이 동물실험에서 발견된다고 하였다. 최근에는 새로운 기전으로 유리기(free radical)의 중요성이 대두되고 있다.¹⁷⁾ 본 실험에서 Cisplatin에 의해 손상된 유모세포의 재생여부가 확인되지는 않았지만 지금까지 적지 않은 기능적 회복에 대한 연구와 대조된다.
   이처럼 논쟁이 되는 Cisplatin 투여 후 와우 손상의 회복에 대한 부분은 먼저 이 약제의 이독성 기전에 대한 확실한 규명이 필요할 것으로 생각되고, 재생여부에 대한 관찰은 조금 더 정밀한 방법을 이용하여 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.

결     론

   본 연구를 통해 Cisplatin에 의한 이독성은 조직연구에서 보듯이 특히 기저부에서의 손상이 두드러지게 관찰된다. 이는 Cisplatin에 의한 이독성이 고주파성 난청을 보이는 것과 연관성을 가질 것을 추론 할 수 있다. 또한 Cisplatin에 의한 청력손상은 와우의 어느 한 부위의 손상이 아니라 코르티기관, 혈관선조의 전반적 손상에 의한 결과일 것으로 생각된다.

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